艷山姜揮發(fā)油自乳化釋藥系統(tǒng)的毒性及對(duì)Caco-2 細(xì)胞單層細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)與P-糖蛋白的影響

吳朝花，何 麗，肖 婷，陳 英，甘詩(shī)泉，沈祥春*，陶 玲*

1. 貴州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 凱里 556000

2. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 藥用植物功能與應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省天然藥用資源高效利用工程中心，貴州 貴安新區(qū) 550025

3. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 藥物藥理教研室，貴州省天然藥物藥理與可藥性高等教育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)市聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天然藥物資源優(yōu)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴安新區(qū) 550025

艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜Alpinia zerumbet(Pers.) Burtt. et Smith 的干燥成熟果實(shí)，其主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)、二萜類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)等化合物。課題組前期對(duì)艷山姜主要活性部位進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，艷山姜揮發(fā)油（essential oil ofFructusAlpiniazerumbet，EOFAZ）為主要活性部位，具有抗心肌缺氧、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降壓作用和抗心肌缺血等藥理作用[1-7]。EOFAZ 作為治療心血管疾病的潛在藥物，具有較大的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值。但EOFAZ 為油狀液體，水溶性差，易揮發(fā)，傳統(tǒng)劑型嚴(yán)重限制了其在臨床應(yīng)用的發(fā)展。

自乳化釋藥系統(tǒng)（self-emulsifying drug delivery system，SEDDS）是由油相、乳化劑和助乳化劑以及藥物組成，在胃腸道內(nèi)通過(guò)胃腸道蠕動(dòng)可自發(fā)乳化形成粒徑透明、動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的藥物傳遞系統(tǒng)[8]，其具有增加藥物表面積和溶解度，提高溶出度和滲透率，提高藥物生物利用度，因而成為提高難溶藥物溶出度和生物利用度方面的研究熱點(diǎn)[9-12]。在前期研究中，課題組將EOFAZ 成功制備成EOFAZSEDDS[13]。然而SEDDS 處方中含有大量乳化劑，乳化劑可能會(huì)刺激胃腸道[14-17]，同時(shí)乳化劑及其代謝產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)引起的生物學(xué)變化，亦對(duì)機(jī)體可能造成的毒副作用包括急性毒性、亞急性毒性、慢性毒性等[18]，另一方面，大劑量乳化劑可引起膜損傷和細(xì)胞死亡[19]，此外，乳化劑還可通過(guò)改變腸粘膜屏障通透性等來(lái)影響藥物滲透性[20]，且本研究所用乳化劑Kolliphor HS 15 的安全劑量、耐受劑量其對(duì)腸黏膜屏障通透性的影響未見(jiàn)報(bào)道。因此，對(duì)EOFAZ-SEDDS 的安全性及其對(duì)腸黏膜屏障通透性的影響進(jìn)行考察具有一定的必要性。

人結(jié)直腸腺癌Caco-2 細(xì)胞在培養(yǎng)條件下可形成完整致密的極性單細(xì)胞層，該細(xì)胞層的形態(tài)和功能類(lèi)似人體小腸上皮層。已有研究證實(shí)Caco-2 細(xì)胞保留了P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）高表達(dá)的特性，可在有代謝狀況下測(cè)定藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[21-22]，并且藥物透過(guò)Caco-2 細(xì)胞的體外過(guò)程與藥物口服后在體內(nèi)的吸收和代謝有良好的相關(guān)性[23]。因此，Caco-2 細(xì)胞是快速篩選腸吸收和細(xì)胞毒性研究的可靠且廣泛使用的體外模型。

P-gp 是由多藥耐藥基因1（multi-drug resistance gene l，MDR1）基因編碼的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）能量依賴(lài)的多藥耐藥外排泵。腸道內(nèi)的P-gp 可將其底物從腸上皮細(xì)胞泵回到腸腔而限制藥物的吸收，因此P-gp 的功能和（或）表達(dá)的變化，可能影響藥物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，導(dǎo)致其生物利用度的改變，從而影響其吸收、分布、代謝、排泄和毒性，也會(huì)影響化合物與藥物、藥物與藥物、食物與藥物、草藥與藥物、草藥與草藥的相互作用[24-26]。

本研究在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用Caco-2 細(xì)胞考察EOFAZ-SEDDS 的細(xì)胞毒性，及其對(duì)Caco-2 細(xì)胞單層通透性和P-gp 表達(dá)及功能的影響；采用KM小鼠考察EOFAZ-SEDDS 的體內(nèi)毒性，為EOFAZSEDDS 進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和合理應(yīng)用提供參考，為更好地合理利用艷山姜資源從而發(fā)揮貴州民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

SPF 級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，6～8 周齡，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（黔）2017-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（黔）2017-0001。所有小鼠均自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，室溫保持在20～23 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)No.1800459）。

Caco-2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)上海富恒細(xì)胞中心。

1.2 藥材

艷山姜購(gòu)自貴州省黔西南州貞豐縣連環(huán)鄉(xiāng)巧巖村，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)張旭副教授鑒定為艷山姜A.zerumbet(Pers.) Burtt. et Smith 的成熟果實(shí)，憑證標(biāo)本編號(hào)20150930，保存于貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物資源優(yōu)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽(yáng)）。

1.3 藥品與試劑

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A020-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；MTT（批號(hào)911L051）、羅丹明123（批號(hào)1214E051）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；P-gp 抗體（批號(hào)ab170904）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)60004-1-g）、二抗（批號(hào)SA00001-2）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司。

1.4 儀器

700-SERIES 型超低溫冰箱、3020-426 型多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；HF240型CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；CFX 型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；5810R型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；SIM-F140AY65型制冰機(jī)（日本SANYO 電子有限責(zé)任公司）；NovoCyte 流式細(xì)胞儀（艾森生物杭州有限公司）。

2 方法

2.1 艷山姜揮發(fā)油的提取制備

將艷山姜干燥果實(shí)破碎至種子破裂，按《中國(guó)藥典》2020 年版要求均勻取樣，精密稱(chēng)取500 g，加12 倍蒸餾水浸泡1 h，按《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則2204 揮發(fā)油測(cè)定法提取7 h，收集揮發(fā)油，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。艷山姜揮發(fā)油經(jīng)GC-MS 檢測(cè)，其主要化學(xué)成分為β-蒎烯、α-蒎烯、莰烯及1,8-桉葉油醇等，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為29.549%、9.861%、3.112%、0.248%[27]。

2.2 EOFAZ-SEDDS 的制備

將EOFAZ 與表面活性劑Kolliphor HS 15、乙醇以6∶2∶2 的質(zhì)量比混合，輕輕搖勻[13]。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco-2 細(xì)胞于含有完全DMEM 培養(yǎng)液（含20%熱滅活的胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素）的塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1 d 更換1 次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 混合消化液，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，放于培養(yǎng)箱中消化1 min，按1∶2 進(jìn)行細(xì)胞傳代。使用第20～40 代的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 MTT 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 設(shè)置空白組（無(wú)細(xì)胞無(wú)藥物）、對(duì)照組（無(wú)藥物），EOFAZ（24、36、48、60、72、84 μg/mL）組，EOFAZ-SEDDS 組（40、60、80、100、120、140 μg/mL，分別含24、36、48、60、72、84 μg/mL 的EOFAZ），Kolliphor HS 15＋無(wú)水乙醇組（16、24、32、40、48、56 μg/mL，相當(dāng)于EOFAZ-SEDDS 各劑量組中Kolliphor HS 15 和無(wú)水乙醇混合物含量）。分別將各組與不同培養(yǎng)天數(shù)（1、3、5 d）的Caco-2 細(xì)胞溫育，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)6 個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h。每孔加20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，孵育4 h。吸棄各孔液體，加入150 μL 二甲基亞砜，低速振搖10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm 處測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4.2 LDH 活力實(shí)驗(yàn) 設(shè)置對(duì)照組（無(wú)藥物），EOFAZ（24、36、48、60、72、84 μg/mL）組，EOFAZSEDDS 組（40、60、80、100、120、140 μg/mL），Kolliphor HS 15＋無(wú)水乙醇組（16、24、32、40、48、56 μg/mL）。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以4×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，在37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。分別將各組與Caco-2 細(xì)胞溫育24 h。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各樣品的A值。

2.5 藥物對(duì)Caco-2 細(xì)胞單層通透性的影響

2.5.1 Caco-2 單層細(xì)胞模型的建立 將 0.012 mg/mL 的鼠尾膠原蛋白加入12 孔Transwell 小室中，開(kāi)蓋在超凈工作臺(tái)中過(guò)夜晾干，或室溫放置1 h后，用PBS 洗3～4 次后直接使用。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于12 孔Transwell 培養(yǎng)板中。在12 孔Transwell 培養(yǎng)板的細(xì)胞內(nèi)側(cè)（apical，AP）每孔加入0.5 mL DMEM 完全培養(yǎng)基，基底側(cè)（basolateral，BL）每孔加入1.5 mL DMEM 培養(yǎng)基，在接種后的第1 周內(nèi)隔天更換培養(yǎng)基，1 周后每天更換培養(yǎng)基，直至第21 天，用細(xì)胞電阻儀測(cè)定Caco-2 細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻（transepithelium electrical resistant，TEER）值。

2.5.2 EOFAZ-SEDDS 對(duì)熒光黃滲透性的影響 根據(jù)MTT 和LDH 活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用培養(yǎng)基稀釋EOFAZ、EOFAZ-SEDDS、無(wú)水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物、Kolliphor HS 15、無(wú)水乙醇，得到無(wú)毒濃度的EOFAZ（24 μg/mL）、EOFAZ-SEDDS（40 μg/mL）、無(wú)水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物（16 μg/mL）、Kolliphor HS 15（8 μg/mL）、乙醇（8 μg/mL）。取建模成功的Caco-2 單層細(xì)胞模型小心吸去培養(yǎng)基，細(xì)胞單層用37 ℃的Hank’s 緩沖液洗細(xì)胞表面3 次，每次5 min，以除去殘余的培養(yǎng)基。洗滌后，AP 側(cè)分別入含受試樣品的Hank’s 緩沖液，并加入熒光黃（40 μg/mL），將1.5 mL 新鮮Hank’s緩沖液（pH 7.4、37 ℃）加到BL 側(cè)中。在15、30、45、60、120 min 從BL 側(cè)取出0.5 mL 樣品，并同時(shí)補(bǔ)充同溫同體積的空白Hank’s 緩沖液。用酶標(biāo)儀在450 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)和520 nm 的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量樣品的熒光值，并計(jì)算熒光黃滲透量。

2.6 Western blotting 考察EOFAZ-SEDDS 對(duì)P-gp蛋白表達(dá)的影響

Caco-2 細(xì)胞以4×105個(gè)/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%后分別加入環(huán)孢素A（1 μmol/L，陰性對(duì)照），維拉帕米（80 μmol/L，陽(yáng)性對(duì)照）以及不同質(zhì)量濃度的EOFAZ（6、12、24 μg/mL）、EOFAZ-SEDDS（10、20、40 μg/mL）、單一表面活性劑（2、4、8 μg/mL）、表面活性劑混合物（4、8、16 μg/mL），另設(shè)置不含藥物的對(duì)照組。溫育24 h 后，吸去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 潤(rùn)洗3次，加入細(xì)胞裂解緩沖液，置于搖床上振搖20 min，收集細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，吸取上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5%牛血清白蛋白的TBST 溶液，封閉1 h。分別加入P-gp（1∶1000）、GADPH（1∶10 000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；漂洗3 次，每次10 min，加入二抗（1∶7000），孵育2 h，TBST 洗滌3次，使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，然后將膜置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，隨后用Image-Lab 軟件對(duì)數(shù)字圖像進(jìn)行量化。

2.7 羅丹明123 攝取法考察EOFAZ-SEDDS 對(duì)P-gp 功能的影響

精密稱(chēng)取0.2 mg 羅丹明123，用超純水配成質(zhì)量濃度為500 μmol/L 的羅丹明123 溶液。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞用胰酶消化，用含20%胎牛血清的DMEM 重懸為單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，4 ℃、1500 r/min 離心5 min，棄去上清，用PBS 分散成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，取0.5 mL 至1.5 mL EP 管中，1500 r/min 離心5 min，棄上清，分別加入0.5 mL 維拉帕米（50 μmol/L，陽(yáng)性對(duì)照）以及不同質(zhì)量濃度的EOFAZ（6、12、24 μg/mL）、EOFAZSEDDS（10、20、40 μg/mL）、單一表面活性劑（2、4、8 μg/mL）、表面活性劑混合物（4、8、16 μg/mL），另設(shè)置不含藥物的對(duì)照組。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)60 min，置冰上終止轉(zhuǎn)運(yùn)，4 ℃、2500 r/min 離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，離心后棄上清。加入羅丹明123，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)60 min，置冰上終止作用，4 ℃、2500 r/min 離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，離心后棄上清，加入0.5 mL PBS 輕輕吹打，制成單個(gè)細(xì)胞懸液（1×104個(gè)細(xì)胞）。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定檢測(cè)胞內(nèi)羅丹明123 平均熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm）。

2.8 EOFAZ-SEDDS 的小鼠急性毒性試驗(yàn)

2.8.1 最高致死量和最低致死量的試驗(yàn)研究 預(yù)試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱苏页鲆饎?dòng)物L(fēng)D0和100%（LD100）死亡的劑量，以便安排正式實(shí)驗(yàn)。取小鼠20 只，體重18～22 g，每個(gè)試驗(yàn)組4 只動(dòng)物，雌雄各半，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)[28]。給藥前小鼠禁食不禁水過(guò)夜，一次性口服不同劑量的EOFAZ-SEDDS，測(cè)定最大耐受劑量（LD0）、絕對(duì)致死量（LD100）。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠口服制劑的LD0和LD100分別為4 g/kg 和7 g/kg，組間劑量比為1∶1.150 1。

2.8.2 小鼠急性毒性試驗(yàn)研究 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)獲得的最高致死量和最低致死量對(duì)正式試驗(yàn)進(jìn)行分組，共5 組，每組試驗(yàn)動(dòng)物10 只，雌雄各半。給藥最高劑量為7 g/kg，給藥前小鼠禁食不禁水過(guò)夜，給藥后立刻觀察小鼠的外觀體征、飲食欲、行為活動(dòng)、大小便、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、呼吸系統(tǒng)等情況，死亡情況，給藥后連續(xù)觀察14 d。對(duì)在試驗(yàn)中死亡的動(dòng)物以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死的動(dòng)物進(jìn)行解剖，對(duì)組織器官出現(xiàn)的體積、顏色等改變進(jìn)行詳細(xì)記錄。根據(jù)每組藥物各劑量動(dòng)物的死亡數(shù)，用。按Bliss 機(jī)率單位法計(jì)算半數(shù)致死劑量（median lethal dose，LD50）及其95%可信限評(píng)估EOFZA-SEDDS 制劑對(duì)小鼠的急性毒性。給藥后逐日觀察并記錄中毒反應(yīng)、死亡率和死亡情況。給藥后連續(xù)觀察14 d。對(duì)在試驗(yàn)中死亡的動(dòng)物以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死的動(dòng)物進(jìn)行解剖，對(duì)組織器官出現(xiàn)的體積、顏色等改變進(jìn)行詳細(xì)記錄。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

3.1.1 MTT 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 如圖1 所示，與對(duì)照組比較，無(wú)水乙醇與Kolliphor HS 15 混合物在16～56 μg/mL（相當(dāng)于60～140 μg/mL 的EOFAZ-SEDDS中所含混合乳化劑的量）對(duì)培養(yǎng)5 d Caco-2 細(xì)胞存活率沒(méi)有影響，但顯著增加培養(yǎng)1、3 d 的Caco-2 細(xì)胞存活率（P＜0.05、0.01）。與EOFAZ 組比較，EOFAZ-SEDDS 處理培養(yǎng)1、3、5 d 的Caco-2 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞存活率均顯著升高（P＜0.05、0.01），表明 EOFAZ 的細(xì)胞毒性比含有等量 EOFAZ 的SEDDS 的細(xì)胞毒性大，說(shuō)明將EOFAZ 制備成SEDDS 后降低了EOFAZ 的細(xì)胞毒性，乳化劑混合物對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響。

圖1 EOFAZ-SEDDS 對(duì)培養(yǎng)1 (A)、3 (B)、5 d (C) 的Caco-2 細(xì)胞活力的影響 (±s, n = 3)Fig. 1 Effect of EOFAZ-SEDDS on cell viability of Caco-2 cells cultured for 1 (A), 3 (B), 5 d (C) (±s, n = 3)

3.1.2 LDH 活力實(shí)驗(yàn) 如圖2 所示，與對(duì)照組比較，EOFAZ（24～84 μg/mL）、EOFAZ-SEDDS（60～140 μg/mL）、乳化劑混合物（48～56 μg/mL）顯著升高細(xì)胞LDH 外漏率（P＜0.05、0.01）。與EOFAZ組比較，EOFAZ-SEDDS（60～140 μg/mL）組LDH外漏率顯著降低（P＜0.05、0.01）；與EOFAZ-SEDDS組比較，乳化劑混合物（24～56 μg/mL）組LDH 外漏率顯著降低（P＜0.05、0.01）。表明高濃度乳化劑混合物可損傷細(xì)胞膜，將EOFAZ 制備成EOFAZSEDDS 降低了EOFAZ 的細(xì)胞毒性。

圖2 EOFAZ-SEDDS 對(duì)Caco-2 細(xì)胞LDH 外漏率的影響 (±s, n = 3)Fig. 2 Effect of EOFAZ-SEDDS on leakage rate of LDH in Caco-2 cells (±s, n = 3)

3.2 藥物對(duì)Caco-2 細(xì)胞單層通透性的影響

3.2.1 Caco-2 單層細(xì)胞模型的建立 培養(yǎng)21 d 后Caco-2 細(xì)胞的TEER 值＞1000 Ω·cm2，細(xì)胞單層膜的AP 側(cè)和BL 側(cè)培養(yǎng)基中堿性磷酸酶的活力比大于3∶1，熒光黃由細(xì)胞膜單層AP 側(cè)的表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient，Papp）值為（3.57±1.75）×10-7cm/s，說(shuō)明細(xì)胞單層的緊密性良好，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

3.2.2 EOFAZ-SEDDS 對(duì)熒光黃滲透性的影響 如圖3 所示，EOFAZ、EOFAZ-SEDDS、無(wú)水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物、Kolliphor HS 15 和無(wú)水乙醇可以影響細(xì)胞旁通透性，進(jìn)而影響腸吸收。

圖3 藥物對(duì)Caco-2 單層的熒光黃滲透性的影響 (±s,n = 3)Fig. 3 Effect of samples on Lucifer yellow permeability of Caco-2 monolayer (±s, n = 3)

3.3 Western blotting 考察EOFAZ-SEDDS 對(duì)P-gp蛋白表達(dá)的影響

如圖4 所示，與對(duì)照組比較，EOFAZ（12、24 μg/mL）組Caco-2 細(xì)胞中P-gp 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），EOFAZ-SEDDS（10、20、40 μg/mL）組、Kolliphor HS 15（8 μg/mL）組、無(wú)水乙醇（2、4、8 μg/mL）組、Kolliphor HS 15＋無(wú)水乙醇混合物（8 μg/mL）組P-gp 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。表明EOFAZ 可抑制P-gp 的表達(dá)，而EOFAZSEDDS、Kolliphor HS 15、無(wú)水乙醇、Kolliphor HS 15 和無(wú)水乙醇混合物均可誘導(dǎo)P-gp 的表達(dá)。

圖4 EOFAZ-SEDDS 對(duì)P-gp 蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig. 4 Effect of EOFAZ-SEDDS on P-gp protein expression (±s, n = 3)

3.4 羅丹明123 攝取法考察EOFAZ-SEDDS 對(duì)P-gp 功能的影響

如圖5 所示，與對(duì)照組比較，EOFAZ（6、12、24 μg/mL）組、EOFAZ-SEDDS（40 μg/mL）組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.05），Kolliphor HS 15、無(wú)水乙醇、Kolliphor HS 15＋無(wú)水乙醇混合物在所考察濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)作用與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。表明EOFAZ 和高劑量的EOFAZ-SEDDS 均對(duì)P-gp 外排功能具有抑制作用，低、中劑量的EOFAZSEDDS、Kolliphor HS 15 與無(wú)水乙醇混合物、單獨(dú)Kolliphor HS 15 和無(wú)水乙醇對(duì)P-gp 外排功能沒(méi)有影響。

圖5 EOFAZ-SEDDS 對(duì)P-gp 功能的影響 (±s, n = 3)Fig. 5 Effect of EOFAZ-SEDDS on P-gp function (±s, n = 3)

3.5 EOFAZ-SEDDS 的小鼠急性毒性試驗(yàn)

小鼠口服EOFAZ-SEDDS 制劑正式試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠口服制劑的LD50為5.291 5 g/kg，LD50的95%可信限為4.927 8～5.682 1 g/kg（表1）。在小鼠口服EOFAZ-SEDDS 制劑給藥后，出現(xiàn)自主活動(dòng)、探究、梳理、運(yùn)動(dòng)減少，同時(shí)出現(xiàn)嗜睡、僵住、強(qiáng)直性驚厥、震顫、俯臥、共濟(jì)失調(diào)、呼吸急促、呼吸困難、呼吸暫停、飲食欲下降、水樣便、尿失禁、流淚等癥狀，但停藥后恢復(fù)正常。將死亡后小鼠剖檢可見(jiàn)心、肝、脾、肺、腎的體積和顏色未發(fā)現(xiàn)任何異常改變。

表1 EOFAZ-SEDDS 對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Acute toxicity test results of EOFAZ-SEDDS in mice

4 討論

Caco-2 細(xì)胞廣泛用作研究藥物腸道滲透和評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的體外模型，但在報(bào)道的細(xì)胞培養(yǎng)方案中仍存在相當(dāng)大的差異。關(guān)鍵細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)的變化如培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間，對(duì)Caco-2 細(xì)胞群的形態(tài)和功能特性有直接影響[29-30]。對(duì)于在細(xì)胞毒性和滲透試驗(yàn)中使用的細(xì)胞的成熟度也沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。Bu 等[31]證明具有不同融合度和成熟度的Caco-2 細(xì)胞對(duì)相同的藥物表現(xiàn)出不同的敏感性。故在本研究MTT 實(shí)驗(yàn)中建立了一系列具有相同初始接種密度但不同培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間的Caco-2 細(xì)胞。結(jié)果表明EOFAZ 處理培養(yǎng)不同天數(shù)的Caco-2 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞存活率均顯著低于EOFAZ-SEDDS。與EOFAZ 相比，Caco-2 細(xì)胞對(duì)EOFAZ-SEDDS 產(chǎn)生顯著耐受性，推測(cè)可能是由于EOFAZ 留在胃腸道中形成的微乳液的乳滴中，從而限制其與腸細(xì)胞膜的接觸，從而降低其細(xì)胞毒性。MTT 結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，16～56 μg/mL表面活性劑對(duì)Caco-2 細(xì)胞沒(méi)有顯示出任何毒性作用；而LDH 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，48～56 μg/mL 表面活性劑對(duì)細(xì)胞的毒性具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。導(dǎo)致MTT 和LDH 測(cè)定結(jié)果差異的原因可能是兩者測(cè)定原理不同所致。

LDH 滲漏是細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞毒性研究的經(jīng)典生物標(biāo)志物，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)，發(fā)生細(xì)胞凋亡或壞死而造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LDH 釋放到培養(yǎng)液中，因此LDH法通過(guò)檢測(cè)從細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH 的活性，對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行定量分析[32]。MTT 檢測(cè)原理主要基于在線粒體中MTT 的酶促轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與存活細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。Sambuy 等[33]證明表面活性劑的細(xì)胞毒性機(jī)制不是線粒體呼吸的抑制，而是通過(guò)影響膜完整性導(dǎo)致膜組分的溶解，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。因此本研究LDH 結(jié)果顯示乳化劑混合物可損傷細(xì)胞膜，而MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示乳化劑混合物對(duì)細(xì)胞線粒體沒(méi)有影響。

本研采用Caco-2 細(xì)胞單層模型考察EOFAZ、EOFAZ-SEDDS、Kolliphor HS 15、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物對(duì)細(xì)胞旁通透性的影響，結(jié)果表明，EOFAZ、EOFAZ-SEDDS、無(wú)水乙醇和Kolliphor HS 15 混合物、單獨(dú)的Kolliphor HS 15和無(wú)水乙醇均可顯著增加細(xì)胞旁通透性。而用于熒光黃滲透性實(shí)驗(yàn)的EOFAZ、賦形劑或SEDDS 的濃度均為安全濃度，表明EOFAZ、賦形劑或SEDDS的滲透增強(qiáng)作用可能不是由細(xì)胞毒性引起的，即EOFAZ、賦形劑、SEDDS 改變細(xì)胞單層屏障功能可能是由于損傷細(xì)胞間緊密連接所致。已有研究表明乙醇作用后腸上皮屏障通透性增加達(dá)到峰值后又逐漸恢復(fù)，乙醇是通過(guò)短暫性破壞細(xì)胞緊密連接的完整性進(jìn)而增加腸上皮屏障通透性[34]。然而對(duì)于EOFAZ、Kolliphor HS 15 或SEDDS 的滲透增強(qiáng)作用是否可逆有待進(jìn)一步研究。因此，當(dāng)EOFAZ、EOFAZ-SEDDS 與被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物（如阿昔莫司）聯(lián)合用藥時(shí)，可能會(huì)增加被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的生物利用度。

本研究使用Caco-2 單層作為小腸模型評(píng)估了EOFAZ、EOFAZ-SEDDS 或賦形劑對(duì)腸P-gp 表達(dá)和功能的影響。結(jié)果表明EOFAZ 可抑制P-gp 的功能和表達(dá)，EOFAZ-SEDDS 誘導(dǎo)P-gp 的表達(dá)，低、中劑量的EOFAZ-SEDDS 對(duì)P-gp 的功能沒(méi)有影響，只有高劑量的EOFAZ-SEDDS 抑制P-gp 外排功能；乳化劑雖然誘導(dǎo)了P-gp 的表達(dá)但對(duì)其功能沒(méi)有影響。由此可見(jiàn)，在一定的濃度范圍內(nèi)EOFAZ-SEDDS雖然誘導(dǎo)了P-gp 的表達(dá)但其外排功能并沒(méi)有增加，這可能與Caco-2 細(xì)胞表面新近表達(dá)的P-gp 功能缺失有關(guān)，研究表明新表達(dá)的P-gp 需要大約10 d 的時(shí)間才能發(fā)揮其全部功能[35]。另一方面可能是因?yàn)镋OFAZ 停留在形成的微乳液的乳滴中，因此減弱了EOFAZ 對(duì)P-gp 功能的抑制作用，當(dāng)濃度較高時(shí)，乳液中游離的EOFAZ 達(dá)到一定濃度才發(fā)揮了其對(duì)P-gp 功能的抑制作用。因此EOFAZ 或較大劑量的EOFAZ-SEDDS 抑制P-gp 的功能增強(qiáng)P-gp 底物的口服吸收，長(zhǎng)期應(yīng)用EOFAZ 或較大劑量的EOFAZSEDDS 可能通過(guò)抑制腸道以及其他器官P-gp 的功能而降低P-gp 的活性，改變其他P-gp 底物的生物利用度。

小鼠口服EOFAZ-SEDDS 制劑正式試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)EOFAZ-SEDDS 對(duì)小鼠實(shí)際無(wú)毒。在急性毒性實(shí)驗(yàn)中，受試物的給藥容量受試驗(yàn)動(dòng)物胃的內(nèi)容物的影響，若給藥途徑為口服給藥，小鼠和大鼠在給藥前須禁食，可自由飲水。嚙齒動(dòng)物禁食時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響藥物代謝酶的活性以及受試物在腸道中的吸收，所以小鼠和大鼠在給藥前須嚴(yán)格禁食12 h，給藥時(shí)間最好在上午。在口服藥品的急性毒性試驗(yàn)中，給藥體積也會(huì)影響受試藥物的吸收，從而影響動(dòng)物死亡率，故本研究選擇適宜的給藥體積，使每只動(dòng)物在給藥容量上相等。

綜上，EOFAZ-SEDDS 對(duì)小鼠實(shí)際無(wú)毒，此外制備所得的EOFAZ-SEDDS 可以降低EOFAZ 的細(xì)胞毒性，但改變Caco-2 細(xì)胞單層屏障功能，同時(shí)誘導(dǎo)P-gp 表達(dá)，在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)P-gp 功能沒(méi)有影響。本研究有待于進(jìn)一步觀察EOFAZ-SEDDS 作用后，P-gp 表達(dá)程度與其活性之間的相關(guān)性是否與Caco-2 細(xì)胞表面新近表達(dá)的P-gp 功能缺失有關(guān)，以為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)性參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突