甘草酸凝膠的流變學(xué)性質(zhì)及其對橙皮苷的增溶作用研究

楊凱麗，郭子碩，張 翼，陳宛靈，王曉靜，杜守穎，李鵬躍

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102442

甘草為豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、光果甘草G.glabraL.或脹果甘草G.inflataBat.的干燥根及根莖，其味甘、性平，具有補脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛等功效。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）屬三萜皂苷類化合物，是甘草中含量最高的有效成分，具有抗腫瘤[1-2]、抗炎[3]、抗病毒[4]等藥理作用。甘草酸由1 分子甘草次酸和2 分子葡萄糖酸組成，其兩親性結(jié)構(gòu)使甘草酸具有自組裝性，能夠形成具有疏水性內(nèi)腔的納米纖維[5]或凝膠，從而提高疏水性藥物的溶解度[6]，同時，憑借其抗菌性強、臨界凝膠濃度低、可實現(xiàn)可逆性凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變等優(yōu)異性能，甘草酸已成為一種具有巨大應(yīng)用價值的藥物遞送系統(tǒng)而被廣泛研究[7]。

半固體制劑的流變學(xué)性質(zhì)一定程度上能夠反映制劑的微觀結(jié)構(gòu)，對藥物從制劑中的釋放具有重要影響，但目前甘草酸凝膠的流變學(xué)特性尚缺乏深入研究。橙皮苷是蕓香科植物中含有的一種黃酮類化合物，具有抗腫瘤[8]、抗炎[9]、調(diào)節(jié)免疫[10]、抗心血管疾病[11]等藥理作用，但由于其溶解度低，極大地限制了其在醫(yī)學(xué)、食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，本研究擬探究甘草酸質(zhì)量濃度、溶劑pH 值、Na+質(zhì)量濃度、Ca2+質(zhì)量濃度對甘草酸凝膠流變學(xué)性質(zhì)的影響，同時評價其對疏水性藥物橙皮苷的溶解度和體外釋藥行為的影響，為甘草酸凝膠的實際應(yīng)用提供部分參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器

BSA 224S 型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HH-G1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；Anton Paar MCR 302 型旋轉(zhuǎn)流變儀，奧地利安東帕有限公司；Ultimate U3000型高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；Waters X Bridge·Shield RP18C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試藥

對照品甘草酸（批號A25GS146530，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、橙皮苷（批號N22GS168518，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%），上海源葉生物科技有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈣、氯化鈉，分析純，北京化學(xué)試劑公司；乙腈、磷酸，色譜級，美國賽默飛世爾科技有限公司；pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）片劑，北京索萊寶科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草酸凝膠樣品的制備

2.1.1 不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的制備 分別精密稱取甘草酸50、100、200、300、400、500、600 mg于10 mL 水中，在60 ℃水浴下緩慢攪拌，使甘草酸充分溶解，形成透明均一的甘草酸水溶液，室溫靜置12 h 使其凝固，即得不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠。

2.1.2 不同pH 值甘草酸凝膠的制備 以氫氧化鈉溶液和稀鹽酸調(diào)節(jié)純凈水pH 值分別至3、7、11，精密稱取甘草酸300 mg 于10 mL 不同pH 值的水中，在60 ℃水浴下緩慢攪拌，使甘草酸充分溶解，形成透明均一的甘草酸水溶液，室溫靜置12 h 使其凝固，即得不同pH 值甘草酸凝膠。

2.1.3 含不同質(zhì)量濃度Na+的甘草酸凝膠的制備分別配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、8.6 mg/mL 的NaCl 溶液作為溶劑，精密稱取甘草酸300 mg 于10 mL 不同質(zhì)量濃度的NaCl 溶液中，在60 ℃水浴下緩慢攪拌，使甘草酸充分溶解，形成透明均一的甘草酸水溶液，室溫靜置12 h 使其凝固，即得含不同質(zhì)量濃度Na+的甘草酸凝膠。

2.1.4 含不同質(zhì)量濃度Ca2+的甘草酸凝膠的制備分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2 mg/mL 的CaCl2溶液作為溶劑，精密稱取甘草酸300 mg 于10 mL 不同質(zhì)量濃度的CaCl2溶液中，在60 ℃水浴下緩慢攪拌，使甘草酸充分溶解，形成透明均一的甘草酸水溶液，室溫靜置12 h 使其凝固，即得含不同質(zhì)量濃度Ca2+的甘草酸凝膠。

2.2 甘草酸凝膠的流變學(xué)性能測試

2.2.1 應(yīng)變掃描實驗 選擇25 mm 平板轉(zhuǎn)子，于旋轉(zhuǎn)流變儀上對各樣品進行應(yīng)變掃描，測試溫度25 ℃，測試間距1 mm，角頻率10 rad/s，應(yīng)變由0.01%掃描至100%，繪制各凝膠的儲能模量（G′）、損耗模量（G″）隨剪切應(yīng)變的變化曲線，由G″與G′的比值求得各凝膠的損耗系數(shù)。

2.2.2 穩(wěn)態(tài)流變實驗 選擇25 mm 錐板轉(zhuǎn)子，錐角為2°，于旋轉(zhuǎn)流變儀上對各樣品進行穩(wěn)態(tài)掃描，測試溫度25 ℃，測試間距1 mm，應(yīng)變?yōu)?.01%，剪切速率由0.01 s-1掃描至100 s-1，繪制各凝膠的流變曲線即黏度隨剪切速率的變化曲線，對流變曲線進行擬合得零剪切黏度（η0）、無窮剪切黏度（η∞）、特征松弛時間（c）、剪切稀化指數(shù)（n）、剪切應(yīng)力（γ）。

2.2.3 不同質(zhì)量濃度的甘草酸凝膠的流變學(xué)性質(zhì)按“2.2.2”項下方法對不同質(zhì)量濃度的甘草酸凝膠進行穩(wěn)態(tài)流變實驗，分別得到各凝膠的黏度-剪切速率曲線及γ-剪切速率曲線。利用Power Law、Herschel-Bulkley、Casson、Carreau/Yasuda、Cross 5種常用的流變學(xué)模型對各甘草酸凝膠的流變曲線進行擬合，根據(jù)各模型對不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠流變參數(shù)擬合的流變曲線決定系數(shù)（R）的平均值，選擇最佳的流變學(xué)模型對凝膠性質(zhì)進行分析[12]，各模型擬合結(jié)果如表1 所示，Cross 模型擬合的R值最大，擬合效果最佳，因此，選擇Cross 模型對甘草酸凝膠的流變學(xué)行為進行分析。

表1 常用流變學(xué)模型及擬合情況Table 1 Common rheological models and fitting

η0是指物料在接近于零的剪切速率下表現(xiàn)為黏性流體特征時所具有的恒定不變的黏度，反映物料在未受到剪切作用時的黏度；η∞是指剪切速率趨于無窮大時物料的黏度。c是指凝膠受外力作用發(fā)生形變時，去除外力后恢復(fù)到原有結(jié)構(gòu)所需的時間。η0和c均與流體微觀結(jié)構(gòu)和分子間作用力有關(guān)，能夠反映凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中分子鏈間活性聯(lián)結(jié)點的密度和支鏈長度[13]。n能夠表征流體剪切稀化的程度，其值越大，流體剪切稀化的程度越小[14]。對不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的流動曲線進行Cross 模型擬合，擬合結(jié)果如表2 所示，當(dāng)甘草酸質(zhì)量濃度在5～60 mg/mL 時，甘草酸凝膠的η0和c隨甘草酸質(zhì)量濃度的提高而增大，表明甘草酸納米纖維延伸長度可能隨著甘草酸質(zhì)量濃度增加而延長，納米纖維活性聯(lián)結(jié)點數(shù)量更加密集，纏結(jié)程度提高，對甘草酸凝膠各層間發(fā)生相對位移具有阻礙作用。隨著甘草酸質(zhì)量濃度增大，甘草酸凝膠的η∞和n逐漸增大，剪切稀化能力減弱。

表2 不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的穩(wěn)態(tài)流動特性Table 2 Steady flow characteristics of glycyrrhizic acid gel with different concentrations

在錐板旋轉(zhuǎn)剪切過程中，50、60 mg/mL 的甘草酸凝膠出現(xiàn)一定程度的失水現(xiàn)象，發(fā)生相分離。不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的γ、黏度隨剪切速率變化的曲線如圖1 所示，甘草酸質(zhì)量濃度為5～40 mg/mL時，各質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的γ均隨剪切速率的不斷增大而增大；當(dāng)甘草酸質(zhì)量濃度為50～60 mg/mL時，隨著剪切速率的增大，同一甘草酸凝膠的γ先增大后減小，推測其γ的減小與該質(zhì)量濃度凝膠實驗過程中的相分離現(xiàn)象有關(guān)，可能是由于剪切速率大于某一臨界值后，甘草酸凝膠結(jié)構(gòu)突然破壞導(dǎo)致的[15]。在測試的剪切速率范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的黏度均隨剪切速率的增大而減小，即發(fā)生剪切稀化；任一剪切速率下，甘草酸凝膠的黏度隨甘草酸質(zhì)量濃度的增大而增大。

圖1 不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的黏度 (A) 和γ (B) 隨剪切速率變化曲線Fig. 1 Curves of viscosity (A) and γ (B) of glycyrrhizic acid gel with different concentrations versus shear rate

按“2.2.1”項下方法對不同質(zhì)量濃度的甘草酸凝膠進行應(yīng)變掃描實驗，得到不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的G′、G″，結(jié)果如圖2-A 所示。在凝膠的應(yīng)變掃描曲線中，曲線上平臺區(qū)對應(yīng)的模量值為平臺模量，其大小與凝膠微觀結(jié)構(gòu)中納米纖維間的纏結(jié)密度呈正比[16]。

圖2 不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠G′或G″ (A) 和損耗系數(shù) (B)隨應(yīng)變變化曲線Fig. 2 Curves of G′ or G″ (A) and loss coefficient (B) of glycyrrhizic acid gel with different concentrations changing with strain

損耗系數(shù)是流體的G″與G′的比值，當(dāng)損耗系數(shù)小于1 時，主要表現(xiàn)出彈性行為，當(dāng)損耗系數(shù)大于1 時，流體主要表現(xiàn)出黏性行為[17]。由應(yīng)變掃描結(jié)果可知，當(dāng)甘草酸質(zhì)量濃度不斷增大時，甘草酸凝膠的G′與G″均不斷增大，表明隨質(zhì)量濃度增大甘草酸凝膠的黏彈性變強，甘草酸凝膠微觀結(jié)構(gòu)中納米纖維間的物理聯(lián)結(jié)點密度增大，這與不同質(zhì)量濃度甘草酸η0所反映的變化趨勢相一致。

不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的損耗系數(shù)隨應(yīng)變值的變化曲線如圖2-B 所示，甘草酸質(zhì)量濃度在20～60 mg/mL 時，隨著甘草酸質(zhì)量濃度的增大，甘草酸凝膠損耗系數(shù)等于1 的應(yīng)變值，即甘草酸凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)楦什菟崛苣z的應(yīng)變值總體呈減小趨勢，凝膠的彈性性質(zhì)逐漸減弱。甘草酸質(zhì)量濃度在5～10 mg/mL時，可能由于凝膠剪切稀化作用強烈，受剪切后凝膠稀化為近溶液狀態(tài)，因此，在同一測試條件下測得的損耗系數(shù)波動較大，導(dǎo)致其與較高質(zhì)量濃度甘草酸凝膠變化規(guī)律相反。

2.2.4 不同pH 值對甘草酸凝膠流變學(xué)性質(zhì)的影響按“2.2.2”項下方法對不同pH 值溶劑制備得到的甘草酸凝膠進行穩(wěn)態(tài)流變實驗和Cross 模型擬合，結(jié)果如表3 所示。隨著pH 值的增大，甘草酸凝膠的η0和c不斷減小，提示甘草酸凝膠體系中納米纖維間的聯(lián)結(jié)點密度及支鏈長度隨pH值增大而減小，這可能是由于甘草酸分子中存在大量羧基，其pKa值分別為pKa1＝3.98、pKa2＝4.62、pKa3＝5.17[18]，當(dāng)分散介質(zhì)pH 值小于羧基的pKa時，發(fā)生解離的羧基數(shù)目少；隨著分散介質(zhì)pH 值增大，發(fā)生解離的羧基數(shù)目大大增加，有效電荷密度提高，導(dǎo)致甘草酸分子間氫鍵減弱，靜電斥力增強，從而導(dǎo)致凝膠的η0降低，c縮短。而隨著分散介質(zhì)pH 值的增大，甘草酸凝膠的η∞和n也不斷減小，表明其剪切稀化特征逐漸增強。

表3 不同pH 值溶劑制得的甘草酸凝膠的穩(wěn)態(tài)流動特性Table 3 Steady flow characteristics of glycyrrhizic acid gel prepared with different pH solvents

不同pH 值溶劑制得的甘草酸凝膠的γ、黏度隨剪切速率變化的曲線如圖3 所示，隨著剪切速率的不斷增大，不同pH 值溶劑制得的甘草酸凝膠的γ均不斷增大。而在相同剪切速率下，溶劑pH 值為7時，制備得到的甘草酸凝膠γ最大，pH 值為3 或11時甘草酸凝膠的γ減小。不同pH 值甘草酸凝膠的黏度均隨著剪切速率的增大而減小。當(dāng)剪切速率小于0.13 s-1時，甘草酸凝膠的黏度大小為pH 3＞pH 11＞pH 7；當(dāng)剪切速率大于0.13 s-1且小于5.4 s-1時，甘草酸凝膠的黏度大小為pH 3＞pH 7＞pH 11；當(dāng)剪切速率大于5.4 s-1時，甘草酸凝膠的黏度大小為pH 7＞pH 3＞pH 11，總體來看pH 值對甘草酸凝膠的黏度影響較小。

圖3 不同pH 值溶劑制得的甘草酸凝膠的γ (A)、黏度 (B)隨剪切速率變化曲線Fig. 3 Curves of γ (A) and viscosity (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different pH solvents versus shear rate

按“2.2.1”項下方法對不同pH 值溶劑制得的甘草酸凝膠進行應(yīng)變掃描實驗，結(jié)果如圖4-A 所示，隨著pH 值的增大，甘草酸凝膠的初始平臺模量先增大后減小，提示在凝膠的微觀結(jié)構(gòu)中，納米纖維間的物理聯(lián)結(jié)點密度隨體系pH 值的增大先增大后減小。不同pH 值溶劑制得的甘草酸凝膠的損耗系數(shù)隨應(yīng)變值的變化曲線如圖4-B 所示，損耗系數(shù)隨著pH 值的增大表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，不同pH 值溶劑配制的甘草酸凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)楦什菟崛苣z的應(yīng)變值先減小后增大，表明隨著pH 值的增大甘草酸凝膠的彈性性質(zhì)先減小后增大。

圖4 不同pH 值溶劑制得的甘草酸凝膠G′或G″ (A) 和損耗系數(shù) (B) 隨應(yīng)變變化曲線Fig. 4 Curves of G′ or G″ (A) and loss coefficient (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different pH solvents versus strain

2.2.5 不同NaCl 質(zhì)量濃度對甘草酸凝膠力學(xué)性質(zhì)的影響 按“2.2.2”項下方法對不同質(zhì)量濃度NaCl溶液配制的甘草酸凝膠進行穩(wěn)態(tài)流變實驗和Cross模型擬合，結(jié)果如表4 所示。隨著體系中Na+質(zhì)量濃度的提高，甘草酸凝膠的η0和c不斷增大，這可能是由于Na+的靜電屏蔽效應(yīng)隨其質(zhì)量濃度的提高而增強，且Na+的存在抑制了甘草酸的電離，使得甘草酸分子間的靜電力斥力減小[19]，分子間作用力增強，η0增大。η∞和n也隨Na+質(zhì)量濃度的提高而增大，甘草酸凝膠的剪切稀化能力減弱。

表4 不同質(zhì)量濃度NaCl 溶液制得的甘草酸凝膠的穩(wěn)態(tài)流動特性Table 4 Steady flow characteristics of glycyrrhizic acid gel prepared with NaCl solution of different concentrations

在錐板旋轉(zhuǎn)剪切過程中，體系中NaCl 質(zhì)量濃度等于或高于5.0 mg/mL 的甘草酸凝膠出現(xiàn)一定程度的失水現(xiàn)象，發(fā)生相分離。不同質(zhì)量濃度NaCl 溶液制得的甘草酸凝膠γ、黏度隨剪切速率變化曲線如圖5 所示，隨著體系中Na+質(zhì)量濃度的提高，甘草酸凝膠獲得相同剪切速率所需的γ明顯增大。當(dāng)體系中NaCl 質(zhì)量濃度等于或高于5.0 mg/mL 時，同一甘草酸凝膠的γ隨剪切速率的增大首先發(fā)生驟降然后逐漸升高，表明此時甘草酸凝膠在γ作用下，具有明顯的脆性特征[20]，的增大首先發(fā)生驟降然后逐漸升高，表明此時甘草這與該凝膠在錐板旋轉(zhuǎn)剪切過程中失水發(fā)生相分離的現(xiàn)象相應(yīng)，說明當(dāng)體系中NaCl 質(zhì)量濃度等于或高于5.0 mg/mL 以上時，甘草酸凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)易被破壞，結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞后的甘草酸凝膠仍具有剪切稀化特征。

圖5 不同質(zhì)量濃度NaCl 溶液制得的甘草酸凝膠的γ (A)、黏度 (B) 隨剪切速率變化曲線Fig. 5 Curves of γ (A) and viscosity (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different concentrations of NaCl solution versus shear rate

按“2.2.1”項下方法對不同質(zhì)量濃度NaCl 溶液制得的甘草酸凝膠進行應(yīng)變掃描實驗，結(jié)果如圖6-A 所示，隨著Na+質(zhì)量濃度的提高，甘草酸凝膠的初始平臺模量顯著增大，說明在Na+存在下，甘草酸凝膠中納米纖維間活性聯(lián)結(jié)點數(shù)量明顯增加，但當(dāng)剪切應(yīng)變增大到某一臨界值時，G′與G″均驟減至10 kPa 以下，黏彈性突然降低，與穩(wěn)態(tài)流動實驗中甘草酸凝膠γ驟減的現(xiàn)象相符合。但溶劑中Na+質(zhì)量濃度對甘草酸凝膠驟降后的平臺模量無顯著影響，說明NaCl 的加入雖提高了甘草酸凝膠中活性聯(lián)結(jié)點的數(shù)量，但活性聯(lián)結(jié)點數(shù)量的增加對甘草酸凝膠在外力作用下的抗形變能力和發(fā)生形變后的黏彈性沒有明顯影響，而使凝膠的脆性增大，趨近于固體性質(zhì)。不同質(zhì)量濃度NaCl 溶液制得的甘草酸凝膠的損耗系數(shù)隨應(yīng)變值的變化曲線如圖6-B 所示，由于體系中NaCl 的存在，甘草酸凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z的應(yīng)變值有所減小，即凝膠彈性減弱。且隨著Na+質(zhì)量濃度的提高，甘草酸凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z的應(yīng)變值先減小后增大，表明甘草酸凝膠的彈性性質(zhì)在0.5～5.0 mg/mL 逐漸減弱，在5.0～8.6 mg/mL 逐漸增強，且在凝膠制備過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液中NaCl 質(zhì)量濃度等于或高于5.0 mg/mL 時，甘草酸凝膠不再澄清，宏觀抗形變能力明顯增強。

圖6 不同質(zhì)量濃度NaCl 溶液制得的甘草酸凝膠G′或G″(A) 和損耗系數(shù) (B) 隨應(yīng)變變化曲線Fig. 6 Curves of G′ or G″ (A) and loss coefficient (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with NaCl solution of different concentrations versus strain

2.2.6 不同CaCl2質(zhì)量濃度對甘草酸凝膠力學(xué)性質(zhì)的影響 按“2.2.2”項下方法對不同質(zhì)量濃度CaCl2水溶液配制的甘草酸凝膠進行穩(wěn)態(tài)流變實驗和Cross 模型擬合，結(jié)果如表5 所示，溶劑中加入CaCl2后甘草酸凝膠的η0顯著增大，但隨著CaCl2質(zhì)量濃度的提高，甘草酸凝膠η0逐漸降低，這可能是由于Ca2+質(zhì)量濃度的提高，在其所產(chǎn)生的靜電屏蔽效應(yīng)和配位鍵共同作用下，甘草酸納米纖維內(nèi)部分子締合作用增強，導(dǎo)致甘草酸納米纖維的延伸受到抑制并發(fā)生卷曲閉合[21]。隨著Ca2+質(zhì)量濃度的提高，甘草酸凝膠的c縮短，n增大，剪切稀化能力減小。同時，隨著Ca2+質(zhì)量濃度的提高，η∞增大，表明η∞與η0的變化趨勢不一定相同。

表5 不同質(zhì)量濃度CaCl2 溶液制得的甘草酸凝膠的穩(wěn)態(tài)流動特性Table 5 Steady flow characteristics of glycyrrhizic acid gel prepared with CaCl2 solution of different concentrations

不同質(zhì)量濃度CaCl2溶液制得的甘草酸凝膠的γ、黏度隨剪切速率變化曲線如圖7 所示，隨著體系中Ca2+質(zhì)量濃度的提高，甘草酸凝膠獲得相同剪切速率所需的γ增大，凝膠的黏度隨Ca2+質(zhì)量濃度的提高而增大。

圖7 不同質(zhì)量濃度CaCl2 溶液制得的甘草酸凝膠的γ (A)、黏度 (B) 隨剪切速率變化曲線Fig. 7 Curves of γ (A) and viscosity (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different concentrations of CaCl2 solution versus shear rate

按“2.2.1”項下方法對不同質(zhì)量濃度CaCl2溶液制得的甘草酸凝膠進行應(yīng)變掃描實驗，結(jié)果如圖8-A 所示，隨著CaCl2質(zhì)量濃度的提高，甘草酸凝膠的初始平臺模量增大，可能是由于Ca2+促進甘草酸凝膠中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，能夠增加甘草酸納米纖維間活性聯(lián)結(jié)點的數(shù)量。不同質(zhì)量濃度CaCl2溶液制得的甘草酸凝膠的損耗系數(shù)隨應(yīng)變值的變化曲線如圖8-B 所示，體系中Ca2+的存在使得甘草酸凝膠向溶膠轉(zhuǎn)變的應(yīng)變值顯著減小，凝膠的彈性明顯降低，且隨著Ca2+質(zhì)量濃度的增大，體系由凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z的應(yīng)變值減小，表明甘草酸凝膠的彈性性質(zhì)在0.1～0.2 mg/mL 減弱。

圖8 不同質(zhì)量濃度CaCl2 溶液制得的甘草酸凝膠G′或G″(A) 和損耗系數(shù) (B) 隨應(yīng)變變化曲線Fig. 8 Curves of G′ or G″ (A) and loss coefficient (B) of glycyrrhizic acid gel prepared with different concentrations of CaCl2 solution versus strain

2.3 HPLC 法測定甘草酸含量

2.3.1 甘草酸對照品溶液的制備 精密稱取甘草酸對照品適量，加70%乙醇制得質(zhì)量濃度為150.80 μg/mL 的甘草酸對照品母液，取不同體積甘草酸對照品母液加70%乙醇稀釋得質(zhì)量濃度分別為75.40、37.70、18.85、9.42、4.71、2.36 μg/mL 的甘草酸對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

（1）甘草酸凝膠供試品溶液：取甘草酸凝膠于60 ℃下攪拌溶解得甘草酸溶膠，取甘草酸溶膠0.2 mL 于50 mL 量瓶中，滴加甲醇至刻度線并混勻，即得。

（2）甘草酸凝膠釋放供試品溶液：取甘草酸凝膠釋放介質(zhì)1 mL，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge Shield RP18C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～100%乙腈；36～40 min，100%～19%乙腈；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長237 nm；理論塔板數(shù)均大于370 000。

2.3.4 專屬性考察 取甘草酸凝膠、甘草酸凝膠釋放樣品按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，與“2.3.1”項下甘草酸對照品母液、70%乙醇溶液、甲醇、PBS 緩沖液分別按“2.3.3”項下色譜條件進樣分析，考察該方法的專屬性，結(jié)果如圖9 所示。結(jié)果表明，各樣品溶液的出峰時間與甘草酸對照品溶液相同，峰形均良好，且未見雜峰，表明該方法專屬性良好。

圖9 甘草酸的專屬性考察Fig. 9 Specificity investigation of glycyrrhizic acid

2.3.5 線性關(guān)系考察 按“2.3.1” 項下方法制備不同濃度甘草酸對照品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定甘草酸峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.086X－0.339，R2＝0.999，表明甘草酸在2.36～150.80 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度考察 取“2.3.1” 項下甘草酸對照品母液按“2.3.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次測定甘草酸峰面積，計算RSD 值為0.89%，表明該儀器精密度符合實驗要求。

2.3.7 重復(fù)性考察 按“2.3.2”項下方法平行制備6 份甘草酸凝膠供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定甘草酸峰面積，計算RSD 值為0.09%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性考察 取同一甘草酸凝膠釋放供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、16、24 h 時按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定甘草酸峰面積，計算RSD 值為0.45%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收率考察 按“2.3.2”項下方法制備甘草酸溶膠，取甘草酸溶膠0.2 mL 于50 mL 量瓶中，加入200 μg/mL 甘草酸對照品溶液30 mL，滴加甲醇至刻度線得甘草酸加樣回收率供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定甘草酸峰面積，計算甘草酸平均加樣回收率為98.37%，RSD 值為0.96%，表明該方法加樣回收率符合實驗要求。

2.4 甘草酸凝膠的釋放特性研究

分別制備5、10、30 mg/mL 甘草酸凝膠，取不同體積的含甘草酸45 mg 的各甘草酸凝膠于截留相對分子質(zhì)量3500 的透析袋中，取pH 7.4 PBS 緩沖液片劑5 片溶于500 mL 純凈水制得PBS 緩沖液。以pH 7.4 PBS 緩沖液為釋放介質(zhì)，置于37 ℃恒溫水浴搖床以100 r/min 振搖，分別于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、18、24、36、72、96 h 吸取1 mL 釋放介質(zhì)，同時向釋放介質(zhì)中補足等溫等體積的空白釋放介質(zhì)，按“2.3.3”項下色譜條件測定釋放介質(zhì)中甘草酸含量；另取各質(zhì)量濃度甘草酸凝膠按“2.3.2”項下方法制備甘草酸凝膠供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件測定甘草酸凝膠中甘草酸總含量，計算各時間點甘草酸凝膠的累積釋放率，繪制釋放曲線圖。不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的釋放情況如圖10 所示，不同質(zhì)量濃度的甘草酸凝膠達(dá)到釋放平衡的時間無明顯差別，由此可見，甘草酸質(zhì)量濃度的提高雖然能夠增大甘草酸凝膠中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的密度及纏結(jié)程度，但對于其達(dá)到累積釋放平衡的時間無影響。30 mg/mL 甘草酸凝膠的釋放速率較5、10 mg/mL 甘草酸凝膠的釋放速率小，達(dá)到釋放平衡階段時的累積釋放率隨著甘草酸凝膠質(zhì)量濃度的增大而減小。這可能是高質(zhì)量濃度使甘草酸在透析袋中形成了在實驗時間內(nèi)無法分解釋放的納米纖維。

圖10 不同質(zhì)量濃度甘草酸凝膠的釋放曲線 (±s, n = 3)Fig. 10 Release curve of glycyrrhizic acid gel with different concentrations (±s, n = 3)

2.5 HPLC 法測定橙皮苷含量

2.5.1 橙皮苷對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制得質(zhì)量濃度為120.00 μg/mL 的橙皮苷對照品母液，取不同體積橙皮苷對照品母液加甲醇稀釋得質(zhì)量濃度分別為60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.00 μg/mL 的橙皮苷對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備

（1）橙皮苷水溶液供試品溶液：取橙皮苷60 ℃水溶液/室溫飽和水溶液/混懸液0.2 mL 于10 mL 量瓶中，滴加甲醇至刻度線并混勻，即得。

（2）橙皮苷-甘草酸凝膠供試品溶液：取橙皮苷-甘草酸凝膠于60 ℃下攪拌溶解得橙皮苷-甘草酸溶膠，取橙皮苷-甘草酸溶膠0.2 mL 于10 mL 量瓶中，滴加甲醇至刻度線并混勻，即得。

（3）橙皮苷釋放供試品溶液：取橙皮苷室溫飽和水溶液/橙皮苷-甘草酸凝膠釋放介質(zhì)1 mL，即得。

2.5.3 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge Shield RP18C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（25∶75），等度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長284 nm；理論塔板數(shù)均大于7000。

2.5.4 專屬性考察 取橙皮苷室溫飽和水溶液、橙皮苷-甘草酸凝膠釋放樣品按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，與“2.5.1”項下橙皮苷對照品母液、甲醇、PBS 緩沖液分別按“2.5.3”項下色譜條件進樣分析，考察該方法的專屬性，結(jié)果如圖11 所示。結(jié)果表明，各樣品溶液的出峰時間與橙皮苷對照品溶液相同，峰形均良好，且未見雜峰，表明該方法專屬性良好。

圖11 橙皮苷的專屬性考察Fig. 11 Specificity investigation of hesperidin

2.5.5 線性關(guān)系考察 按“2.5.1”項下方法制備不同濃度橙皮苷對照品溶液，按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定橙皮苷峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.253X－0.031，R2＝0.999，結(jié)果表明橙皮苷在1.00～60.00 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.5.6 精密度考察 取“2.5.1”項下橙皮苷對照品母液按“2.5.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次測定橙皮苷峰面積，計算RSD 值為0.27%，表明該儀器精密度符合實驗要求。

2.5.7 重復(fù)性考察 按“2.5.2”項下方法平行制備6 份橙皮苷-甘草酸凝膠供試品溶液，按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定橙皮苷峰面積，計算RSD 值為0.26%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 穩(wěn)定性考察 取同一橙皮苷-甘草酸凝膠釋放供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、16、24 h 時按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定橙皮苷峰面積，計算RSD 值為0.65%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.5.9 加樣回收率考察 按“2.5.2”項下方法制備橙皮苷-甘草酸溶膠，取橙皮苷-甘草酸溶膠0.2 mL于10 mL 量瓶中，加入100 μg/mL 橙皮苷對照品溶液0.25 mL，滴加甲醇至刻度線得橙皮苷加樣回收率供試品溶液，按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定橙皮苷峰面積，計算橙皮苷的平均加樣回收率為97.81%，RSD 值為1.22%，表明該方法加樣回收率符合實驗要求。

2.6 甘草酸凝膠對橙皮苷的增溶效果考察

2.6.1 橙皮苷-甘草酸凝膠的制備 精密稱取橙皮苷20 mg、甘草酸100 mg 于10 mL 水中，在60 ℃水浴下緩慢攪拌，溶解20 min，于6475×g離心5 min，取上清液于室溫靜置12 h 凝固，即得。

2.6.2 橙皮苷室溫飽和水溶液的制備 精密稱取橙皮苷20 mg 于10 mL 水中，在室溫攪拌溶解24 h，將過飽和橙皮苷懸液過0.45 μm 濾膜，即得。

2.6.3 橙皮苷60 ℃水溶液的制備 精密稱取橙皮苷20 mg 于10 mL 水中，在60 ℃水浴下緩慢攪拌溶解20 min，恢復(fù)至室溫后，將過飽和橙皮苷懸液過0.45 μm 濾膜，即得。

2.6.4 不同溶解條件橙皮苷溶解能力的測定 取“2.6.1”項下橙皮苷-甘草酸凝膠、“2.6.2”項下橙皮苷室溫飽和水溶液、“2.6.3”項下橙皮苷60 ℃水溶液按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定不同溶解條件下橙皮苷的溶解能力。實驗結(jié)果（表6）表明，橙皮苷-甘草酸凝膠中橙皮苷溶解度最高，為橙皮苷室溫平衡溶解度的5.91 倍，為60 ℃水浴20 min 溶解度的1.87 倍，表明甘草酸凝膠對橙皮苷具有一定的增溶作用，增溶的機制可能包括由甘草酸分子疏水基團朝內(nèi)、親水基團朝外所形成的中空納米纖維為橙皮苷提供了較大的疏水性結(jié)構(gòu)域，或甘草酸與橙皮苷形成主客體復(fù)合物從而提高橙皮苷的溶解度，除此之外，當(dāng)甘草酸濃度達(dá)到臨界膠束濃度以上時能夠形成膠束，膠束能夠通過包裹作用提高疏水性藥物橙皮苷的溶解度。

表6 橙皮苷溶解能力 (±s, n = 3)Table 6 Solubility of hesperidin (±s, n = 3)

表6 橙皮苷溶解能力 (±s, n = 3)Table 6 Solubility of hesperidin (±s, n = 3)

組別 溶解度/(μg·mL-1)常溫平衡24 h 21.47±1.10 60 ℃水浴20 min 67.84±2.22橙皮苷-甘草酸凝膠 126.95±2.83

2.7 橙皮苷-甘草酸凝膠中橙皮苷釋放特性考察

2.7.1 橙皮苷混懸液的制備 精密稱取12.70 mg橙皮苷于100 mL 純凈水中，室溫攪拌溶解24 h 得127.00 μg/mL 橙皮苷混懸液。

2.7.2 橙皮苷溶液 精密稱取12.70 mg 橙皮苷于10 mL 甲醇中溶解制得10 倍量橙皮苷甲醇母液，取橙皮苷甲醇母液2 mL 加純凈水稀釋至20 mL 得127.00 μg/mL 橙皮苷溶液。

2.7.3 不同形式橙皮苷釋放差異考察 分別取“2.6.1”項下橙皮苷-甘草酸凝膠、“2.7.1”項下橙皮苷混懸液、2.7.2”項下橙皮苷溶液1 mL 于截留相對分子質(zhì)量3500 的透析袋中，以100 mL pH 7.4 的PBS 為釋放介質(zhì)，置于37 ℃恒溫水浴搖床以100 r/min 振搖，分別于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、10、12、24、48 h 吸取1 mL 釋放介質(zhì)，同時向釋放介質(zhì)中補足等溫等體積的空白釋放介質(zhì)，按“2.5.3”項下色譜條件測定釋放介質(zhì)中橙皮苷含量；另取橙皮苷-甘草酸凝膠、橙皮苷混懸液、橙皮苷溶液按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下色譜條件測定各樣品中橙皮苷總含量，計算各時間橙皮苷-甘草酸凝膠中橙皮苷的累積釋放率，繪制釋放曲線圖，結(jié)果如圖12 所示。等體積、等含藥量的橙皮苷溶液、橙皮苷-甘草酸凝膠達(dá)到釋放平衡的累積釋放率相近，而橙皮苷混懸液釋放緩慢且平衡釋放率低于30%，橙皮苷-甘草酸凝膠和橙皮苷溶液釋放速率快且平衡釋放率遠(yuǎn)高于橙皮苷混懸液；相較于橙皮苷溶液，橙皮苷-甘草酸凝膠具有明顯的緩釋作用。因此，橙皮苷-甘草酸凝膠能夠顯著改善橙皮苷分散性能，改善其釋放率低的特點，并相較于橙皮苷溶液能夠發(fā)揮一定程度的緩釋作用。

圖12 橙皮苷溶液、橙皮苷混懸液、橙皮苷-甘草酸凝膠釋放曲線 (±s, n = 3)Fig. 12 Release curve of hesperidin solution, hesperidin suspension and hesperidin-glycyrrhizic acid gel (±s, n = 3)

3 討論

基于自身分子結(jié)構(gòu)的兩親性，甘草酸在水中能夠通過分子間氫鍵及π-π 堆積作用形成螺旋狀的甘草酸納米纖維并進一步纏結(jié)形成甘草酸凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[22]，凝膠的流變學(xué)性質(zhì)是分子間作用力和微觀結(jié)構(gòu)中納米纖維間纏結(jié)程度的宏觀表現(xiàn)。甘草酸分子中多個羥基及羧基的存在使得甘草酸分子間非共價鍵相互作用靈活多變，從而形成具有不同性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的自組裝體[23]。自組裝體大多數(shù)由氫鍵及靜電力驅(qū)動形成，因此pH 值、離子強度等客觀條件對自組裝體的形成具有重要影響。pH 值對甘草酸分子間氫鍵、靜電力相互作用具有顯著影響，表現(xiàn)為甘草酸溶解度的pH 值依賴性及其在不同pH 值的溶劑中的不同聚集形式。Matsuoka 等[24]研究表明，濃度為5 mmol/L 的甘草酸能夠在pH 5 的溶劑中形成半徑和長度分別為1.5 nm 和21 nm 的桿狀膠束，在pH 7 的溶劑中則以單體形式存在，而金屬離子能夠通過其靜電屏蔽效應(yīng)及配位鍵影響水凝膠的流變學(xué)性質(zhì)。

流變學(xué)研究中，η0能夠反映凝膠未受剪切作用時所具有的真實黏度，γ側(cè)面反映凝膠受到剪切作用時的強度。平臺模量與凝膠纖維網(wǎng)絡(luò)間的纏結(jié)密度呈正比，G′和G″的絕對大小反映凝膠的流動性，而損耗系數(shù)則能夠反應(yīng)凝膠的彈性和軟硬程度。該研究結(jié)果表明，甘草酸凝膠的黏度、強度和彈性對凝膠中甘草酸質(zhì)量濃度、溶劑pH 值、離子種類、離子質(zhì)量濃度的變化敏感，且實驗證明了甘草酸凝膠對模型藥物橙皮苷的增溶及緩釋作用，基于此，甘草酸凝膠有望作為藥物載體用于外用制劑或新型遞藥系統(tǒng)的開發(fā)。在實際應(yīng)用中，則需結(jié)合給藥方法和生理狀況，對甘草酸用量、溶劑pH 值或離子組成進行考察與選擇，使甘草酸凝膠具備符合應(yīng)用條件的黏度、彈性和強度。本研究豐富了甘草酸凝膠流變學(xué)性質(zhì)的現(xiàn)有認(rèn)識，為甘草酸在藥學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了更堅實的理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突