氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體含量

陳同強(qiáng)，吳海智，梁 鋒，向 俊,2，彭程程，陳 惠，邱亞鋒，荊輝華，鄒子爵，彭國(guó)泰，李凱龍*

（1.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410083；3.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

植醇，又名葉綠醇（或葉黃烯醇），屬于一類不飽和高級(jí)醇，廣泛存在于自然界植物中，其為葉綠素的組成部分之一。葉綠素通過(guò)一定條件下水解可產(chǎn)生植醇[1-4]，自然界中的植醇包括E構(gòu)型和Z構(gòu)型2 種異構(gòu)體[5]。在有機(jī)化工及醫(yī)藥工業(yè)行業(yè)，植醇為重要的生產(chǎn)原料，隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，植醇的市場(chǎng)需求量處于上升趨勢(shì)。植醇可作為生產(chǎn)護(hù)膚品的主要原料之一，能促使皮膚、毛發(fā)等變得更加有光澤，同時(shí)還具備一定的保濕作用[6]。

植物性乳制品相對(duì)于動(dòng)物性乳制品的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在兩方面：一是清爽的口感，二是豐富的口味[7-9]。植物原料中脂肪含量相對(duì)偏低，如工藝合適，植物脂肪會(huì)比動(dòng)物脂肪味道更加清淡，這樣發(fā)酵出的植物酸乳產(chǎn)品也會(huì)更加清爽[10-12]，同時(shí)帶有植物原料的自然與清甜，無(wú)油膩感[13-15]。因動(dòng)物類制品的高攝入，許多消費(fèi)者開始出現(xiàn)肥胖、高血脂、高尿酸等疾病[16-18]。因此，低糖、低脂、高膳食纖維膳食成為熱門食品發(fā)展的趨勢(shì)[19-21]。消費(fèi)者開始關(guān)注食品標(biāo)簽和營(yíng)養(yǎng)成分含量，越來(lái)越青睞于天然產(chǎn)品，避免人工添加[22-23]。因此，植物性乳制品是不錯(cuò)的選擇，而且植物性乳制品中含有特有功能成分，如膳食纖維、植物甾醇等，這些化合物均有利于身體健康[24-26]。

植醇對(duì)于內(nèi)分泌有很好的輔助效果，具有刺激肝臟活力、促進(jìn)血液循環(huán)、平衡內(nèi)分泌、平衡神經(jīng)等功效[27-30]。植物性乳制品中往往會(huì)因原料引入植醇，然而，目前關(guān)于食品中該類物質(zhì)含量的檢測(cè)方法報(bào)道卻鮮見。李建法等[31]建立了松針軟膏不皂化物中植醇含量的測(cè)定方法。本研究采用固相萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，建立植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體含量的檢測(cè)方法，并對(duì)10 種常見植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體的含量進(jìn)行測(cè)定，為植醇的檢測(cè)提供技術(shù)支持，為其廣泛應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物性乳制品（酸乳），購(gòu)于淘寶，共10 份。

C18固相萃取小柱（500 mg，6 mL）、植醇（1 g，98.0%）、石油醚（分析純，500 mL）、乙酸乙酯（色譜純，4 L）、乙醚（分析純，500 mL） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；其他所用試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B GC-MS儀（配備HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

植醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備混合溶液（1 000 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取植醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于容量瓶中，甲醇溶解后定容至10 mL，渦旋混勻，－4 ℃冰箱中保存。

植醇標(biāo)準(zhǔn)工作混合溶液：準(zhǔn)確移取1 000 μg/mL植醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備混合溶液1.0 mL于100 mL容量瓶中，加入甲醇并定容，即得中間標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（質(zhì)量濃度10 μg/mL），再分別準(zhǔn)確移取中間標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、1.00 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，渦旋混勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、1.00 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣10.0 g（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管，加少量水浸濕后，加入20 mL石油醚，渦旋振蕩提取10 min后，以5 000 r/min、－4 ℃冷凍離心5 min，吸取上層有機(jī)層于梨形瓶中，重復(fù)上述提取過(guò)程1 次，提取液于梨形瓶中合并，35 ℃減壓條件下?lián)]發(fā)至近干。

加入5 mL乙酸乙酯溶解上述提取物，將樣液全部轉(zhuǎn)移至C18固相萃取柱后，靜置平衡10 min，采用15 mL乙酸乙酯-乙醚混合溶液（2∶1，V/V）洗脫，收集洗脫液于塑料離心管中，加入3 g無(wú)水硫酸鈉于洗脫液進(jìn)行脫水。減壓濃縮（溫度控制在35 ℃以下）除去溶劑，揮發(fā)至近干，加入0.5 mL甲醇渦旋振蕩30 s，繼續(xù)減壓濃縮至除盡乙酸乙酯-乙醚溶液，用甲醇定容至1.0 mL，混勻后，0.22 μm濾膜過(guò)濾，制得試樣待測(cè)液，備用。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 GC條件

進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以2 ℃/min速率升至90 ℃，再以40 ℃/min速率升至270 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣；設(shè)置流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣體積1.0 μL。

1.3.3.2 MS條件

電離方式：電子轟擊；離子源溫度230 ℃；GC-MS接口溫度280 ℃；監(jiān)測(cè)方式：選擇性離子監(jiān)測(cè)；監(jiān)測(cè)離子：定性離子m/z71、81、95，定量離子m/z123。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

式中：X為樣品中植醇對(duì)映異構(gòu)體含量/（mg/kg）；ρ為測(cè)定液中植醇對(duì)映異構(gòu)體的含量/（μg/mL）；V為樣品測(cè)定液的定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

選用HP-1701MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、HP-INNOWAX-MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）3 種常見不同極性毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，HP-5MS具有較好分離效果，而采用其他2 種色譜柱進(jìn)行分析時(shí)，色譜峰拖尾現(xiàn)象較為嚴(yán)重，且目標(biāo)組分與雜質(zhì)分離效果較差，對(duì)結(jié)果定量存在較大的干擾。同時(shí)，柱箱的升溫程序?qū)Ω鹘M分分離度也存在一定影響。最終經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索，參照1.3.3.1節(jié)升溫程序時(shí)，實(shí)驗(yàn)樣品中雜質(zhì)峰干擾小，并且能獲得較滿意的分離效果。

2.2 提取方法的選擇

實(shí)驗(yàn)室常見的提取方法主要包括3 種：索氏提取、超聲提取及液-液萃取。索氏提取存在過(guò)程復(fù)雜、溶劑消耗量大、不經(jīng)濟(jì)等缺點(diǎn)；液-液萃取，對(duì)于乳制品易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，造成提取效率下降；而超聲提取則具有簡(jiǎn)單、適合大批量樣品處理且提取效率較高等特點(diǎn)，所以綜合考慮，選擇超聲提取作為提取本實(shí)驗(yàn)樣品的方法。

2.3 提取溶劑的選擇

因植醇屬于脂溶性化合物，實(shí)驗(yàn)室常見可供選擇的提取試劑有乙腈、乙酸乙酯、正己烷、石油醚等。比較上述4 種常見提取溶劑對(duì)花生酸乳中植醇對(duì)映異構(gòu)體的提取效率。由圖1可知，相同加標(biāo)水平（1.0 mg/kg）下，正己烷與石油醚提取效率相當(dāng)，植醇對(duì)映異構(gòu)體的加標(biāo)回收率均維持在90%左右，高于其他2 種提取試劑，但考慮到石油醚經(jīng)濟(jì)成本較低，故選擇石油醚作為植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)花生酸乳中植醇加標(biāo)回收率的影響（n= 3）Fig. 1 Effect of different extraction solvents on spiked recoveries of phytol (n = 3)

2.3 凈化方法的選擇

因植物性乳制品中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等化合物，屬于基質(zhì)復(fù)雜樣品，易對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生干擾，因此需對(duì)其進(jìn)行凈化處理。實(shí)驗(yàn)室常見的凈化方法有弗羅里硅土固相萃取柱凈化、C18固相萃取柱凈化及QuEChERS凈化管（內(nèi)含乙二胺-N-丙基硅烷、硫酸鎂等填料）凈化3 種方式。通過(guò)相同水平（1.0 mg/kg）加標(biāo)實(shí)驗(yàn)比較3 種方式的凈化效果。由圖2可知，樣品經(jīng)超聲提取后的樣液經(jīng)C18固相萃取柱凈化處理后，植醇加標(biāo)回收率高于其他2 種凈化方式，因此，選擇C18固相萃取柱作為植物性乳制品中植醇檢測(cè)的凈化方法。

圖2 不同固相萃取柱對(duì)花生酸乳中植醇加標(biāo)回收率的影響（n= 3）Fig. 2 Effect of different SPE columns on spiked recoveries of phytol (n = 3)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)譜圖與線性范圍

由圖3可知，植醇對(duì)映異構(gòu)體色譜峰型均呈現(xiàn)良好，二者分離效果好，且附近均無(wú)雜質(zhì)峰干擾。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)選取的對(duì)映異構(gòu)體定量離子均為m/z123，該離子豐度較高，便于準(zhǔn)確定量。分別以植醇對(duì)映異構(gòu)體的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL），響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0～1.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，r均大于0.999。

圖3 植醇對(duì)映異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品的選擇性離子監(jiān)測(cè)譜圖Fig. 3 Selected ion monitoring chromatograms of phytohydrin enantiomers

2.5 方法檢出限與定量限

注入一定質(zhì)量濃度的植醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 μL，將3 倍信噪比作為本實(shí)驗(yàn)方法的檢出限，經(jīng)計(jì)算得E構(gòu)型與Z構(gòu)型植醇檢出限分別為0.03、0.04 mg/kg；以10 倍信噪比作為本實(shí)驗(yàn)方法的定量限，經(jīng)計(jì)算得E構(gòu)型與Z構(gòu)型植醇的定量限分別為0.09、0.10 mg/kg。

2.6 加標(biāo)回收與精密度實(shí)驗(yàn)

稱取空白樣品（E構(gòu)型與Z構(gòu)型植醇均未檢出）約10.0 g，共18 份，分別加入適量植醇標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個(gè)添加水平做6 份平行，計(jì)算加標(biāo)回收率，由表1可知，在不同加標(biāo)水平下，E構(gòu)型植醇、Z構(gòu)型植醇平均加標(biāo)回收率分別為78.6%～93.5%、79.5%～94.7%，二者相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于10%。

表1 植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體加標(biāo)回收率與精密度Table 1 Recoveries and precision of phytol enantiomers in spiked blank samples

2.7 植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體含量測(cè)定

由表2可知，10 種植物性乳制品中有8 種檢出植醇對(duì)映異構(gòu)體，且E構(gòu)型含量普遍高于Z構(gòu)型，但總體含量都不高，基本上處于定量限附近。

表2 10 種植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體的檢出情況Table 2 Results of detection of phytol enantiomers in 10 plant-based dairy products

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)前處理過(guò)程，如提取方法、提取溶劑及凈化方式等進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，建立固相萃取-GC-MS法測(cè)定植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體的分析方法，該方法具有靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)，為植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體的開發(fā)與利用提供了一定技術(shù)手段。通過(guò)對(duì)市面上常見10 種植物性乳制品中植醇對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行隨機(jī)檢測(cè)，為植物性乳制品中植醇含量的監(jiān)測(cè)及植物中植醇的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。