基于多途徑聯(lián)合效應(yīng)的甘草防治膿毒血癥活性成分篩選及作用機(jī)制研究

梁龍?chǎng)?，任璐彤，劉婷婷，?源，徐 廣，肖小河*，柏兆方

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004

2. 解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心 肝病醫(yī)學(xué)部，北京 100039

3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 藥學(xué)處，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

4. 遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（遵義市第一人民醫(yī)院），貴州 遵義 563002

5. 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069

甘草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，味甘性平，具有清熱解毒、補(bǔ)氣益脾、祛痰、止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效，常用于臨床，且素有“十方九草”之稱[1]。此外，甘草作為我國傳統(tǒng)的藥食兩用類中藥，廣泛應(yīng)用于食品、保健品等多個(gè)領(lǐng)域?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草具有保肝、抗炎[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]、抗纖維化[5]、抗腫瘤[6]等多種藥理活性，目前已被開發(fā)為復(fù)方甘草片、甘草酸二銨膠囊等多種中成藥制劑。

膿毒血癥是一種感染性的炎癥反應(yīng)綜合征，可導(dǎo)致多種器官功能性障礙，具有發(fā)病率高、病死率高等特點(diǎn)[7]，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等系列機(jī)體反應(yīng)，現(xiàn)階段雖然常規(guī)用藥如廣譜抗菌類藥物、糖皮質(zhì)激素等，均可起到良好的治療效果，但臨床應(yīng)用中往往存在一定的局限性，如抗生素在明確感染細(xì)菌種類的早期膿毒血癥的防治中可發(fā)揮較好的治療效果，但長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性[8]；大劑量、短療程的糖皮質(zhì)激素治療方案可能引起繼發(fā)性感染[9]。膿毒血癥發(fā)病迅速，病情兇險(xiǎn)，臨床亟需針對(duì)膿毒血癥發(fā)病傳變特點(diǎn)的藥物以實(shí)現(xiàn)臨床藥物的精準(zhǔn)用藥。

甘草及其成分具有調(diào)節(jié)促炎及抗炎細(xì)胞因子水平、提高免疫細(xì)胞活性等免疫調(diào)節(jié)作用[10-17]。課題組基于前期工作基礎(chǔ)，針對(duì)甘草展開了系列免疫活性研究[18-21]。本研究發(fā)現(xiàn)刺甘草查耳酮、甘草酸是甘草中較強(qiáng)的抗炎、抗氧化的活性成分，多種成分在體內(nèi)通過調(diào)節(jié)多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生多個(gè)效應(yīng)從而起到治療疾病的作用，并對(duì)比研究了二者聯(lián)合用藥在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的膿毒血癥模型中的作用效果，以期初步闡明甘草活性成分協(xié)同抗膿毒血癥的藥效特征，為甘草相關(guān)制劑的新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 WT 雌性小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度21～24 ℃，12 h 光暗循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心批準(zhǔn)，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)為IACUC-2021-0012。

1.2 藥品與試劑

甘草苷、甘草素、甘草次酸、芹糖異甘草苷、芒柄花苷、光甘草定、刺甘草查耳酮、甘草酸、H2DCFDA探針、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體抑制劑MCC950（批號(hào)分別為HY-N0376、HY-N0377、HYN0180、HY-N2497、HY-N0270、HY-N0393、HY-N0269、HY-N0184、HY-D0940、HY-P7085、HY-12815A）均購自美國MedChemExpress 公司，化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%；異甘草苷、甘草酸單銨（批號(hào)分別為T5S0331、T6384，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）購自TargetMol 公司；甘草提取物（批號(hào)DST20220215）購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM 培養(yǎng)基（批號(hào)分別為11965092、C0232、2427634）均購自美國Gibco 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、PBS（批號(hào)分別為QN0746、SNM249）購自北京百奧萊博科技有限公司；Lamin B 抗體（批號(hào)17416）購自美國CST 公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）抗體（批號(hào)AG-20B-004）購自安諾倫（北京）生物科技有限公司；Ly-6G/Ly-6C 抗體、F4/80 抗體、CD11b 抗體（批號(hào)分別為108407、123108、101212）均購自Biolegend 公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)（NBT 法）試劑盒（批號(hào)S0109）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)（CCK-8 法）試劑盒（批號(hào)ck04-500T）購自上海同仁藥業(yè)股份有限公司；IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為1210602、1217202）購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；LPS、尼日利亞菌素、H2O2（批號(hào)分別為L(zhǎng)2880、N7143、323381）購自美國Sigma-Aldrich 公司；抗小鼠IgG 二抗（批號(hào)115-035-003）購自美國Jackson Immuno Research 公司。

1.3 儀器

HERAcell VIOS 160i 型CO2培養(yǎng)箱、TGL-18M型低溫高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；SpectraMax iD5 型酶標(biāo)儀（美國Promega 公司）；PowerPac HC 型電泳儀、Trans-Blot 型轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad 公司）；FACSCantoTMII 型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）。

2 方法

2.1 小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）的制備及培養(yǎng)

小鼠經(jīng)乙醚麻醉后脫頸處死，使用75%乙醇浸泡消毒30 min，無菌操作臺(tái)中分離小鼠脛骨，用37 ℃預(yù)熱的DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）沖洗骨髓腔，使脛骨內(nèi)容物均被沖出，收集混合液，加入50 ng/mL M-CSF，吹打混勻，放入培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d 后，得到BMDM 細(xì)胞。

2.2 NLRP3 炎癥小體激活模型篩選甘草中10 種活性成分

2.2.1 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞上清液中Caspase-1 p20 及細(xì)胞裂解液中 Caspase-1 p45 蛋白表達(dá)BMDM 以1×106個(gè)/mL 接種于12 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，更換為含50 μg/L LPS 的培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)4 h。棄上清，分別加入含40 μmol/L甘草苷、甘草素、異甘草苷、甘草次酸、芹糖異甘草苷、甘草酸單銨、芒柄花苷、光甘草定、刺甘草查耳酮、甘草酸的培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)1 h，加入NLRP3炎癥小體激活劑尼日利亞菌素（7.5 μmol/L）刺激30 min，另設(shè)置不含藥物的對(duì)照組，收集細(xì)胞及上清液。細(xì)胞上清液加入1/4 體積的三氯乙酸，于-20 ℃儲(chǔ)存2 h 以上，待蛋白沉淀后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入冰丙酮以清洗蛋白。棄去丙酮，加入1×Loading Buffer，混勻后制成上清蛋白樣品。細(xì)胞加入裂解液提取蛋白，加入1×Loading Buffer，金屬浴煮沸15 min 使蛋白變性，得到細(xì)胞裂解蛋白樣品。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后加入一抗孵育，洗滌后加入二抗孵育，顯影[22]。

2.2.2 細(xì)胞上清液中IL-1β 水平檢測(cè) 按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β 水平。

2.3 體外氧化應(yīng)激模型篩選甘草中10 種活性成分

2.3.1 CCK-8 法檢測(cè) H2O2對(duì)細(xì)胞活性的影響B(tài)MDM 以1×106個(gè)/mL 接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，分別加入0、50、100、200、400、600、800、1000 μmol/L 的H2O2，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。棄去上清液，避光加入CCK-8 試劑，孵育30 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A）值。

2.3.2 ROS 水平的檢測(cè) BMDM 以1.2×106個(gè)/mL接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，分別加入含40 μmol/L 甘草苷、甘草素、異甘草苷、甘草次酸、芹糖異甘草苷、甘草酸單銨、芒柄花苷、光甘草定、刺甘草查耳酮、甘草酸的培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)1 h 后，加入200 μmol/L H2O2培養(yǎng)16 h，另設(shè)置不含藥物的對(duì)照組，清洗細(xì)胞，后加入H2DCFDA 探針，避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS 水平。

2.4 CCK-8 檢測(cè)刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.4.1 刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì)BMDM 活性的影響 BMDM 以1×106個(gè)/mL 接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，分別加入0、31.25、62.5、125、250、500、1000 μmol/L 甘草酸或0、5、10、20、40、60、80 μmol/L 刺甘草查耳酮，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24 h，檢測(cè)A值。

2.4.2 刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì) H2O2刺激的BMDM 活性的影響 BMDM 以1×106個(gè)/mL 接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，分別加入200 μmol/L 甘草酸或40 μmol/L 刺甘草查耳酮，恒溫培養(yǎng)1 h 后，加入400 μmol/L H2O2培養(yǎng)12 h，檢測(cè)A值。

2.5 刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì)細(xì)胞SOD 活性的影響

BMDM 以1.2×106個(gè)/mL 接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，分別加入200 μmol/L甘草酸或40 μmol/L 刺甘草查耳酮，再加入400、600 μmol/L H2O2誘導(dǎo)氧化損傷，刺激12 h，按試劑盒說明書檢測(cè)SOD 活性。

2.6 Western blotting 檢測(cè)刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì)細(xì)胞上清液中Caspase-1 p20 及細(xì)胞裂解液中Caspase-1 p45 蛋白表達(dá)的影響

BMDM 以1×106個(gè)/mL 接種于12 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁完全后，更換為含50 μg/L LPS的培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)4 h。棄上清，分別加入含25、50、100、200 μmol/L 甘草酸或5、10、20、40 μmol/L刺甘草查耳酮的培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)1 h，加入7.5 μmol/L 尼日利亞菌素刺激30 min，另設(shè)置不含藥物的對(duì)照組，收集細(xì)胞及上清液。采用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞上清液中Caspase-1 p20 及細(xì)胞裂解液中Caspase-1 p45 蛋白表達(dá)。

2.7 ELISA 檢測(cè)刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì)細(xì)胞上清液中IL-1β 水平的影響

取“2.6”項(xiàng)下細(xì)胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β 水平。

2.8 刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒血癥致死模型小鼠生存率的影響

基于課題組前期研究[18]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將甘草酸與刺甘草查耳酮的基礎(chǔ)給藥劑量均設(shè)置為20 mg/kg。MCC950 作為NLRP3 炎癥小體的抑制劑，可以延長(zhǎng)LPS 誘導(dǎo)的膿毒血癥小鼠的存活率[23-24]，本實(shí)驗(yàn)將其作為陽性對(duì)照藥，并根據(jù)課題組前期對(duì)炎癥小體抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[18-19]，MCC950 劑量為40 mg/kg。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為模型組，甘草酸低、高劑量（20、40 mg/kg）組，刺甘草查耳酮低、高劑量（20、40 mg/kg）組，甘草酸（20 mg/kg）-刺甘草查耳酮（20 mg/kg）組和MCC950（40 mg/kg）組，每組12 只。造模前小鼠禁食8 h，各給藥組ip 相應(yīng)藥物，模型組ip 等體積的含5%DMSO 和5%聚山梨酯-80 的生理鹽水溶液，預(yù)給藥1 h 后，小鼠ip LPS（20 mg/kg）誘導(dǎo)膿毒性休克，持續(xù)觀察小鼠死亡情況，每2 小時(shí)記錄小鼠死亡只數(shù)，繪制生存率曲線。

2.9 刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒血癥小鼠模型炎癥因子水平的影響

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、MCC950（40 mg/kg）組、甘草提取物（1.3 g/kg）[25]組、刺甘草查耳酮（20 mg/kg）組、甘草酸（20 mg/kg）組和甘草酸（20 mg/kg）-刺甘草查耳酮（20 mg/kg）組，每組8 只。造模前小鼠禁食8 h，各給藥組ig 甘草提取物或ip MCC950、刺甘草查耳酮、甘草酸，對(duì)照組和模型組ig 生理鹽水或ip 含5% DMSO 和5%聚山梨酯-80 的生理鹽水溶液，預(yù)給藥1 h 后，造模小鼠ip LPS（20 mg/kg），對(duì)照組小鼠ip 等體積的生理鹽水，3 h 后取材，收集腹腔灌洗液以及眼眶血。采用頸椎脫臼法處死小鼠，將在冰浴中預(yù)冷的PBS 注入小鼠腹腔內(nèi)，輕揉小鼠腹部2 min，隨后取出腹腔內(nèi)的PBS，得到腹腔灌洗液。將腹腔灌洗液分出部分用于ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-1β 和TNF-α，其余用于提取滲出細(xì)胞。滲出細(xì)胞使用F4/80 抗體對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色，用CD11b 抗體及Ly6C/Ly6G 抗體對(duì)中性粒細(xì)胞進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按試劑盒說明書測(cè)定外周血和腹腔灌洗液中IL-1β 和TNF-α 水平。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS v23.0 和GraphPad Prism 9.0.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以±s表示，組間差異比較用單因素方差分析處理；生存曲線由GraphPad Prism 9.0.0 繪制，組間差異采用log-rank test。

3 結(jié)果

3.1 NLRP3 炎癥小體激活模型篩選甘草活性成分

本研究建立了體外NLRP3 炎癥小體激活模型，對(duì)甘草中10 種活性成分（甘草苷、甘草素、異甘草苷、甘草次酸、芹糖異甘草苷、甘草酸單銨、芒柄花苷、光甘草定、刺甘草查耳酮、甘草酸）抑制NLRP3 炎癥小體激活的效應(yīng)進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，刺甘草查耳酮可顯著抑制尼日利亞菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液中Caspase-1 p20 的蛋白表達(dá)（P＜0.001，圖1-A、B），對(duì)Caspase-1 p45 蛋白表達(dá)沒有顯著影響（圖1-C），同時(shí)顯著抑制IL-1β 分泌（P＜0.05，圖1-D），與課題組前期研究結(jié)果一致[17]，故認(rèn)為刺甘草查耳酮作為甘草中抑制NLRP3 炎癥小體經(jīng)典通路的標(biāo)志性成分，擬將其選為后續(xù)聯(lián)合使用的小分子之一。

圖1 NLRP3 炎癥小體激活模型篩選甘草活性成分 (±s, n = 3)Fig. 1 Screening of active components of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma by NLRP3 inflammasome activation model (±s,n = 3)

3.2 體外氧化應(yīng)激模型篩選甘草活性成分

采用H2O2建立體外氧化應(yīng)激模型，首先對(duì)H2O2的細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示H2O2的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值為491.6 μmol/L（圖2-A），因此選用可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生且相對(duì)安全的濃度200 μmol/L 作為刺激濃度。如圖2-B 所示，甘草中10 個(gè)活性成分均可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生（P＜0.05、0.01、0.001），其中甘草酸抑制效果最佳。因此，本實(shí)驗(yàn)將刺甘草查耳酮、甘草酸作為組分聯(lián)合的研究對(duì)象進(jìn)行下一步的研究。

圖2 體外氧化應(yīng)激模型篩選甘草活性成分 (±s, n = 3)Fig. 2 Screening of active components of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma by in vitro oxidative stress model (±s, n = 3)

3.3 刺甘草查耳酮、甘草酸的細(xì)胞毒性及抗氧化應(yīng)激作用

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究篩選出了甘草10 個(gè)成分中抑制炎癥小體激活及抗氧化應(yīng)激作用最強(qiáng)的2 個(gè)活性成分——刺甘草查耳酮、甘草酸，接下來對(duì)二者的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)24 h 內(nèi)二者均未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性（圖3-A、B），刺甘草查耳酮和甘草酸可顯著抑制H2O2刺激的細(xì)胞活性降低（P＜0.05、0.01，圖3-C）。研究表明，H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS 并進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，SOD 活性降低[26-28]。如圖3-D 所示，甘草酸顯著上調(diào)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞中SOD 活性（P＜0.01、0.001），表明甘草酸具有恢復(fù)SOD 活性的效應(yīng)。

圖3 刺甘草查耳酮、甘草酸的細(xì)胞毒性和抗氧化應(yīng)激作用 (±s, n = 3)Fig. 3 Cytotoxicity and anti-oxidative stress effect of echinatin and glycyrrhizic acid (±s, n = 3)

3.4 刺甘草查耳酮、甘草酸對(duì)NLRP3 炎癥小體的影響

進(jìn)而對(duì)不同濃度的刺甘草查耳酮、甘草酸抑制NLRP3 炎癥小體的效應(yīng)進(jìn)行研究，如圖4 所示，刺甘草查耳酮可劑量相關(guān)性地抑制尼日利亞菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液中Caspase-1 p20 蛋白表達(dá)以及炎癥因子IL-1β 的釋放（P＜0.01、0.001），但各劑量的甘草酸對(duì)細(xì)胞上清液中Caspase-1 p20 的蛋白表達(dá)以及IL-1β 的釋放均無明顯作用，且二者對(duì)細(xì)胞裂解液中Caspase-1 p45 的蛋白表達(dá)均無明顯影響。進(jìn)一步地確定了刺甘草查耳酮、甘草酸抗炎、抗氧化應(yīng)激的效果，下一步的實(shí)驗(yàn)中將對(duì)比研究刺甘草查耳酮-甘草酸組分聯(lián)合在膿毒血癥疾病模型的作用效果。

圖4 刺甘草查耳酮、甘草酸對(duì)NLRP3 炎癥小體的影響 (±s, n = 3)Fig. 4 Effects of echinatin and glycyrrhizic acid on NLRP3 inflammasome (±s, n = 3)

3.5 刺甘草查耳酮-甘草酸提高LPS 誘導(dǎo)的膿毒血癥致死模型小鼠的生存率

研究表明，ip LPS 可誘導(dǎo)小鼠膿毒血癥，機(jī)體產(chǎn)生激烈的免疫反應(yīng)以對(duì)抗外來致病原，產(chǎn)生過激的炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致小鼠死亡[29]。如圖5 所示，與模型組比較，刺甘草查耳酮、甘草酸均可延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間（P＜0.05、0.001），降低72 h 內(nèi)的死亡率；且刺甘草查耳酮-甘草酸聯(lián)合更有優(yōu)勢(shì)，其治療膿毒性休克的效果強(qiáng)于單獨(dú)給予低、高劑量的甘草酸及低劑量的刺甘草查耳酮和陽性對(duì)照藥物MCC950。

圖5 刺甘草查耳酮、甘草酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒血癥致死模型小鼠生存曲線的影響Fig. 5 Effects of echinatin and glycyrrhizic acid on survival curve of mice in LPS-induced sepsis death model

3.6 刺甘草查耳酮-甘草酸協(xié)同作用于LPS 誘導(dǎo)的膿毒血癥模型

刺甘草查耳酮和甘草酸能夠明顯延長(zhǎng)LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥模型小鼠的生存時(shí)間。進(jìn)一步評(píng)價(jià)LPS誘導(dǎo)小鼠進(jìn)入免疫風(fēng)暴狀態(tài)的情況下，體內(nèi)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的水平以及藥物干預(yù)的有效性。根據(jù)腹腔內(nèi)滲出的巨噬細(xì)胞（F4/80+）和中性粒細(xì)胞（CD11b+、Ly6G+）在總細(xì)胞的占比越高，則小鼠免疫越亢進(jìn)[18]。為了評(píng)價(jià)多種活性成分協(xié)同治療膿毒血癥的效果，使用甘草酸、刺甘草查耳酮、甘草酸-刺甘草查耳酮聯(lián)用以及甘草提取物對(duì)膿毒血癥模型小鼠進(jìn)行干預(yù)。如圖6-A 所示，ip LPS 可增加巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和滲出，而藥物干預(yù)后巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的滲出較模型組顯著減少（P＜0.01、0.001），并且聯(lián)合組與單藥組有顯著差異（P＜0.001）。如圖6-B、C 所示，刺甘草查耳酮和甘草酸可以顯著降低外周血和腹腔灌洗液中炎癥因子IL-1β 和TNF-α 水平（P＜0.01、0.001），聯(lián)合組的效果強(qiáng)于單獨(dú)給藥組（P＜0.05、0.001）。綜合以上結(jié)果，刺甘草查耳酮和甘草酸均可有效防治膿毒血癥，并且刺甘草查耳酮-甘草酸的聯(lián)合使用效果更佳。

圖6 刺甘草查耳酮和甘草酸對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的影響 (±s, n = 8)Fig. 6 Effects of echinatin and glycyrrhizic acid on LPS-induced sepsis mice model (±s, n = 8)

4 討論

膿毒血癥的發(fā)生發(fā)展過程中常伴隨著機(jī)體多重異常損傷，其中以過度的炎癥反應(yīng)以及較強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)為其主要的表現(xiàn)特征[30-32]。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在機(jī)體損傷中常發(fā)揮著協(xié)同的作用，炎癥反應(yīng)的發(fā)生常伴隨著氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)擴(kuò)大機(jī)體炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，隨著炎癥反應(yīng)的不斷擴(kuò)大會(huì)進(jìn)一步地加重機(jī)體氧化應(yīng)激水平[33]。同樣地，氧化應(yīng)激在炎癥小體的激活中發(fā)揮著重要的作用，是上游調(diào)控多種炎癥小體激活的重要因素，如氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ROS 的產(chǎn)生是NLRP3炎癥小體的主要因素[34]；氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體損傷也是激活黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎癥小體的主要因素[35]。NLRP3 炎癥小體是研究最多的炎癥小體，其激活后通過形成多蛋白復(fù)合物，成熟并釋放細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[36]。NLRP3 炎癥小體過度激活可誘發(fā)和放大炎癥反應(yīng)，引起和加重一系列的細(xì)胞損傷、免疫失調(diào)進(jìn)而損害機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)[37-41]，這對(duì)于膿毒血癥的病程發(fā)展是十分重要的[42]。篩選發(fā)現(xiàn)靶向抗炎、抗氧化應(yīng)激的藥物活性成分，對(duì)于精準(zhǔn)防治膿毒血癥具有重要意義。

傳統(tǒng)中藥作為天然藥物的寶庫，多種中藥及其單體已被證明可通過調(diào)控炎癥小體及氧化應(yīng)激等在許多疾病的治療中起到良好的療效，在相關(guān)疾病的新藥開發(fā)中極具潛力。甘草組分構(gòu)成繁雜，目前已從中鑒定出了400 多種成分，其中三萜類及黃酮類化合物（如甘草酸、甘草素、光甘草定、刺甘草查耳酮等）是含量最高的2 大類成分[43]，多種成分已被證明具有治療膿毒血癥的作用[18-19,44-45]。本實(shí)驗(yàn)建立了LPS 誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體激活模型以及H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型，研究了甘草中10 種主要活性成分抗炎、抗氧化的作用效果，結(jié)果表明刺甘草查耳酮可顯著抑制NLRP3 炎癥小體激活，減少尼日利亞菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液中Caspase-1 p20蛋白表達(dá)，同時(shí)顯著降低炎癥因子IL-1β 和TNF-α的產(chǎn)生；此外，甘草中的多種成分均可抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生，其中甘草酸的抑制效果強(qiáng)于其他成分，表明刺甘草查耳酮、甘草酸可能是甘草中主要的抗炎、抗氧化的成分。進(jìn)一步將刺甘草查耳酮-甘草酸聯(lián)合應(yīng)用于膿毒血癥致死實(shí)驗(yàn)以及膿毒血癥模型中，結(jié)果表明，刺甘草查耳酮-甘草酸可顯著減低LPS 的致死率，顯著降低膿毒血癥模型小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞F4/80+和中性粒細(xì)胞CD11b+、Ly6G+比例，降低外周血和腹腔灌洗液中炎癥因子IL-1β、TNF-α水平，且組分聯(lián)合組效應(yīng)均強(qiáng)于單獨(dú)用藥組，證明刺甘草查耳酮-甘草酸在防治膿毒血癥的過程中發(fā)揮了多途徑協(xié)同增效作用，其機(jī)制主要可能與抑制炎癥小體激活及抗氧化相關(guān)。

多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)是中藥理論精髓，中藥組分中的協(xié)同作用或是臨床作用效果的主要原因[46]。本研究基于中藥“組分-靶點(diǎn)-效應(yīng)”，從免疫炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的途徑聯(lián)合評(píng)價(jià)了甘草中多種活性成分的作用效應(yīng)，并將其中抑制炎癥小體效果有效成分（刺甘草查耳酮）與抗氧化效應(yīng)強(qiáng)效成分（甘草酸）聯(lián)合應(yīng)用于膿毒血癥模型中，證明了甘草活性成分協(xié)同治療膿毒血癥的聯(lián)合增效作用，為膿毒血癥聯(lián)合治療藥物的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為組分中藥的開發(fā)及中藥臨床精準(zhǔn)聯(lián)合用藥提供了新的研究思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突