三仁顆粒制備及質(zhì)量控制研究

馮禹壯，徐 偉，肖春萍，趙淑月，翁麗麗

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117

三仁湯出自清代吳鞠通的《溫病條辨》[1]，原文記載：“頭痛惡寒，身重疼痛，舌白不渴，脈弦細(xì)而濡，面色淡黃，胸悶不饑，午后身熱，狀若陰虛，病難速已，名曰濕溫……三仁湯主之。”處方由杏仁、白蔻仁、生薏仁、半夏、厚樸、白通草、竹葉、飛滑石8 味藥材組成，主治濕溫初起及暑溫夾濕之濕重于熱證[2]。方中杏仁、白蔻仁、薏苡仁為君藥，分消三焦?jié)駸幔恢袢~、飛滑石為臣藥，清熱利濕；厚樸、半夏為佐藥，芳化燥濕；白通草為使藥，導(dǎo)熱下行?，F(xiàn)代臨床研究表明，三仁湯配合其他藥物對(duì)消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等濕熱證有良好療效，如聯(lián)合升降散治療脾胃濕熱型胃炎[3]；舌草三仁湯能夠改善青少年腸胃濕熱型痤瘡、并較低其復(fù)發(fā)率[4]；三仁湯加陳皮、枳殼等藥味，對(duì)濕熱侵心的病毒性心肌損傷有良好療效[5]；聯(lián)合美洛昔康可有效緩解濕熱型骨關(guān)節(jié)炎[6]等。

目前，有關(guān)三仁湯的報(bào)道主要集中于其藥理作用和臨床應(yīng)用，而前期制劑的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較為缺乏。季旭明等[7]通過研究三仁湯對(duì)濕熱證型病毒性肺炎小鼠的治療作用發(fā)現(xiàn)，三仁湯能夠改變機(jī)體炎性因子含量、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；胡鋒等[8]研究發(fā)現(xiàn)，三仁湯可以通過下調(diào)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的NOD-、LRR-和pyrin 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)3（NOD-,LRR-and pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 蛋白表達(dá)來(lái)減少大鼠血清中炎癥因子的表達(dá)，從而緩解關(guān)節(jié)疼痛癥狀?？嘈尤省邹⑷屎娃曹尤蕿槿蕼木?，苦杏仁的主要藥效成分為苦杏仁苷，具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗胃潰瘍、止咳平喘等藥理作用[9]；豆蔻作為芳香健胃藥，其主要藥效成分為桉油精，具有抗炎抗過敏、抗氧化、保護(hù)胃腸損傷等作用[10]；薏苡仁具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、抗?jié)兊人幮11-12]，其主要藥效成分為甘油三油酸酯。三仁湯的君藥均有鎮(zhèn)痛抗炎作用，在治療因濕熱引起的各種炎癥中起著關(guān)鍵作用。另外，厚樸中的厚樸酚及和厚樸酚也有抗炎鎮(zhèn)痛功效[13-14]，與三仁湯主治功能相吻合。因此，本研究將苦杏仁苷、厚樸酚及和厚樸酚作為三仁湯的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，對(duì)三仁湯進(jìn)行制備和處方質(zhì)量控制。

相比于傳統(tǒng)湯劑，顆粒劑能顯著改善湯劑服用量大、攜帶運(yùn)輸不便等缺點(diǎn)，三仁湯劑型改良勢(shì)在必行。迄今尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)三仁顆粒制備工藝及質(zhì)量控制的有關(guān)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法建立了苦杏仁苷、厚樸酚及和厚樸酚等多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法；以出膏量，苦杏仁苷、厚樸酚及和厚樸酚含量，50%乙醇浸出物為綜合考察指標(biāo)，結(jié)合熵權(quán)法分配各指標(biāo)權(quán)重，運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)選三仁湯提取工藝；采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（central composite design-response surface method，CCD-RSM）優(yōu)化三仁顆粒的成型工藝，并結(jié)合薄層色譜及指紋圖譜進(jìn)行了三仁顆粒的質(zhì)量控制研究，旨在為三仁顆粒的工藝生產(chǎn)和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AUW120D 型分析天平、島津LC-2030 高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司；DHG-9070 A 型鼓風(fēng)式干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA1004B型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；HH-S24 型恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.2 試劑與藥物

對(duì)照品苦杏仁苷（批號(hào)110820-201808，質(zhì)量分?jǐn)?shù)88.2%）、厚樸酚（批號(hào)110729-202015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、和厚樸酚（批號(hào)110730-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇，色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

進(jìn)行三仁顆粒制備工藝優(yōu)化、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立及指紋圖譜基準(zhǔn)樣品制備的藥材杏仁、白蔻仁、生薏仁、半夏、厚樸、白通草、竹葉、飛滑石均購(gòu)自吉林北藥藥材加工有限公司、吉林省宏檢大藥房及吉林國(guó)安藥業(yè)有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定，分別為薔薇科李屬植物山杏Prunus armeniacaL. var.ansuMaxim.的干燥成熟種子、姜科豆蔻屬植物白豆蔻AmomumkravanhPierre ex Gagnep.的干燥成熟果實(shí)、禾本科薏苡屬植物薏米Coixlacryma-jobiL. var.ma-yuen(Roman.) Stapf 的干燥成熟種仁、木蘭科厚樸屬植物厚樸Magnolia officinalisRehd. et Wils.的干燥干皮、天南星科半夏屬植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖炮制品、五加科通脫木屬植物通脫木Tetrapanax papyrifer(Hook.) K. Koch 的干燥莖髓、禾本科淡竹葉屬植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的干燥莖葉、硅酸鹽類礦物滑石族滑石Talcum，主含含水硅酸鎂［Mg3(Si4O10)(OH)2］。

進(jìn)行三仁顆粒制備工藝優(yōu)化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立所采用的藥材及批號(hào)分別為苦杏仁（批號(hào)20210111-01）、白蔻仁（批號(hào)20210508）、薏苡仁（批號(hào)20210408）、厚樸（批號(hào)20200901-01）、姜半夏（批號(hào)20210412）、通草（批號(hào)20210508）、淡竹葉（批號(hào)20200902）、滑石（批號(hào)20210202），均購(gòu)自吉林北藥藥材加工有限公司。10 批三仁顆粒樣品（S1～S10）組方藥材及批號(hào)信息如表1 所示。

表1 10 批三仁顆粒基準(zhǔn)樣品 (S1～S10) 組方藥材及批號(hào)信息Table 1 Prescription medicinal materials and batch number information in 10 batches of Sanren Granules reference samples(S1—S10)

2 方法與結(jié)果

2.1 三仁湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備

《溫病條辨》中描述三仁湯煎煮方法為“杏仁五錢、白蔻仁二錢、生薏仁六錢、半夏五錢、厚樸二錢、白通草二錢、竹葉二錢、飛滑石六錢，甘瀾水八碗，煮取三碗?！眳⒖肌吨袊?guó)科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》[15]中附錄的《中國(guó)歷代度量衡值表》及顏文強(qiáng)考證的《中國(guó)歷代度量衡換算簡(jiǎn)表》，清代“一兩等于37.3 g，一錢等于3.73 g”。參考“十三五”規(guī)劃教材《方劑學(xué)》[16]，“一兩等于37.3 g，一錢等于3.73 g”，參考《經(jīng)典名方開發(fā)指引》[17]中清代1 碗約為150～300 mL。經(jīng)文獻(xiàn)考證及預(yù)實(shí)驗(yàn)考察，確定三仁湯基準(zhǔn)樣品制備方法為苦杏仁18.65 g，豆蔻7.46 g，薏苡仁22.38 g，姜半夏18.65 g，厚樸7.46 g，白通草7.46 g，淡竹葉7.46 g，飛滑石22.38 g，加水1200 mL，傳統(tǒng)方法煎煮至藥液剩余450 mL，收集濾液，干燥即得。

2.2 三仁湯提取工藝優(yōu)化

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～72 min，220 nm；72～100 min，330 nm；100～120 min，294 nm；流動(dòng)相為0.05%磷酸水溶液-甲醇，洗脫程序：0～20 min，5%～10%甲醇；20～70 min，10%甲醇；70～75 min，10%～30%甲醇；75～80 min，30%甲醇；80～90 min，30%～47%甲醇；90～100 min，47%～60%甲醇；100～105 min，60%～85%甲醇；105～110 min，85%甲醇。對(duì)照品、供試品、苦杏仁陰性、厚樸陰性對(duì)照溶液的HPLC 圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A)、三仁湯供試品 (B)、缺苦杏仁陰性樣品 (C) 和缺厚樸陰性樣品 (D) 的HPLC 圖Fig. 1 HPLC of mixed reference substances (A), test sample(B), negative sample without Armeniacae Semen Amarum(C), and negative sample without Magnoliae Officinalis Cortex (D)

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含苦杏仁苷753.5 μg/mL、厚樸酚82 μg/mL、和厚樸酚48.8 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 供試品溶液的制備 按處方劑量稱取藥材，煎煮，濾過，濾液濃縮成干浸膏，粉碎過三號(hào)篩，作為供試品。取供試品1 g，精密稱定，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 分別稱取缺苦杏仁、缺厚樸的三仁湯處方，同“2.2.3”項(xiàng)操作，分別制成缺苦杏仁陰性對(duì)照溶液、缺厚樸陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，精密吸取各質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。得到回歸方程分別為苦杏仁苷Y＝11 318 301.85X－220 931.188 1，r＝0.999 6，線性范圍37.6～753.5 μg/mL；厚樸酚Y＝15 083 504.12X＋22 001.191 03，r＝0.999 3，線性范圍4.1～82.0 μg/mL；和厚樸酚Y＝22 759 975.26X＋32 124.668 38，r＝0.999 7，線性范圍2.44～48.80 μg/mL。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6 次，測(cè)得苦杏仁苷峰面積RSD 為0.70%，厚樸酚峰面積RSD 為0.23%，和厚樸酚峰面積RSD 為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得6 份供試品中苦杏仁苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為1.36%，厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為1.76%，和厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為1.48%，表明該提取方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察 取“2.2.6”項(xiàng)下供試品溶液1份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得供試品溶液中苦杏仁苷峰面積RSD 為1.29%，厚樸酚峰面積RSD為1.70%，和厚樸酚峰面積RSD 為1.02%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定指標(biāo)成分含量的供試品0.5 g，精密稱定，分別加入適量苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品，加甲醇至25 mL，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，測(cè)定苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚的加樣回收率分別為100.88%、98.65%、99.06%，RSD 分別為1.68%、1.11%、0.99%，符合規(guī)定。

2.2.10 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

（1）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：通過對(duì)三仁湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備考察可知，三仁湯全方共111.9 g，加水量為1200 mL，約為藥材重量的10 倍，且將1200 mL 煎煮至450 mL 所用時(shí)間大約為1.2 h，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平。正交試驗(yàn)將全方質(zhì)量擴(kuò)大為223.8 g，以加水量（A）、煎煮時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（C）為影響因素，出膏量（Y1）、苦杏仁苷含量（Y2）、厚樸酚含量（Y3）、和厚樸酚含量（Y4）、50%乙醇浸出物（Y5）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立L9(34)正交試驗(yàn)表，進(jìn)行三仁湯提取工藝的考察，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

（2）熵權(quán)法：采用熵權(quán)法計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)熵權(quán)系數(shù)，該指標(biāo)對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果作用越大，權(quán)重值也越大。計(jì)算可得綜合評(píng)分計(jì)算公式為Y＝Y(jié)1/Y1max×16.03＋Y2/Y2max×20.07＋Y3/Y3max×24.42＋Y4/Y4max×24.51＋Y5/Y5max×14.97。信息熵及權(quán)重計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 信息熵及權(quán)重計(jì)算結(jié)果Table 3 Information entropy and weight calculation results

（3）提取工藝優(yōu)化結(jié)果及分析：正交試驗(yàn)直觀分析及方差分析分別見表2、4。直觀分析結(jié)果顯示，以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)分析可知，A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，三仁湯提取的最優(yōu)工藝為A2B2C2。方差分析結(jié)果表明，C 因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），A、B 因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響。因此，進(jìn)一步對(duì)A2B2C2與A1B1C2提取參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 種提取工藝下，出膏量、苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚含量、50%乙醇浸出物總量的RSD 分別為1.59%、2.62%、1.77%、2.18%、0.49%，兼顧節(jié)省能源和工時(shí)，最終將煎煮條件確定為A1B1C2，即加8 倍量水，煎煮2 次，每次1 h。

表4 綜合評(píng)分的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance table

（4）驗(yàn)證試驗(yàn)：采用“2.2.10（3）”項(xiàng)下最佳工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證。由表5 可知，3 組驗(yàn)證試驗(yàn)中出膏量、苦杏仁苷含量、厚樸酚含量、和厚樸酚含量、浸出物總量及綜合評(píng)分RSD 分別為0.85%、2.89%、1.54%、1.31%、0.67%、1.07%，表明優(yōu)選出的最佳工藝穩(wěn)定可靠。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Verification test results

2.3 三仁顆粒成型工藝優(yōu)化

2.3.1 三仁顆粒制備方法 照“2.1”項(xiàng)下劑量稱取藥材，按“2.2.10（3）”項(xiàng)下三仁湯最佳提取工藝進(jìn)行煎煮，在70 ℃、0.08 MPa 條件下進(jìn)行減壓干燥，得到浸膏粉末，粉碎，過五號(hào)篩，加入輔料和潤(rùn)濕劑，采用擠壓制粒法，過14 目篩，60～80 ℃下梯度升溫干燥，整粒，即得。

2.3.2 測(cè)定指標(biāo) 參考文獻(xiàn)方法[18-22]，測(cè)定顆粒成型率、休止角、堆密度、吸濕率。

2.3.3 輔料的篩選 以可溶性淀粉、糊精、糖粉和微晶纖維素為輔料，按藥輔比1∶1.5，80%乙醇進(jìn)行制粒，以顆粒成型率、休止角、堆密度、吸濕率為考察指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，以糊精為輔料時(shí)，顆粒容易制備，且各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果均優(yōu)于其余輔料組，所以選用糊精為輔料進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.4 CCD-RSM 優(yōu)化三仁顆粒成型工藝處方

（1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果：以藥輔比（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）和乙醇用量（X3）為影響因素，成型率（Y1）、休止角（Y2）、堆密度（Y3）和吸濕率（Y4）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用CCD-RSM 優(yōu)化成型工藝，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6。

表6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of test

（2）熵權(quán)法計(jì)算綜合評(píng)分：參考文獻(xiàn)方法[23]，采用熵權(quán)法計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)熵權(quán)系數(shù)，計(jì)算可得綜合評(píng)分計(jì)算公式為Y＝Y(jié)1/Y1max×20.12＋Y2min/Y2×45.88＋Y3/Y3max×11.11＋Y4min/Y4×22.89。

（3）成型的工藝優(yōu)化：采用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（表6），得到擬合方程為Y＝95.37－0.54X1－1.52X2－0.40X3＋1.37X1X2＋0.76X1X3＋1.24X2X3－4.10X12－6.15X22－3.37X32，r＝0.988 6。由方差分析（表7）可知，該模型擬合具有極顯著性（P＜0.000 1），失擬誤差項(xiàng)為0.079 0，表明該模型擬合度較好，且各因素影響程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞藥輔比＞乙醇用量。

表7 方差分析Table 7 Analysis of variance

綜上可知，三仁顆粒最佳成型工藝為藥輔比1∶1.5，乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，乙醇用量為藥粉和輔料總量的21%，綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值為95.368。

（4）驗(yàn)證試驗(yàn)：按上述最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明（表8），3 批三仁顆粒成型率、休止角、堆密度、吸濕率的RSD 分別為0.43%、1.22%、1.23%、1.05%，綜合評(píng)分與預(yù)測(cè)值95.368 相近，證明該工藝相對(duì)穩(wěn)定。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果Table 8 Verification test and results

2.4 三仁顆粒的質(zhì)量控制研究

2.4.1 薄層鑒別

（1）苦杏仁薄層鑒別：參照國(guó)家藥典委員會(huì)[24]中燀苦杏仁配方顆粒的鑒別方法進(jìn)行修改，具體操作：①取苦杏仁苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。②另取苦杏仁對(duì)照藥材0.3 g，加入30 mL 沸水，保持微沸30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL 使溶解，制成對(duì)照藥材溶液。③取3 批顆粒各0.5 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。同法制成缺苦杏仁陰性對(duì)照溶液。吸取苦杏仁苷對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 μL，供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水（3∶8∶6∶2）5～10 ℃放置12 h 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，以0.8%磷鉬酸的15%硫酸乙醇溶液浸板，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰?？嘈尤时由V見圖2，結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。方法學(xué)考察結(jié)果表明，苦杏仁薄層鑒別方法穩(wěn)定。

圖2 苦杏仁薄層色譜圖Fig. 2 TLC of Armeniacae Semen Amarum

（2）薏苡仁薄層鑒別：參考文獻(xiàn)中薏苡仁薄層鑒別方法[25]并進(jìn)行修改，具體操作：①取薏苡仁對(duì)照藥材1 g，加水100 mL，微沸30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)哟姿嵋阴?0 mL，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，超聲提取30 min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。②取3 批顆粒各5 g，研細(xì)，加水30 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液置分液漏斗中，加醋酸乙酯萃取2 次，每次15 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)哟姿嵋阴?.5 mL 溶解，作為供試品溶液。同法制成缺薏苡仁陰性對(duì)照溶液。吸取對(duì)照藥材溶液4 μL，供試品溶液8 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-醋酸乙酯-冰醋酸（17∶1∶1）為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以4%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。薏苡仁薄層色譜見圖3，結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。方法學(xué)考察結(jié)果表明，薏苡仁薄層鑒別方法穩(wěn)定。

圖3 薏苡仁薄層色譜圖Fig. 3 TLC of Coicis Semon

（3）厚樸薄層鑒別：參照國(guó)家藥典委員會(huì)[24]中厚樸配方顆粒的鑒別方法進(jìn)行修改，具體操作：①取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品，加甲醇分別制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。②另取厚樸對(duì)照藥材1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。③取3 批顆粒各5 g，研細(xì)，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇2 mL 溶解，作為供試品溶液。同法制成缺厚樸陰性對(duì)照溶液。吸取對(duì)照品溶液5 μL，對(duì)照藥材溶液2 μL，供試品溶液8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-甲醇（15∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以4%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。厚樸薄層色譜見圖4，結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。方法學(xué)考察結(jié)果表明，厚樸薄層鑒別方法穩(wěn)定。

圖4 厚樸薄層色譜圖Fig. 4 TLC of M. officinalis

2.4.2 指標(biāo)成分含量測(cè)定

（1）色譜條件：同“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件。

（2）對(duì)照品溶液的制備：同“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液制備方法。

（3）供試品溶液的制備：取供試品2.5 g，精密稱定，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（4）線性關(guān)系考察：同“2.2.4（1）”項(xiàng)。

（5）精密度考察：取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD 分別為0.70%、0.23%、0.19%，表明儀器精密度良好。

（6）重復(fù)性考察：按“2.4.2（3）”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，測(cè)得6 份三仁顆粒中苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為1.51%、1.20%、1.34%，表明該提取方法重復(fù)性良好。

（7）穩(wěn)定性考察：取“2.4.2（3）”項(xiàng)下供試品溶液1 份，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 測(cè)定，苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD 分別為1.01%、1.66%、1.29%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（8）加樣回收率考察：取已測(cè)定指標(biāo)成分含量的供試品0.25 g，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液，加甲醇至25 mL，按照“2.4.2（3）”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，測(cè)得苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚的平均加樣回收率分別為99.24%、97.91%、99.35%，RSD 分別為0.46%、0.48%、0.63%，符合規(guī)定。

2.4.3 指紋圖譜研究

（1）色譜條件：同“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件。

（2）對(duì)照品溶液的制備：取苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成含苦杏仁苷39.8 μg/mL、厚樸酚40 μg/mL、和厚樸酚24 μg/mL 的對(duì)照品溶液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）供試品溶液的制備：同“2.4.2（3）”項(xiàng)下供試品溶液制備方法。

（4）飲片單煎樣品溶液的制備：按處方稱取各單味藥材，按最佳提取工藝進(jìn)行煎煮，濃縮成干浸膏，取0.5 g，照“2.4.3（3）”項(xiàng)下制備方法制備各飲片單煎樣品溶液。

（5）陰性樣品溶液的制備：按處方稱取各味藥材的陰性處方，按最佳提取工藝進(jìn)行煎煮，濃縮成干浸膏并制成顆粒，照“2.4.3（3）”項(xiàng)下方法制備各飲片陰性樣品溶液。

（6）精密度考察：照“2.4.3（3）”項(xiàng)下方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按上述色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，以9 號(hào)峰為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.65%，表明儀器精密度良好。

（7）重復(fù)性考察：照“2.4.3（3）”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，測(cè)定，以9 號(hào)峰為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.53%，表明該提取方法重復(fù)性良好。

（8）穩(wěn)定性考察：照“2.4.3（3）”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行提取，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 測(cè)定，以9 號(hào)峰為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.29%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（9）指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)：選用編號(hào)為S1～S10 的組方，按照上述優(yōu)選出的最佳提取及成型工藝操作，按上述方法進(jìn)行提取并測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》對(duì)十批樣品的圖譜進(jìn)行分析，建立了15 個(gè)共有峰的評(píng)價(jià)模式，得到10 批三仁顆粒指紋圖譜共有峰的對(duì)照?qǐng)D譜（R），如圖5 所示，相似度計(jì)算結(jié)果如表9 所示。由表9 可知，10 批三仁顆粒（S1～S10）樣品間相似度均大于0.90，表明優(yōu)選得到的三仁顆粒制備工藝穩(wěn)定，指紋圖譜整體相似度較高，可用于三仁顆粒的鑒別和質(zhì)量控制。

圖5 10 批三仁顆粒指紋圖譜共有特征峰Fig. 5 Common characteristic peaks of ten batches of Sanren Granules fingerprint

表9 10 批三仁顆粒指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果Table 9 Similarity calculation results of ten batches of Sanren Granules fingerprint

（10）色譜峰歸屬：將單味藥材照“2.2.10（3）”項(xiàng)下方法進(jìn)行煎煮，濃縮成干浸膏，分別各取0.5 g，照“2.4.3（3）”項(xiàng)下方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，與供試品溶液進(jìn)行對(duì)比，歸屬色譜峰。結(jié)果如圖6 所示，1 號(hào)峰歸屬于苦杏仁、厚樸，2、7、13 號(hào)峰歸屬于豆蔻、厚樸、淡竹葉，3、4、8、9 號(hào)峰為苦杏仁專屬峰，5 號(hào)峰歸屬于苦杏仁、豆蔻、厚樸、淡竹葉，6、11、12、14、15 號(hào)峰為厚樸專屬峰，10 號(hào)峰歸屬于厚樸、淡竹葉。

圖6 三仁顆粒指紋圖譜中15 個(gè)共有峰及其歸屬Fig. 6 15 Common peaks and their attribution in fingerprints of Sanren Granules

2.5 三仁顆粒最佳工藝驗(yàn)證

按處方比例稱取藥材，加8 倍量水，煎煮2 次，每次1 h，濃縮，減壓干燥至干浸膏，以糊精為輔料，按藥輔比1∶1.5，乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，乙醇用量為藥粉和輔料總量的21%進(jìn)行制粒。采用“2.4.2”項(xiàng)下含量測(cè)定方法對(duì)6 批三仁顆粒中苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚進(jìn)行含量測(cè)定，由表10 結(jié)果可知，由最佳工藝制備的三仁顆粒中苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚含量RSD 分別為0.90%、1.27%、1.42%，表明該制備工藝穩(wěn)定可靠。

表10 6 批三仁顆粒含量測(cè)定Table 10 Determination of six batches of Sanren Granules

3 討論

發(fā)展古代經(jīng)典方劑，關(guān)鍵是要根據(jù)藥效嚴(yán)格地控制藥材的質(zhì)量，而對(duì)復(fù)雜的中藥配方，則要通過指紋圖譜和多個(gè)指標(biāo)的含量來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[26-27]。本研究建立了苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚的含量測(cè)定方法，以多指標(biāo)為依據(jù)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選三仁湯最佳提取工藝。結(jié)果表明，三仁湯最佳提取工藝為加8 倍量水，煎煮2 次，每次1 h。顆粒劑在服用劑量、儲(chǔ)存運(yùn)輸、質(zhì)量監(jiān)測(cè)等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，竹葉石膏湯[28]、半夏白術(shù)天麻湯[29]、復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯[30]等經(jīng)典方劑都采用響應(yīng)面法制成顆粒劑。因此，本研究通過CCD-RSM 優(yōu)化三仁顆粒的成型工藝，篩選獲得三仁顆粒最佳成型工藝為糊精為輔料，藥輔比1∶1.5，乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，乙醇用量為藥粉和輔料總量的21%。不同的方劑，其成分、劑量、給藥方式存在較大的差異，為保證治療的有效性以及降低用藥風(fēng)險(xiǎn)，制定一套科學(xué)且合理的質(zhì)量控制體系具有重要意義，其中中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵[31]。中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)的方法主要體現(xiàn)在2 個(gè)方面，一是中藥指紋圖譜分析方法的建立[32]，二是中藥多成分的質(zhì)量控制模式的建立[33]。本研究建立了3 種成分（苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚）的含量測(cè)定方法，并結(jié)合薄層鑒別，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，苦杏仁、薏苡仁、厚樸的薄層鑒別方法穩(wěn)定可靠，而淡竹葉、通草、姜半夏薄層鑒別時(shí)，由于有陰性干擾，故將苦杏仁、薏苡仁、厚樸的薄層鑒別作為三仁顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。在《中國(guó)藥典》2020年版中，僅對(duì)三仁湯中燀苦杏仁、豆蔻仁、薏苡仁、厚樸規(guī)定了含量測(cè)定項(xiàng)。本研究發(fā)現(xiàn)三仁湯水煎液中苦杏仁苷（燀苦杏仁）、厚樸酚（厚樸）、和厚樸酚（厚樸）的含量較高且易于監(jiān)測(cè)，而桉油精（揮發(fā)油類，豆蔻仁）和甘油三油酸酯（有機(jī)酸酯類，薏苡仁）等成分在水煎液中含量較低且不穩(wěn)定。其他研究者在對(duì)古方水煎液中豆蔻仁和薏苡仁的含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似問題[34-36]。因此，本研究選擇苦杏仁苷、厚樸酚、和厚樸酚作為三仁顆粒質(zhì)量控制中的含量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

中藥的化學(xué)組分與其功效有直接聯(lián)系，但由于其組成的復(fù)雜性，單一或少數(shù)指標(biāo)難以完全地反映其品質(zhì)。中藥指紋圖譜是一種可以用來(lái)研究中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的手段，可以將中藥的整體化學(xué)特征反映出來(lái)，還可以在一定程度上將中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣進(jìn)行鑒別，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其質(zhì)量的評(píng)價(jià)與控制[37]。因此，本研究建立了10 批三仁顆粒樣品的指紋圖譜，各樣品間相似度均大于0.90，共指認(rèn)15 個(gè)共有峰，說(shuō)明三仁顆粒中主要化學(xué)成分組成具有一致性。另外，在指紋圖譜方法開發(fā)時(shí)，0～70 min 內(nèi)保持低比例甲醇濃度進(jìn)行洗脫可使苦杏仁苷達(dá)到更好的分離效果，但厚樸酚、和厚樸酚因其極性較小需增大甲醇比例進(jìn)行洗脫，70～100 min 內(nèi)甲醇比例增大速度過快，從而導(dǎo)致信號(hào)線基線不穩(wěn)、色譜峰緊密，但考慮到指紋圖譜整體時(shí)間及各色譜峰分離度，最終確定以0.05%磷酸水與甲醇組合作為流動(dòng)相，并對(duì)洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突