牛耳朵全草中化學(xué)成分及其生物活性研究

楊麗媛，王朝陽，陳俊磊，邱玨琳，杜彩霞，魏英煥，郝小江,4*，顧 瑋*

1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014

2. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014

3. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025

4. 中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201

牛耳朵Primulinaeburnea(Hance) Y. Z. Wang是苦苣苔科（Gesneriaceae）報(bào)春苣苔屬PrimulinaHance 植物牛耳朵的全草。別名為巖白菜、石三七、石虎耳等，主產(chǎn)于貴州、廣西、廣東、湖南、湖北、四川等地。在《貴州民族常用天然藥物》記載，牛耳朵根莖或全草入藥，具有清肺止咳、涼血止血、解毒等功效，主要用于治療陰虛肺熱、咳嗽咯血、崩漏、帶下、癰腫瘡毒、外傷出血等癥[1]。對牛耳朵的化學(xué)成分研究報(bào)道較少，目前僅有對于廣西產(chǎn)牛耳朵的化學(xué)成分的研究報(bào)道，共從中鑒定27 個化合物，主要涉及苯乙醇苷類、醌類、黃酮類以及萜類等類型[2-8]。初步藥理學(xué)研究表明其有抗腫瘤、抗菌、降壓和抗氧化等作用[9-10]，藥理活性篩選主要針對牛耳朵乙醇提取物，且對單體化合物的藥理活性研究較少。研究證明牛耳朵中的部分化合物尤其是蒽醌類化合物對人肺癌細(xì)胞株SPC-A1 有一定的細(xì)胞毒活性和顯著的DPPH 自由基清除活性[4-5]。目前尚未見到對黔產(chǎn)牛耳朵進(jìn)行化學(xué)成分研究。因此本研究擬對黔產(chǎn)牛耳朵的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)的分離鑒定，并重點(diǎn)對其體外細(xì)胞毒活性和抗氧化活性進(jìn)行研究。

從牛耳朵醋酸乙酯萃取部位中共分離23 個化合物，分別鑒定為 1,6-dihydroxy-7-methoxy-2-methylanthr-quinone （ 1 ）、 soranjidiol （ 2 ）、1,4,7-trihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone（3）、digiferruginol（4）、1,4-dihydroxy-2-hydroxymethyl-9,10-anthraquinone（5）、1,6,7-trihydroxy-2-methyl-9,10-anthracenedione （ 6 ）、 (R)-7,8-dihydroxy-αdunnione （ 7 ）、 3-amino-2-methoxycarbonyl-1,4-naphthoquinone（8）、木犀草素（luteoline，9）、異落葉松脂素 [(+)-isolariciresinol，10]、七葉內(nèi)酯（esculetin，11）、酪醇（tyrosol，12）、對香豆酸（p-coumaric acid，13）、咖啡酸甲酯（caffeic acid methy ester，14）、benzylO-β-D-glucopyranoside（ 15 ）、 4-O-benzyl-D-glucopyranoside （ 16 ）、3,4-dihydroxyphenylethyl alcohol 8-O-β-glucopyrnoside（17）、cuneataside A（18）、對羥基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde，19）、尼泊金甲酯（methyl-4-hydroxybenzoate，20）、對羥基苯乙酮[1-(4-hydroxyphenyl)-ethanone ， 21] 、 香 草 醛（vanillin，22）、香草酸（vanillic acid，23）。其中，化合物16 為新天然產(chǎn)物?；衔?～3、6 和8～22為首次從報(bào)春苣苔屬植物中分離得到。進(jìn)一步對分離得到化合物采用MTT 法篩選對人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性；采用DPPH 法和ABTS法篩選其體外抗氧化活性。

1 材料與儀器

柱色譜硅膠（40～80、200～300、300～400 目）和薄層柱色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20 凝膠（Pharmacia 公司，美國）；HITACHI 高效液相色譜儀（Primaide，日立高新技術(shù)集團(tuán)，日本）；反相填充材料RP-18（Merck 公司，德國）；HPLC 色譜柱為Zorbax SB-C18（半制備柱，250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷倫公司，美國）；EYELA OSB-2200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社，日本）；INOVA-600MHz 核磁共振波譜儀（Bruker 公司，德國）；HP 1100 型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（惠普公司，美國）；API Qstar Pulsar 質(zhì)譜儀BioTek Epoch 全波長酶標(biāo)儀（BioTek 公司，美國）。本實(shí)驗(yàn)所用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑均為工業(yè)級，重蒸后使用；色譜級的甲醇（云南新藍(lán)景化學(xué)工業(yè)有限公司）；氘代試劑（美國Cambridge Isotope Laboratories 公司）。人肺癌細(xì)胞A549 來源于ATCC。L-抗壞血酸（VC）購于上海麥克林生化科技有限公司；水溶性維生素E（VE）購于上海源葉生物科技有限公司。

牛耳朵全草于2021年3月采自貴州省安順市紫云苗族布依族自治縣巖上村，經(jīng)貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室顧瑋副研究員鑒定為牛耳朵P.eburnea(Hance) Y. Z. Wang，憑證標(biāo)本（GZCNP-G-2021-003）保存在貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 提取與分離

牛耳朵干燥全草30 kg 粉碎后過40 目篩，之后用80%甲醇水溶液加熱回流提取6 次（每次3 h）過濾，合并濾液，減壓濃縮得提取物浸膏（2.9 kg），用適量的水溶解浸膏成懸濁液，依次用石油醚，醋酸乙酯和正丁醇萃取至無色，減壓濃縮各部分萃取液得到石油醚部位（505.0 g）、醋酸乙酯部位（210.0 g）和正丁醇部位（1.1 kg）。將醋酸乙酯部位（210.0 g）用硅膠柱色譜（40～80 目）進(jìn)行分離，洗脫溶劑為石油醚-醋酸乙酯（50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1）及三氯甲烷-甲醇（20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1），結(jié)合TLC 檢測，將牛耳朵醋酸乙酯層分離得到9 個組分（Fr. A～I(xiàn)）。Fr. D（16.0 g）用硅膠柱色譜（200～300 目）進(jìn)行分離，石油醚-醋酸乙酯（20∶1～2∶1）梯度洗脫得到Fr. D.1～D.6。Fr. D.4（1.7 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜得到化合物2（10.8 mg）和3（3.4 mg）。Fr. D.4.4（215.7 mg）經(jīng)半制備RP-HPLC（甲醇-水-甲酸40∶60∶0.04，2.0 mL/min）得到化合物19（15.2 mg，tR＝13.6 min）、20（2.4 mg，tR＝26.7 min）和22（16 mg，tR＝28.5 min）。Fr. D.5（1.8 g）在濾出不溶性粉末（Fr. D.5a）后經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜得到化合物1（8.1 mg）、4（4.1 mg）和21（15.9 mg）。Fr. D.5a（272.0 mg）先用硅膠柱色譜（200～300 目）進(jìn)行分離，石油醚-醋酸乙酯（30∶1～20∶1）梯度洗脫，后經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜得到化合物5（22.3 mg）。Fr. E（5.4 g）用硅膠柱色譜（200-300目）進(jìn)行分離，石油醚-醋酸乙酯（10∶1～1∶1）梯度洗脫得到Fr. E.1～E.4。Fr. E.3（2.5 g）用硅膠柱色譜（200～300 目）進(jìn)行分離，三氯甲烷-醋酸乙酯（200∶1～10∶1）梯度洗脫得到化合物8（4.8 mg）、12（24.7 mg）、13（42 mg）和23（31 mg）。Fr. F（22.3 g）先經(jīng)RP-C18柱色譜，甲醇-水（20∶80～100∶0）洗脫得到Fr. F.1～F.14。Fr. F.8 經(jīng)重結(jié)晶得到化合物9（15.4 mg）。Fr. G（15.9 g）用RP-C18反相柱色譜，甲醇-水（10∶90～100∶0）洗脫得到Fr. G.1～G.9。Fr. G.2（590.0 mg）先用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，后經(jīng)硅膠柱色譜（200～300目）分離，三氯甲烷-甲醇（60∶1～20∶1）洗脫得到化合物11（7 mg）。Fr. G.3（2.5 g）用硅膠柱色譜（200～300 目）進(jìn)行分離，三氯甲烷-甲醇（100∶1～2∶1）洗脫得到Fr. G.3. 1～G.3. 7。Fr. G.3. 4（93.0 mg）經(jīng)半制備RP-HPLC（甲醇-水-甲酸30∶70∶0.04，2.0 mL/min）純化得到化合物10（59 mg，tR＝51.6 min）。Fr. G.3. 6（817 mg）用硅膠柱色譜（200～300目）進(jìn)行分離，三氯甲烷-丙酮（20∶1～1∶1）得到化合物14（4 mg）。Fr. G.3. 7（547.0 mg）經(jīng)半制備RP-HPLC（甲醇-水-甲酸35∶65∶0.04，2.0 mL/min）得到化合物15（6.7 mg，tR＝41.4 min）和16（8.3 mg，tR＝89 min）。Fr. G.6（967 mg）用硅膠柱色譜（200～300 目）進(jìn)行分離，三氯甲烷-甲醇（100∶1～5∶1）洗脫得到化合物6（20 mg）。Fr. H（72.7 g）用RP-C18柱色譜，甲醇-水（10∶90～100∶0）洗脫得到Fr. H.1～H.9。Fr. H.3（11.9 g）用硅膠柱色譜（200～300 目）進(jìn)行分離，三氯甲烷-甲醇（15∶1～1∶1）洗脫得到Fr. H.3. 1～H.3. 5。Fr. H.3. 5（8.4 g）用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離得到化合物17（2.3 mg）和18（7.3 mg）。Fr. H.7（670 mg）用硅膠柱色譜（200～300 目）進(jìn)行分離，石油醚-醋酸乙酯（8∶1～1∶1）洗脫得到化合物7（15 mg）。

2.2 細(xì)胞毒活性篩選

2.2.1 A549 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549 細(xì)胞復(fù)蘇后，用含有10% FBS 血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)生長，于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 MTT 法檢測牛耳朵化學(xué)成分對A549 的細(xì)胞毒活性 該實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[11]稍加修改，取對數(shù)生長期的非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種到無菌的96 孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度化合物溶液。培養(yǎng)48 h 后，每孔分別加入MTT（5 mg/mL）溶液10 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，充分震蕩后溶解結(jié)晶，之后用酶標(biāo)儀在490 nm 波長下檢測各孔吸光度（A）值，按照下面公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對于在質(zhì)量濃度100 μg/mL下抑制率大于50%的化合物繼續(xù)進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

2.3 抗氧化活性篩選

本研究分別用DPPH 方法和ABTS 方法對化合物的抗氧化活性進(jìn)行篩選。DPPH 自由基清除活性研究參考本課題組前期報(bào)道的方法[12]。ABTS+自由基清除活性實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[13]。取7 mmol/L 的 ABTS+與 2.6 mmol/L 的過硫酸鉀（K2S2O8）溶液等體積混合均勻后室溫避光靜置過夜，臨用前用甲醇溶液將ABTS+儲備液進(jìn)行稀釋，使其A值在734 nm 下為0.70±0.02，制成ABTS工作液。將不同質(zhì)量濃度（30、10、3.333 3、1.111 1、0.370 3、0.123 4 μg/mL）的樣品溶液添加到稀釋的ABTS+溶液中，混勻，避光反應(yīng)6 min 后，用酶標(biāo)儀在734 nm 下測定A值。以ABTS+工作液與無水甲醇溶液混合作為背景組（A0）。以VE 為陽性藥，所有測定均平行重復(fù)3 次，計(jì)算IC50值?；衔飳BTS+自由基的清除率可按照公式計(jì)算得出。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，分子式C16H12O5，ESI-MSm/z: 285 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:7.51 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-3), 7.58 (1H, d,J= 7.5 Hz,H-4), 7.50 (1H, s, H-5), 7.48 (1H, s, H-8), 2.25 (3H, s,-CH3), 3.95 (3H, s, -OCH3), 12.87 (1H, s, 1-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 159.8 (C-1), 133.5(C-2), 136.9 (C-3), 114.7 (C-4), 131.2 (C-4a), 118.4(C-5), 152.9 (C-6), 153.4 (C-7), 108.9 (C-8), 126.6(C-8a), 188.1 (C-9), 112.1 (C-9a), 180.6 (C-10), 127.4(C-10a), 15.7 (-CH3), 56.0 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[14]，鑒定化合物1 為1,6-dihydroxy-7-methoxy-2-methylanthr-quinone。

化合物2：橙黃色粉末，分子式C16H12O5，ESI-MSm/z: 253 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.54 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-3), 7.62 (1H,d,J= 7.6 Hz, H-4), 7.48 (1H, d,J= 2.5 Hz, H-5), 7.22(1H, dd,J= 2.5, 8.5 Hz, H-7), 8.02 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-8), 2.26 (3H, s, -CH3), 12.74 (1H, s, 1-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 159.7 (C-1), 133.1(C-2), 137.2 (C-3), 118.2 (C-4), 130.9 (C-4a), 111.8(C-5), 162.9 (C-6), 125.0 (C-7), 129.6 (C-8), 121.8(C-8a), 188.4 (C-9), 114.8 (C-9a), 180.1 (C-10), 134.6(C-10a), 15.4 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[15]，故鑒定化合物2 為soranjidiol。

化合物3：紅色粉末，分子式C15H10O5，ESI-MSm/z: 269 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:7.24 (1H, s, H-3), 8.04 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5), 7.22(1H, dd,J= 2.5, 8.5 Hz, H-6), 7.47 (1H, d,J= 2.5 Hz,H-8), 2.22 (3H, s, -CH3), 13.06 (1H, s, 1-OH), 12.94(1H, s, 4-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ:156.9 (C-1), 112.2 (C-2), 129.3 (C-3), 156.5 (C-4),110.8 (C-4a), 130.0 (C-5), 122.5 (C-6), 164.0 (C-7),112.6 (C-8), 135.5 (C-8a), 187.3 (C-9), 139.9 (C-9a),185.6 (C-10), 125.2 (C-10a), 16.3 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[16]，故鑒定化合物 3 為1,4,7-trihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone。

化合物4：黃色粉末，分子式C15H10O4，ESI-MSm/z: 253 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:7.91 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-3), 7.77 (1H, d,J= 7.7 Hz,H-4), 8.19～8.21 (1H, m, H-5), 7.94～7.97 (2H, m,H-6, 7), 8.24～8.25 (1H, m, H-8), 4.66 (2H, s, H-1′),12.77 (1H, s, 1-OH), 5.48 (1H, s, 1′-OH)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 158.4 (C-1), 138.3 (C-2),133.6 (C-3), 118.9 (C-4), 131.3 (C-4a), 126.6 (C-5),135.2 (C-6), 134.6 (C-7), 126.9 (C-8), 132.8 (C-8a),188.7 (C-9), 114.9 (C-9a), 181.8 (C-10), 133.3(C-10a), 57.5 (C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[16]，故鑒定化合物4 為digiferruginol。

化合物5：紅色粉末，分子式C15H10O5，ESI-MSm/z: 269 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:7.27 (1H, s, H-3), 8.22 (2H, dd,J= 5.0, 4.0 Hz, H-5,8), 7.99～7.91 (2H, m, H-6, 7), 4.57 (2H, s, H-1′),12.93 (1H, s, 1-OH), 12.68 (1H, s, 4-OH), 5.57 (1H, s,1′-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 154.2(C-1), 144.7 (C-2), 124.5 (C-3), 157.0 (C-4), 110.7(C-4a), 126.5 (C-5), 134.9 (C-6), 135.0 (C-7), 126.5(C-8), 132.8 (C-8a), 186.2 (C-9), 111.4 (C-9a), 186.9(C-10), 132.6 (C-10a), 57.5 (C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[16]，故鑒定化合物 5 為1,4-dihydroxy-2-hydroxymethylanthraquinone。

化合物6：黃色粉末，分子式C16H12O5，ESI-MSm/z: 269.1 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.53 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-3), 7.46 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-4), 7.44 (1H, s, H-5), 7.47 (1H, s, H-8), 2.22(3H, s, -CH3), 12.97 (1H, s, 1-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 159.8 (C-1), 133.5 (C-2), 136.7(C-3), 118.3 (C-4), 131.2 (C-4a), 113.1 (C-5), 151.4(C-6), 152.2 (C-7), 112.7 (C-8), 127.3 (C-8a), 187.9(C-9), 114.8 (C-9a), 180.8 (C-10), 126.1 (C-10a), 15.7(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[17]，故鑒定化合物6 為1,6,7-trihydroxy-2-methylanthracene-9,10-dione。

化合物7：紅色粉末，分子式C15H14O5，ESI-MSm/z: 273.1 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 5.39 (1H, q,J= 6.4, 12.9 Hz, H-2), 8.16 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 7.89 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-6), 2.17 (3H,d,J= 6.9 Hz, 2-CH3), 2.18 (3H, s, 3α-CH3), 1.98 (3H,s, 3β-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 90.9(C-2), 44.7 (C-3), 131.4 (C-3a), 180.6 (C-4), 124.0(C-4a), 119.7 (C-5), 119.9 (C-6), 152.1 (C-7), 150.5(C-8), 115.1 (C-8a), 183.0 (C-9), 157.9 (C-9a), 14.7(-CH3), 25.4 (3α-CH3), 20.3 (3β-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[5]，故鑒定化合物 7 為(R)-7,8-dihydroxy-α-dunnione。

化合物8：黃色粉末，分子式C12H9NO4，ESI-MSm/z: 254 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ:8.09 (d,J= 7.8 Hz, H-5), 7.71 (t,J= 7.8 Hz, H-6),7.82 (t,J= 7.8 Hz, H-7), 8.23 (d,J= 7.8 Hz, H-8),3.95 (3H, s, H-12), 9.12 (1H, brs, -NH2), 6.98 (1H,brs, -NH2)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 172.9(C-1), 101.6 (C-2), 153.2 (C-3), 180.7 (C-4), 126.4(C-5), 136.1 (C-6), 132.6 (C-7), 127.6 (C-8), 129.7(C-9), 134.2 (C-10), 169.6 (C-11), 52.3 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[18]，故鑒定化合物8 為3-amino-2-methoxycarbonyl-1,4-naphthoquinone。

化合物9：黃色粉末，分子式C15H10O6，ESI-MSm/z: 285 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ:6.66 (1H, s, H-3), 6.18 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6), 6.44(1H, d,J= 2.1 Hz, H-8), 7.40 (1H, d,J= 2.3 Hz,H-2′), 6.89 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5′), 7.41 (1H, dd,J=2.3, 8.3 Hz, H-6′), 12.97 (1H, s, 5-OH)；13C-NMR(150 MHz, CD3OD)δ: 163.9 (C-2), 102.9 (C-3), 181.7(C-4), 161.5 (C-5), 98.9 (C-6), 164.2 (C-7), 93.9(C-8), 157.3 (C-9), 103.7 (C-10), 121.5 (C-1′), 113.4(C-2′), 145.8 (C-3′), 149.8 (C-4′) , 116.1 (C-5′), 119.0(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[19]，故鑒定化合物9 為木犀草素。

化合物10：無色油狀物，分子式C20H24O6，ESI-MSm/z: 359 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 1.97～2.03 (1H, m, H-2), 1.74～1.78 (1H,m, H-3), 2.77 (2H, d,J= 7.7 Hz, H-4), 6.65 (1H, s,H-5), 6.18 (1H, s, H-8), 6.67 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2′),6.74 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5′), 6.61 (1H, dd,J= 1.8,8.0 Hz, H-6′), 3.70 (1H, dd,J= 4.1, 11.3 Hz, H-9a),3.39 (1H, dd,J= 4.1, 11.3 Hz, H-9b), 3.64～3.67 (2H,m, H-10), 3.80 (3H, s, -OMe), 3.87 (3H, s, -OMe)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 48.0 (C-1), 47.9(C-2), 39.9 (C-3), 33.6 (C-4), 129.9 (C-4a), 112.3(C-5), 147.2 (C-6), 145.9 (C-7), 117.4 (C-8), 138.6(C-8a), 62.2 (C-9), 65.9 (C-10), 134.1 (C-1′), 113.8(C-2′), 149.0 (C-3′), 145.2 (C-4′), 116.0 (C-5′), 123.2(C-6′), 56.3 (-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[20]，故鑒定化合物10 為異落葉松脂素。

化合物11：無色片狀晶體（三氯甲烷/甲醇），分子式C15H10O6，ESI-MSm/z: 177 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 6.16 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-3), 7.86 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-4), 6.98 (1H, s,H-5), 6.74 (1H, s, H-8)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 160.8 (C-2), 111.5 (C-3), 144.5(C-4),112.3 (C-5), 142.9 (C-6), 150.5 (C-7), 102.6 (C-8),148.5 (C-9), 110.7 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[21]，故鑒定化合物11 為七葉內(nèi)酯。

化合物12：白色針晶（甲醇），分子式C8H10O2，ESI-MSm/z: 137.1 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 3.71 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-1), 2.74 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-2), 7.06 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-4), 6.71(1H, d,J= 8.5 Hz, H-5), 6.71 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-7),6.71 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 64.6 (C-1), 39.4 (C-2), 130.9 (C-3), 130.9(C-4), 116.1 (C-5), 156.7 (C-6), 116.1 (C-7), 130.9(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[22]，故鑒定化合物12 為酪醇。

化合物13：白色針晶（丙酮），分子式C9H8O3，ESI-MSm/z: 163 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.42 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2, 6), 6.81 (2H,d,J= 8.6 Hz, H-3, 5), 7.60 (1H, d,J= 16 Hz, H-7),6.28 (1H, d,J= 16 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 127.2 (C-1), 131.1 (C-2), 116.8 (C-3),161.1 (C-4), 116.8 (C-5), 131.1 (C-6), 146.7 (C-7),115.6 (C-8), 171.0 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[23]，故鑒定化合物13 為對香豆酸。

化合物14：棕黃色粉末，分子式C10H10O4，ESI-MSm/z: 193 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.07 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.81 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5), 6.97 (1H, dd,J= 2.0, 8.2 Hz, H-6),6.29 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-7), 7.57 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8), 3.78 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 127.7 (C-1), 115.1 (C-2), 146.8 (C-3),149.6 (C-4), 116.5 (C-5), 122.9 (C-6), 114.8 (C-7),147.0 (C-8), 169.8 (C = O), 52.0 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[24]，故鑒定化合物14 為咖啡酸甲酯。

化合物15：淡黃色油狀物，分子式C14H20O8，ESI-MSm/z: 293 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.46 (2H, d,J= 7.3 Hz, H-2, 6), 7.36 (2H,t,J= 7.3 Hz, H-3, 5), 7.30 (1H, t,J= 7.3 Hz, H-4),4.98 (1H, d,J= 11.4 Hz, overlapped, H-7a), 4.72 (1H,d,J= 11.4 Hz, H-7b), 4.46 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-1′),3.40～3.60 (4H, m, H-2′～5′), 3.94 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-6′a), 3.76 (1H, dd,J= 4.5, 11.4 Hz, H-6′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 138.9 (C-1), 129.3(C-2, 6), 129.1 (C-3, 5), 128.7 (C-4), 69.9 (C-7), 103.3(C-1′), 73.5 (C-2′), 77.9 (C-3′), 71.9 (C-4′), 78.9(C-5′), 62.5 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[25]，故 鑒 定 化 合 物 15 為 benzylO-β-Dglucopyranoside。

化合物16：淡黃色油狀物，分子式C13H18O6，ESI-MSm/z: 293 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.45 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-2, 6), 7.36 (2H,d,J= 7.2 Hz, H-3, 5), 7.31 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-4),4.98 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-7a), 4, 72 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-7b), 4.45 (1H, d,J= 6.0 Hz, H-1′), 3.42 (1H, m,H-2′), 3.47～3.60 (3H, m, H-3′～5′), 3.94 (1H, d,J=11.4 Hz, H-6′a), 3.76 (1H, dd,J= 4.5, 11.4 Hz,H-6′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 138.9 (C-1),129.3 (C-2, 6), 129.2 (C-3, 5), 128.7 (C-4), 69.9(C-7), 103.3 (C-1′), 73.5 (C-2′), 77.9 (C-3′), 71.9(C-4′), 78.9 (C-5′), 62.5 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[26]，故鑒定化合物16 為4-O-benzyl-D-glucopyranoside。

化合物17：淡黃色油狀物，分子式C14H20O8，ESI-MSm/z: 317 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.72 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-2), 6.70 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-5), 6.58 (1H, dd,J= 1.9, 8.0 Hz, H-6),2.18 (2H, m, H-7), 4.05 (1H, m, H-8a), 3.71 (2H, m,H-8b, H-6′a), 4.32 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1′), 3.21 (1H,m, H-2′), 3.29 (2H, m, H-3′, H-4′), 3.38 (1H, m, H-5′),3.89 (1H, dd,J= 2.1, 12 Hz, H-6′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 131.5 (C-1), 116.3 (C-2), 146.1(C-3), 144.6 (C-4), 117.6 (C-5), 121.2 (C-6), 36.6 (C-7),72.1 (C-8), 104.3 (C-1′), 75.1 (C-2′), 77.9 (C-3′), 71.6(C-4′), 78.1 (C-5′), 62.7 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基 本 一 致[27]， 故 鑒 定 化 合 物 17 為 3,4-dihydroxyphenylethyl alcohol 8-O-β-glucopyrnoside。

化合物18：無色油狀物，分子式C14H18O8，ESI-MSm/z: 337 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.87 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-2), 6.76 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5), 6.74 (1H, dd,J= 1.5, 8.1 Hz, H-6),4.56 (1H, dd,J= 2.8, 10.6 Hz, H-7), 3.97 (1H, dd,J=2.9, 12 Hz, H-8a), 3.69 (1H, dd,J= 10.7, 11.9 Hz,H-8b), 4.46 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-1′), 3.19 (1H, dd,J= 7.7, 9.7 Hz, H-2′), 3.62 (1H, dd,J= 8.8, 9.4 Hz,H-3′), 3.43 (1H, dd,J= 8.8, 9.7 Hz, H-4′), 3.49 (1H,m, H-5′), 3.92 (1H, dd,J= 2.1, 12.0 Hz, H-6′a), 3.75(1H, dd,J= 5.5, 12.0 Hz, H-6′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 129.9 (C-1), 115.0 (C-2), 146.3(C-3), 146.5 (C-4), 116.1 (C-5), 119.4 (C-6), 78.8 (C-7),72.8 (C-8), 99.5 (C-1′), 80.9 (C-2′), 75.1 (C-3′), 71.8(C-4′), 79.8 (C-5′), 62.5 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[28]，故鑒定化合物18 為cuneataside A。

化合物19：無色針晶（丙酮），分子式C15H10O6，ESI-MSm/z: 285.1 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.16 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-3), 7.86 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-4), 6.98 (1H, s, H-5), 6.74 (1H, s, H-8)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 160.8 (C-2), 111.5(C-3), 144.5 (C-4), 112.3 (C-5), 142.9 (C-6), 150.5(C-7), 102.6 (C-8), 148.5 (C-9), 110.7 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[29]，故鑒定化合物19 為對羥基苯甲醛。

化合物20：無色針晶（甲醇），分子式C8H8O3，ESI-MSm/z: 151 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.84～7.91 (2H, m, H-2, 6), 6.81～6.86(2H, m, H-3, 5), 3.86 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 122.4 (C-1), 132.8 (C-2, 6), 116.2(C-3, 5), 163.6 (C-4), 168.8 (-CHO), 52.2 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[30]，故鑒定化合物20為尼泊金甲酯。

化合物21：白色針晶（氯仿），分子式C8H8O2，ESI-MSm/z: 135 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 7.94 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2, 6), 6.97 (2H,d,J= 8.8 Hz, H-3, 5), 2.61 (3H, s, H-2′)；13C-NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 129.7 (C-1), 131.4 (C-2), 115.7(C-3), 161.5 (C-4), 115.7 (C-5), 131.4 (C-6), 198.7(C-1′), 26.4 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[31]，故鑒定化合物21 為對羥基苯乙酮。

化合物22：白色針晶（甲醇），分子式C8H8O3，ESI-MSm/z: 151 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 7.43 (1H, s, H-2), 6.94 (1H, d,J= 7.9 Hz,H-5), 7.42 (1H, d,J= 7.9 Hz, H-6), 9.74 (1H, s,-CHO), 3.91 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 130.6 (C-1), 111.3 (C-2), 149.7 (C-3), 154.7(C-4), 116.3 (C-5), 127.9 (C-6), 192.9 (-CHO), 56.4(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[32]，故鑒定化合物22 為香草醛。

化合物23：無色針晶（丙酮），分子式C8H8O4，ESI-MSm/z: 167 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.44 (1H, s, H-2), 6.84 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5), 7.44 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6), 3.37 (3H, s,3-OCH3), 9.87 (1H, s, 4-OH), 12.5 (1H, s, -COOH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 121.4 (C-1), 114.8(C-2), 147.0 (C-3), 150.8 (C-4), 112.5 (C-5), 123.2(C-6), 167.0 (-COOH), 55.3 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[33]，故鑒定化合物23 為香草酸。

3.2 細(xì)胞毒活性評價(jià)

3.2.1 對A549 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性初篩結(jié)果 根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法，對其中18 個化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1 所示，在濃度為100 μmol/L 時(shí)，化合物8 對A549 細(xì)胞增殖抑制率大于50%，其他化合物沒有表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒活性。因此，進(jìn)一步對化合物8 進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其IC50值。

圖1 牛耳朵化合物 (100 μmol·L-1) 對A549 細(xì)胞細(xì)胞毒活性初篩結(jié)果Fig. 1 Preliminary screening results of cytotoxic activity of compounds (100 μmol L-1) from P. eburnea on A549 cell line

3.2.2 化合物8 對A549 細(xì)胞的IC50值 化合物8對A549 細(xì)胞有顯著的抑制作用（P＜0.01），其IC50＝（3.866±0.011）μmol/L，活性高于陽性藥順鉑[IC50＝（9.895±0.025）μmol/L]。

3.3 抗氧化活性篩選結(jié)果

根據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法，對其中11 個化合物進(jìn)行了體外抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有6 個化合物有顯著的抗氧化活性。結(jié)果見表1，化合物5～7、9～11 均表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，其中化合物9 和11表現(xiàn)出的DPPH 自由基清除能力和ABTS 自由基清除能力均高于陽性藥VC 和VE。

表1 化合物的DPPH 和ABTS 自由基抑制活性的結(jié)果(±s , n=3)Table 1 Results of DPPH and ABTS+ radical inhibitory activities of selected compounds (x ±s , n=3)

表1 化合物的DPPH 和ABTS 自由基抑制活性的結(jié)果(±s , n=3)Table 1 Results of DPPH and ABTS+ radical inhibitory activities of selected compounds (x ±s , n=3)

化合物 IC50/(μg·mL-1)DPPH ABTS+5 7.270±0.046 2.184±0.005 6 0.548±0.036 0.259±0.049 7 0.625±0.024 0.362±0.020 9 0.161±0.013 0.960±0.041 10 1.190±0.043 0.588±0.023 11 0.024±0.011 0.225±0.012 VC 0.306±0.021 VE 1.502±0.041

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從黔產(chǎn)牛耳朵的醋酸乙酯部位分離鑒定了23 個化合物，包含8 個醌類化合物，1 個黃酮類化合物，1 個木質(zhì)素類化合物，1 個香豆素類化合物，8 個酚酸類化合物和4 個苷類化合物，其中化合物1～3、6 和8～22 為首次從報(bào)春苣苔屬植物中分離得到?；衔? 對A549 細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒活性?；衔?～7、9～11 均表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，其中化合物9 和11 的抗氧化活性高于陽性藥VC 和VE。本研究揭示了黔產(chǎn)牛耳朵中的化學(xué)成分，并印證了牛耳朵化學(xué)成分的抗腫瘤活性和抗氧化活性，為貴州牛耳朵資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突