萊菔子中2 個(gè)新的含硫衍生物

楊佩雯，張培良,2，韓竹箴，楊穎博,3，吳 弢*

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203

2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012

3. 上海圖鋒醫(yī)藥科技有限公司，上海 201203

萊菔子RaphaniSemen是十字花科植物蘿卜RaphanussativusL. 的干燥成熟種子，收錄于《中國藥典》2020 年版一部，具有消食除脹和降氣化痰的功效，臨床常用于治療消化系統(tǒng)疾病和高血壓等[1-3]。目前從萊菔子中分離純化、鑒定的化合物主要為硫苷及其降解產(chǎn)物、生物堿、苯丙素及其衍生物、黃酮、萜類、甾體等[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，萊菔子中的水溶性生物堿能夠降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[5]，芥子堿可顯著調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平[6]，萊菔苷能夠促進(jìn)大鼠離體回腸的運(yùn)動(dòng)[7]，萊菔素能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖[8]和脂肪細(xì)胞的分化[9]，萊菔硫烷可通過促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞的褐變而減少肥胖小鼠的脂質(zhì)累積[10]。

為了從萊菔子中尋找更多具有降脂活性的化合物，本研究從萊菔子70%乙醇提取物中分離、純化、鑒定了14 個(gè)化合物，分別為降萊菔硫代酸乙酯（ethyl norsulforaphanate，1）、萊菔酸甲酯（methyl raphanide，2）、芥子堿（sinapine，3）、(E)-2-(4-hydroxy-2-oxoindolin-3-ylidene)acetonitrile（4）、2-(4-hydroxy-2-oxoindolin-3-yl)acetonitrile（5）、6-methoxyindole-3-carboxylic acidO-β-Dglucopyranosyl ester（6）、cappariloside A（7）、3′,6-二芥子?；崽牵?′,6-disinapoyl sucrose，8）、吐葉醇（vomifoliol，9）、3,4-二羥基苯甲醛（3,4-dihydroxybenzaldehyde，10）、3, 4-二羥基苯甲酸（3,4-dihydroxybenzoic acid，11）、5-羥甲基糠醛（5-hydroxy methylfurfural，12）、2-羥甲基-5-呋喃丙烯酸乙酯（2-hydroxymethyl-5-furanacrylic acid ethyl ester，13）和β-谷甾醇（β-sitosterol，14），結(jié)構(gòu)見圖1。其中化合物1 和2 為新化合物，4、6、10、11 和13 為首次從萊菔子中分離得到的化合物。此外，通過3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗模型對新化合物1和2 進(jìn)行了體外調(diào)脂活性篩選。結(jié)果表明，化合物1和2 均具有潛在的調(diào)脂活性，化合物1 較化合物2 在5、10 μmol/L 下顯示出更好的調(diào)脂活性。本研究為充分開發(fā)和利用萊菔子提供了一定的理論依據(jù)。

圖1 化合物1～14 的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of compounds 1—14

1 儀器與材料

Bruker AVANCE III 400 MHz 核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司）；6545 四極桿飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國Agilent 公司）；LC-3000 型高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；Capcell Pak C18MG II 制備液相色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm，日本資生堂公司）；Sepacore 型中低壓制備色譜儀（瑞士BUICHI 公司）；BSA124S-CW 型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Spectrum Two 型紅外光譜儀（美國PerkinElmer 公司）；TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；MILLPORE 型Milli-Q 純水儀（美國Bedford 公司）；BB150 型CO2恒溫箱（賽默飛世爾科技有限公司）；SYNERGY H4 型全功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；IX2 型全內(nèi)反射熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；CKX41 型生物顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；GENESPEED416 型低速離心機(jī)（基因有限公司）；100～200、200～300、300～400目硅膠（青島海洋化工廠分廠）；GF254薄層色譜硅膠板（煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）；制備純乙腈（上海泰坦科技股份有限公司）；二氯甲烷、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、EDTA、MgSO4、NaHCO3（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DMSO（翌圣生物科技有限公司）；胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；PBS 緩沖液、DMEM 高糖培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（STBF2497V，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，美國Sigma-Aldrich 公司）；地塞米松（S12HS194411，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、牛胰島素（J16HS187861，27 U/mg）、羅格列酮（W28D11H135759，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、尼羅紅染料（M18HS175211，BR，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、洛伐他?。ㄅ朅07HS190930，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司。

3T3-L1 小鼠脂肪前體細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

萊菔子藥材（50 kg）2020 年11 月購買于安徽亳州市，由上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心吳立宏研究員鑒定為十字花科植物蘿卜R.sativusL.的干燥成熟種子，標(biāo)本憑證（lfz.202011）保存于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所標(biāo)本室。

2 提取與分離

稱取萊菔子藥材50 kg，粉碎，用70%乙醇水溶液冷浸提取，提取料液比1∶4，共提取5 次。50 ℃減壓回收試劑，得到總提取物浸膏質(zhì)量約7438 g。取7398 g 總浸膏加8 L 水混懸，用8 L 醋酸乙酯分別萃取3 次，收集水部位和醋酸乙酯部位，低溫減壓濃縮得到水部位浸膏（7038 g）和醋酸乙酯部位浸膏（360 g）。取320 g 醋酸乙酯部位浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1）以及二氯甲烷-甲醇（100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶1）梯度洗脫，收集組分Fr. A～I(xiàn)。Fr. B 放置過夜后，析出晶體，得到化合物14（20 mg）。Fr. E 經(jīng)閃柱色譜，用二氯甲烷-甲醇（100∶0、80∶1、60∶1、50∶1和0∶100）梯度洗脫，得到組分Fr. E1～5。Fr. E1經(jīng)ODS 反相色譜柱色譜，用甲醇-水（2∶8、3∶8、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）梯度洗脫，得到化合物12（2 mg）。Fr. F 經(jīng)ODS 反相色譜柱色譜，用甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶8、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）梯度洗脫，得到組分Fr. F1～4，F(xiàn)r. F4 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，用石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脫，得到組分Fr. F4-1～F4-4。Fr. F4-3 用半制備高效液相純化得到化合物1（4 mg，tR=22 min，乙腈-水20∶80，8 mL/min）和9（8 mg，tR=30 min，乙腈-水20∶80，8 mL/min）。組分Fr. F3 經(jīng)硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇（100∶0、100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶1）梯度洗脫，得到組分Fr. F3-1～F3-2。組分Fr. F3-1 用半制備高效液相純化得到化合物5（2 mg，tR＝21 min，乙腈-水15∶85，8 mL/min）和化合物10（5 mg，tR＝22 min，乙腈-水15∶85，8 mL/min）。組分Fr. F2經(jīng)凝膠柱色譜，甲醇為洗脫劑，得到組分Fr. F2-1～F2-3。組分Fr. F2-3 用半制備型高效液相純化得到化合物4（2 mg，tR＝35 min，乙腈-水20∶80，8 mL/min）。Fr. G 經(jīng)ODS 反相色譜柱色譜，用甲醇-水（2∶8、3∶8、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）梯度洗脫，得到組分Fr. G1～G10。組分Fr. G1 經(jīng)硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇（100∶0、80∶1、60∶1、40∶1、30∶1）梯度洗脫，得到Fr. G1-1～G1-3。Fr. G1-2 用半制備型高效液相純化得到化合物2（14 mg，tR＝17 min，乙腈-水20∶80，8 mL/min）和11（29 mg，tR＝16 min，乙腈-水13∶87，8 mL/min）。組分Fr. G4 經(jīng)70%甲醇凝膠柱分離后，用半制備型高效液相純化得到化合物13（2 mg，tR＝36 min，乙腈-水27∶73，8 mL/min）。Fr. H經(jīng)ODS 反相色譜柱分離，用甲醇-水（2∶8、3∶8、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）梯度洗脫，得到組分Fr. H1～4。組分Fr. H1 經(jīng)硅膠柱色譜分離，采用醋酸乙酯-甲醇（100∶0、80∶1、60∶1、40∶1、15∶1）梯度洗脫，得到Fr. H1-1～H1-3。組分 Fr. H1-1 經(jīng)凝膠柱分離，得到 Fr.H1-1-1～H1-1-4。Fr. H1-1-4 用半制備型高效液相純化，得到化合物7（3 mg，tR＝21 min，乙腈-水17∶83，8 mL/min）。組分Fr. H2 經(jīng)硅膠柱分離，采用醋酸乙酯-甲醇（100∶0、80∶1、60∶1、40∶1、15∶1）體系洗脫，得到Fr. H2-1～H2-2。Fr. H2-2經(jīng)制備型高效液相純化得到化合物6（4 mg，tR＝32 min，乙腈-水15∶85，8 mL/min）。Fr. H4 經(jīng)薄層制備，得到化合物8（5 mg）。取50 g 水部位浸膏，經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、制備液相色譜純化得到化合物3（19 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀物；HR-ESI-MSm/z232.044 4[M＋Na]+（計(jì)算值為232.043 6，C7H15NNaO2S2），得到分子式為 C7H15NO2S2，不飽和度為 2。(nm): 244 (0.2)；IR 光譜顯示有S=O (1007 cm-1)、C=S (1193 cm-1) 等官能團(tuán)的特征吸收峰。1H-NMR 譜（表1）中，在δH2.64 (3H, s, H-5) 處為1 個(gè)甲基亞磺酰基氫信號，在δH3.64 (2H, td,J= 6.8,1.6 Hz, H-2)、2.84 (2H, m, H-4)、2.04 (2H, m, H-3) 處是3 個(gè)亞甲基氫信號；由13C-NMR 譜和DEPT 譜可知，在δC192.4 (C-1) 處有1 個(gè)氨基硫代甲酸酯的季碳信號，在δC52.3 (C-4)、44.5 (C-2)、23.1 (C-3) 處有3 個(gè)亞甲基碳信號，在δC38.2 (C-5) 處有1 個(gè)甲基亞磺?；夹盘?。以上核磁共振數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的Iberin[11]部分相似，兩者可能都有1 個(gè)3-(甲基亞磺?；?丙基，但化合物1 的相對分子質(zhì)量較Iberin多46，推測化合物1 可能比Iberin 多1 個(gè)-CH2OCH3或-OCH2CH3片段。根據(jù)1H-NMR 譜中δH4.44 (2H,q,J= 7.1 Hz, H-1′) 和1.29 (3H, t,J= 7.1 Hz, H-2′)處的氫信號和13C-NMR 譜中δC66.9 (C-1′) 和δC14.7 (C-2′) 處的碳信號，可判斷化合物1 較Iberin多1 個(gè)-OCH2CH3片段。為了進(jìn)一步解析化合物1的結(jié)構(gòu)，分析1H-1H COSY 譜（圖2）可知，δH4.44(2H, q,J= 7.1 Hz, H-1′)/1.29 (3H, t,J= 7.1 Hz,H-2′) 相關(guān)，以及δH3.64 (2H, td,J= 6.8, 1.6 Hz,H-2)/2.04 (2H, m, H-3)/2.84 (2H, m, H-4) 相關(guān)，分別構(gòu)成兩個(gè)自旋偶合片段。結(jié)合HMBC 譜中H-4 (δH2.84) 與C-5 (δC38.2) 的遠(yuǎn)程相關(guān)，說明化合物1 存在1 個(gè)3-(甲基亞磺酰基)丙基。經(jīng)查閱SciFinder 數(shù)據(jù)庫，確定化合物1 為新化合物，并命名為降萊菔硫代酸乙酯。

圖2 化合物1 和2 的關(guān)鍵1H-1H COSY () 與HMBC相關(guān) ()Fig. 2 Key 1H-1H COSY () and HMBC ()correlations of compounds 1 and 2

表1 化合物1 和2 的1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 和 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) and 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) data of 1 and 2

化合物2：無色油狀物；HR-ESI-MSm/z214.051 7[M＋Na]+（計(jì)算值為214.050 8，C7H13NNaO3S），得到分子式為 C7H13NO3S，不飽和度為 3。(nm): 207 (0.2)；IR 光譜顯示有S=O (1015 cm-1)、C=O (1699 cm-1) 等官能團(tuán)的特征吸收峰。1H-NMR 譜（表1）中，在δH6.45 (1H, m, H-4) 和6.54 (1H, d,J= 15.2 Hz, H-5) 處有1 組反式雙鍵氫信號，在δH3.25 (2H, t,J= 6.7 Hz, H-2) 和2.46 (2H,m, H-3) 處為2 組亞甲基氫信號，在δH3.62 (3H, s,-OCH3) 處有1 個(gè)氧甲基氫信號，在δH2.60 (3H, s,H-6) 處為甲基亞磺?；鶊F(tuán)中的氫信號。由13C-NMR譜和DEPT 譜可知，在δC159.5 (C-1) 處有1 個(gè)酰胺的羰基碳信號，在δC139.0 (C-4)、 136.3 (C-5) 處為1 組雙鍵的烯碳信號，在δC33.4 (C-3)、40.4 (C-2)處有2 個(gè)亞甲基碳信號，在δC52.5 (C-1′) 處有1 個(gè)氧甲基碳信號，在δC40.4 (C-6) 處有1 個(gè)甲基亞磺?；夹盘?。以上 NMR 數(shù)據(jù)與 methyl-(E)-5-(methylsulfinyl) pent-4-enoate[12]的非常相似，推測兩者都有1 個(gè)4-(甲基亞磺?；?-3-烯丁基團(tuán)，但化合物2 的相對分子質(zhì)量比上述已知化合物多15，推測化合物2 中可能有1 個(gè)-NH-片段。為了進(jìn)一步解析化合物1 的結(jié)構(gòu)，分析1H-1H COSY 譜（圖2）可知，δH3.25 (H-2)/δH2.46 (H-3)/δH6.45 (H-4)/δH6.54(H-5) 相關(guān)，構(gòu)成1 個(gè)自旋偶合系統(tǒng)。此外，HMBC譜中，H-6 (δH2.60) 與C-5 (δC136.3) 相關(guān)，判斷化合物2 有1 個(gè)4-(甲基亞磺?；?-3-烯丁基。比較兩者碳譜中對應(yīng)位置的化學(xué)位移，發(fā)現(xiàn)化合物2 的C-2向低場位移了7.9 個(gè)化學(xué)位移，且HMBC 譜中C-1(δC159.5) 與H-2 (δH3.25) 具有遠(yuǎn)程相關(guān)，說明C-1通過N原子與4-(甲基亞磺?；?-3-烯丁基相連。經(jīng)查閱SciFinder 數(shù)據(jù)庫，確定化合物2 為新化合物，并命名為萊菔酸甲酯。

化合物1 和2 均為甲硫氨酸的衍生物，但兩者的生成途徑不同。萊菔子中的脂肪族硫苷Glucoiberin 在黑芥子酶的作用下，先被降解為中間產(chǎn)物thiohydroximate-O-sulfonate，隨后通過羅森重排生成異硫氰酸酯Iberin。因?yàn)楫惲蚯杷狨ブ杏幸粋€(gè)親電性很強(qiáng)的碳原子，所以異硫氰酸酯很可能與親核試劑（乙醇）發(fā)生反應(yīng)從而生成化合物1[13-14]。而化合物2 則可能是直接經(jīng)過甲硫氨酸的側(cè)鏈延長，生成醛肟，然后通過貝克曼重排、氧化以及GRS1酶催化脫氫而生成的[14-15]（圖3）。根據(jù)生成途徑推測，化合物1 為異硫氰酸酯和乙醇的人工產(chǎn)物，而化合物2 的生成途徑不涉及甲醇、乙醇等試劑，所以化合物2 不是人工產(chǎn)物。

圖3 化合物1 和2 可能的生成途徑Fig. 3 Possible produced pathways of compounds 1 and 2

化合物3：黃色油狀物；分子式C16H24NO5；ESI-MSm/z310 [M]+；碘化鉍鉀試液顯橘紅色，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.68 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-7), 6.96 (2H, s, H-2, 6), 6.48 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8), 4.67 (2H, m, H-10), 3.89 (6H, s, 2×-OCH3), 3.83 (2H, s, H-11), 3.30 (9H, s, 3×-NCH3),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[16]，并且與芥子堿對照品薄層行為一致，鑒定化合物3 為芥子堿。

化合物4：淡黃色粉末；分子式C10H6N2O3；ESI-MSm/z209 [M＋Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 7.16 (1H, m, H-6), 6.52 (1H, s, H-2), 6.47(1H, d,J= 8.4 Hz, H-5), 6.34 (1H, d,J= 7.6 Hz,H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 167.3 (C-9),158.6 (C-4), 145.2 (C-7a), 144.9 (C-3), 135.7 (C-6),117.1 (C-1), 109.2 (C-5), 102.6 (C-7), 97.1 (C-2)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[17]，鑒定化合物4 為(E)-2-(4-hydroxy-2-oxoindolin-3-ylidene) acetonitrile。

化合物5：淡黃色粉末；分子式C10H8N2O2；ESI-MSm/z187 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 7.09 (1H, t,J= 8.0 Hz, H-6), 6.51 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-7), 6.45 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-5), 3.30(1H, m, H-3), 3.18 (2H, m, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 179.4 (C-9), 155.7 (C-4), 145.2(C-7a), 131.3 (C-6), 118.1 (C-1), 111.1 (C-5), 103.0(C-7), 41.9 (C-3), 17.4 (C-2)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[17]，鑒定化合物5 為2,3-dihydro-4-hydroxy-2-oxo-1H-indole-3-acetonitrile。

化合物6：無色油狀物；分子式C16H19NO8；ESI-MSm/z352 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 3.56～3.40 (4H, m, H-2′～5′), 3.71 (1H,dd,J= 12.1, 4.7 Hz, H-6′b), 3.83 (3H, s, -OCH3), 3.87(1H, dd,J= 12.2, 2.0 Hz, H-6′a), 5.72 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1′), 6.86 (1H, dd,J= 8.8, 2.3 Hz, H-5), 6.97(1H, d,J= 2.2 Hz, H-7), 7.94 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-4),7.95 (1H, s, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:165.7 (C-8), 158.5 (C-6), 139.0 (C-7a), 133.2 (C-2),122.6 (C-4), 121.5 (C-3a), 112.8 (C-5), 107.6 (C-3),96.0 (C-7), 95.3 (C-1′), 78.8 (C-5′), 78.3 (C-3′), 74.2(C-2′), 71.2 (C-4′), 62.4 (C-6′), 55.9 (-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[18]，鑒定化合物6 為6-methoxyindole-3-carboxylic acidO-β-D-glucopyranosyl ester。

化合物7：淡黃色油狀物；分子式C16H18N2O6；ESI-MSm/z333 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 3.53～3.42 (3H, m, H-2′～4′), 3.60 (1H,dd,J= 8.7, 7.7 Hz, H-5′), 3.72 (1H, dd,J= 12.0, 4.8 Hz, H-6′b), 3.90 (1H, dd,J= 12.1, 1.9 Hz, H-6′a),4.19 (2H, d,J= 3.0 Hz, H-8), 5.09 (1H, d,J= 7.8 Hz,H-1′), 6.80～6.75 (1H, m, H-7), 7.05 (2H, m, H-6, 8),7.13 (1H, s, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:153.1 (C-4), 140.0 (C-7a), 124.0 (C-2), 123.6 (C-6),121.3 (C-3a), 118.4 (C-9), 107.4 (C-7), 105.3 (C-5),104.8 (C-3), 102.5 (C-1′), 78.4 (C-5′), 78.2 (C-3′),75.2 (C-2′), 71.4 (C-4′), 62.5 (C-6′), 16.2 (C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[19]，鑒定化合物7 為cappariloside A。

化合物8：淡黃色粉末；分子式C34H42O19；ESI-MSm/z753 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.61 (1H, d,J= 15.8 Hz, H-3"), 7.55(1H, d,J= 15.8 Hz, H-3"′), 7.02 (2H, s, H-5", 9"),7.01 (2H, s, H-5"′, 9"′), 6.54 (1H, m, H-2"), 6.50 (1H,d,J= 15.9 Hz, H-2"′), 5.60 (1H, d,J= 6.4 Hz, H-1),5.37～5.44 (2H, m, H-3′, 4′), 5.30 (1H, d,J= 3.6 Hz,4-OH), 5.25 (1H, d,J= 5.8 Hz, 2-OH), 4.98 (1H, d,J= 5.0 Hz, 3-OH), 4.90 (1H, t,J= 6.3 Hz, 1′-OH),4.69 (1H, t,J= 5.7 Hz, 6′-OH), 4.46 (1H, d,J= 10.8 Hz, 4′-OH), 4.01～4.31 (4H, m, H-6, 1′a, 5′), 3.80(6H, s, 6", 8"-OCH3), 3.78 (6H, s, 6"′, 8"′-OCH3),3.57～3.74 (2H, m, H-6′a, 1′b), 3.48 (1H, dt,J= 9.1,4.5 Hz, H-6′b), 3.26 ～3.42 (3H, m, H-2～4)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 166.7 (C-1"′),165.5 (C-1"), 148.0 (C-6", 8"), 148.0 (C-6"′, 8"′),145.8 (C-3"), 145.4 (C-3"′), 138.3 (C-7"), 138.3(C-7"′), 124.4 (C-4"), 124.3 (C-4"′), 114.7 (C-2", 2"′),106.1 (C-5", 9"), 106.1 (C-5"′, 9"′), 103.1 (C-1), 90.9(C-2′), 82.9 (C-5′), 77.1 (C-5), 73.1 (C-3′), 72.5 (C-3),71.4 (C-4′), 70.6 (C-2), 70.1 (C-4), 64.3 (C-1′), 63.6(C-6), 62.2 (C-6′), 56.1 (6", 8"-OCH3), 56.0 (6"′,8"′-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[19]，鑒定化合物8 為3′,6-二芥子酰基蔗糖。

化合物9：無色油狀物；分子式C13H20O3；ESI-MSm/z247 [M＋Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.88 (1H, t,J= 1.4 Hz, H-2), 5.80 (2H, m,H-7, 8), 4.32 (1H, qd,J= 6.3, 3.9 Hz, H-9), 2.62～2.11 (2H, m, H-6), 1.92 (3H, dd,J= 3.7, 1.4 Hz,H-11), 1.24 (3H, d,J= 6.4 Hz, H-10), 1.07～0.99(6H, m, H-12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:201.3 (C-1), 167.5 (C-3), 136.9 (C-7), 130.1 (C-8),127.1 (C-2), 79.9 (C-4), 68.7 (C-9), 50.7 (C-6), 42.4(C-5), 24.5 (C-12), 23.8 (C-13), 23.5 (C-10), 19.6(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[20]，鑒定化合物9 為吐葉醇。

化合物10：褐色粉末；分子式C7H6O3；ESI-MSm/z137 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:9.69 (1H, s, H-1), 7.31 (1H, m, H-3, 6), 6.91 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:193.1 (C-1), 153.8 (C-5), 147.2 (C-4), 130.8 (C-2),126.4 (C-7), 116.2 (C-6), 115.3 (C-3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[21]，鑒定化合物10 為3,4-二羥基苯甲醛。

化合物11：褐色粉末；分子式C7H6O4；ESI-MSm/z153 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.45 (2H, m, H-3, 7), 6.82 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 170.3 (C-1), 151.5(C-5), 146.0 (C-4), 123.9 (C-7), 123.1 (C-2), 117.7(C-3), 115.7 (C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[22]，鑒定化合物11 為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物12：無色油狀物；分子式C6H6O3；ESI-MSm/z149 [M＋Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 9.53 (1H, s, H-1), 7.39 (1H, d,J= 3.6 Hz,H-3), 6.59 (1H, d,J= 3.6 Hz, H-4)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 179.5 (C-1), 163.2 (C-5), 153.8(C-2), 125.0 (C-3), 110.9 (C-4), 57.6 (C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[16]，鑒定化合物12 為5-羥甲基糠醛。

化合物13：無色油狀物；分子式C10H12O4；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.41 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-3), 6.70 (1H, d,J= 3.3 Hz, H-5), 6.42 (1H, d,J= 3.3 Hz, H-6), 6.26 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-2), 4.57(2H, s, H-8), 4.21 (2H, q,J= 7.1 Hz, H-9), 1.30 (3H,t,J= 7.2 Hz, H-10)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:168.7 (C-1), 159.1 (C-7), 151.8 (C-4), 132.5 (C-3),117.4 (C-5), 115.9 (C-2), 111.0 (C-6), 61.6 (C-9),57.5 (C-8), 14.6 (C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[23]，鑒定化合物13 為2-羥甲基-5-呋喃丙烯酸乙酯。

化合物14：白色粉末；分子式C29H50O；ESI-MSm/z415 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ:5.36 (1H, d,J= 5.1 Hz, H-6), 3.53 (1H, ddd,J= 15.4,10.7, 4.4 Hz, H-3), 2.37～2.17 (2H, m, H-4)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 141.0 (C-5), 121.9(C-6), 72.0 (C-3), 57.0 (C-14), 56.3 (C-17), 50.3(C-9), 46.0 (C-21), 42.5 (C-13), 42.5 (C-4), 40.0(C-12), 37.5 (C-10), 36.7 (C-1), 36.4 (C-18), 34.15(C-2), 32.1 (C-7), 31.9 (C-8), 29.4 (C-2), 28.5 (C-22),26.3 (C-15), 24.5 (C-27), 23.3 (C-11), 21.3 (C-29),20.0 (C-23), 19.6 (C-26), 19.2 (C-24), 12.2 (C-28),12.1 (C-25)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[16]，鑒定化合物14 為β-谷甾醇。

4 體外調(diào)脂活性篩選

4.1 化合物對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞存活率的影響

采用CCK-8 法[24]，測試化合物1 和2 對3T3-L1前脂肪細(xì)胞存活率的影響。3T3-L1 前脂肪細(xì)胞使用DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清、1%的雙抗）于37 ℃和5% CO2的條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長至密度70%～80%，用胰蛋白酶將3T3-L1 前脂肪細(xì)胞消化后，用DMEM 高糖培養(yǎng)液將其制成4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12 h；設(shè)對照組、給藥組。吸棄原培養(yǎng)基，對照組加入含0.1% DMSO 的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，給藥組分別給予含10 μmol/L化合物的DMEM 高糖培養(yǎng)基100 μL，在原相同環(huán)境條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h；吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有10% CCK-8 試劑的培養(yǎng)基溶液后，放入培養(yǎng)箱0.5 h 后取出，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞存活率。

結(jié)果表明，化合物1 和2 在10 μmol/L 濃度下對3T3-L 前脂肪細(xì)胞48h 內(nèi)存活率均大于90%，因此選取5、10 μmol/L 的濃度用于后續(xù)活性研究，結(jié)果見表2。

表2 化合物1 和2 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞存活率的影響(x ±s , n=3)Table 2 Effects of compounds 1 and 2 on survival rate of 3T3-L1 preadipocytes (x ±s , n=3)

4.2 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[25]，通過3T3-L1 前脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型，測試化合物對該細(xì)胞胰島素抵抗的影響，從而評價(jià)化合物的調(diào)脂活性。3T3-L1前脂肪細(xì)胞2×104個(gè)/孔接種于24 孔板，分為對照組、模型組、陽性對照組、給藥組。待細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中生長至融合度 100%后，更換新鮮的DMEM 高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；對照組更換2 mL 新鮮的DMEM 高糖培養(yǎng)基，模型組加入2 mL誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基I（DMEM 高糖培養(yǎng)基中含牛胰島素 10 μg/mL、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 0.5 mmol/L、地塞米松0.25 μmol/L、羅格列酮1 μmol/L），陽性藥組加入2 mL 含5 mol/L 陽性藥物洛伐他汀的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基I，給藥組分別加入2 mL 含5、10 μmol/L化合物的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基I，培養(yǎng)48 h；對照組繼續(xù)更換2 mL 新鮮的DMEM 高糖培養(yǎng)基，模型組換成2 mL 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基II（DMEM 高糖培養(yǎng)基中含牛胰島素10 μg/mL），陽性對照組加入2 mL 含5 μmol/L 陽性藥物洛伐他汀的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基II，給藥組分別加入2 mL 含5、10 μmol/L 化合物的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基II，培養(yǎng)48 h；各組換為2 mL DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。在3T3-L1 細(xì)胞誘導(dǎo)分化第7 天，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入200 μL PBS 洗去殘余培養(yǎng)基后，棄去PBS。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[26]，使用DMEM 高糖培養(yǎng)基配制含1 μg/mL 尼羅紅染液，每孔加入尼羅紅染液200 μL，避光染色10 min后，棄去尼羅紅染液。每孔用PBS 洗滌細(xì)胞1 遍后，再加200 μL PBS。用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長485 nm 和發(fā)射波長572 nm 下檢測各組A值，并根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞中相對脂肪含量。用熒光顯微鏡觀察并拍照。

與對照組相比，模型組細(xì)胞中的相對脂肪含量明顯增加（P＜0.001）。與模型組相比，化合物1 在5、10 μmol/L 濃度下對3T3-L1 細(xì)胞中脂肪的生成均有顯著的抑制作用（P＜0.01、0.001），而化合物2 在10 μmol/L 濃度下顯示一定的抑制脂肪生成的作用（P＜0.05），結(jié)果見表3。此外，從圖4 可以看出，采用尼羅紅處理后，經(jīng)誘導(dǎo)分化后的各組細(xì)胞內(nèi)積累的大量脂滴被染成紅色。將各給藥預(yù)處理組細(xì)胞的尼羅紅染色程度與模型組細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)陽性藥洛伐他汀、化合物1 和2 的細(xì)胞內(nèi)脂滴均有不同程度地減少。綜上所述，化合物1 和2 均具有潛在的調(diào)脂活性。

表3 化合物1 和2 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞內(nèi)相對脂肪含量的影響 (±s , n=3)Table 3 Effects of compounds 1 and 2 on relative fat content in 3T3-L1 preadipocytes (± s , n=3)

表3 化合物1 和2 對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞內(nèi)相對脂肪含量的影響 (±s , n=3)Table 3 Effects of compounds 1 and 2 on relative fat content in 3T3-L1 preadipocytes (± s , n=3)

與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：***P＜0.001 **P＜0.01 *P＜0.05###P ＜ 0.001 vs control group; ***P ＜ 0.001 ** P ＜ 0.01 *P ＜ 0.05 vs model group

組別 給藥濃度/(μmol·L-1) 相對脂肪含量對照0.70±0.02 1.00±0.03###陽性對照 5 0.77±0.00***1 5 0.86±0.01**10 0.79±0.01***模型2 5 0.94±0.05 10 0.95±0.01*

圖4 化合物1 和2 對3T3-L1 細(xì)胞胰島素抵抗模型中細(xì)胞形態(tài)和脂質(zhì)積累的影響Fig. 4 Effects of compounds 1 and 2 on cell morphology and lipid accumulation in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

5 討論

從萊菔子70%乙醇提取物中分離得到14 個(gè)化合物，包括2 個(gè)新的含硫衍生物，5 個(gè)首次從萊菔子中分離得到的化合物。對這2 個(gè)新化合物進(jìn)行了體外調(diào)脂活性篩選。結(jié)果表明，化合物1 和2 均具有潛在的調(diào)脂活性，其中化合物1 較2 在5、10 μmol/L 下顯示出更好的調(diào)脂活性。本研究豐富了萊菔子的化學(xué)成分，并用胰島素抵抗模型評價(jià)了化合物1 和2 的體外調(diào)脂活性，為萊菔子進(jìn)一步的開發(fā)和利用提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突