白斑綜合征病毒(WSSV)滅活制劑對克氏原螯蝦抗WSSV的研究

裘杰珂，賴勇勇，許英蕾，朱 斐

（浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

白斑綜合征病毒(WSSV)是線頭病毒科Nimaviridae 白斑病毒屬Whispovirus的唯一成員[1]。在電子顯微鏡下可以觀察到WSSV 的核衣殼呈棒狀，核衣殼表面有3 層膜交叉覆蓋，并形成陰影，核衣殼的一端還有一個獨(dú)特的尾狀結(jié)構(gòu)。WSSV 的核衣殼由14 個環(huán)組成，其中包含1 個約300 kb 的圓形dsDNA 基因組[2]，是迄今為止被完全測序的最大動物病毒之一[3]。在養(yǎng)殖條件下，感染W(wǎng)SSV 的蝦類可在3～10 d內(nèi)死亡[4]。另外，WSSV 還會感染其他甲殼類動物，其中就包括克氏原螯蝦Procambarusclarkii[5-6]。WSSV 危害大、傳播快，已對中國蝦類養(yǎng)殖業(yè)造成了數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失。然而常規(guī)的化學(xué)和物理方法并不能有效地控制WSSV 對蝦類的感染。因此，找到并采取合理的預(yù)防手段才是控制該病毒病的關(guān)鍵。有關(guān)物理和化學(xué)消毒方法對WSSV 的滅活作用已有較多報道[7-10]，已確定了溫度、紫外線、pH、臭氧、鹽度、干燥和化學(xué)消毒劑等因素對WSSV 滅活的影響。有研究發(fā)現(xiàn)：大部分化學(xué)試劑對WSSV 滅活后，WSSV 的免疫原性會受到損害[7,9-11]，而雙乙烯亞胺(BEI) 對免疫原性的損害相對較小，因此BEI 是對含有DNA 或RNA 基因組動物病毒的首選滅活劑[12-14]?；诖?，本研究從WSSV 滅活制劑著手，用BEI 滅活WSSV，通過口服和注射途徑分別建立克氏原螯蝦的主動免疫體系，再對其進(jìn)行抗WSSV 感染的效果研究，分析WSSV 滅活制劑對WSSV 的防治效果，為防治WSSV 提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

LAI 等[15]研究可知：超聲破碎WSSV 后獲得的蛋白質(zhì)和核酸可以感染克氏原螯蝦并導(dǎo)致其死亡，其有效性與完整的WSSV 病毒一樣。因此，本研究對病毒進(jìn)行超聲破碎，之后進(jìn)行BEI 滅活，觀察BEI 滅活制劑是否具有與超聲破碎制劑相同的抗WSSV 效果。本研究分為口服和注射免疫，免疫7 d 后再進(jìn)行WSSV 攻毒感染。具體分組如表1所示?？耸显r購于安徽宣城，養(yǎng)殖于充氣水箱中，水溫為25 ℃，每日投喂克氏原螯蝦專用飼料。

1.2 超聲破碎WSSV

取經(jīng)過WSSV 感染的克氏原螯蝦的尾部肌肉，參考ZHU 等[16]的方法提純WSSV。使用高速分散器將WSSV 提純液快速分散呈勻漿，用超高速冷凍離心機(jī)在6 000g下離心10 min，分離上清液后再次離心，重復(fù)3 次。離心完成后，肌肉組織已基本去除，WSSV 病毒存在于上清液中。將上清液通過300 目細(xì)胞篩過濾分散后，用離心機(jī)在6 000g下離心30 min。再將分離出的上清液通過450 nm的濾膜后，用離心機(jī)在30 000g下離心30 min，最后得到WSSV 病毒粒子的白色沉淀。將提取到的病毒粒子用10 mL 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶解后，使用FS 200 T 超聲波均質(zhì)機(jī)(上海盛溪)破碎溶解的病毒顆粒。破碎完成后，在30 000g條件下對超聲破碎的病毒粒子離心30 min，離心得到的上清液便是WSSV 病毒粒子的破碎液，使用100 nm 濾膜進(jìn)行過濾，即為WSSV 超聲破碎液。

1.3 BEI 滅活WSSV 破碎液

將0.12 mol·L-1BEI 溶液按1∶60 的體積比加入到病毒液中，使BEI 的最終分子濃度為2 mmol·L-1。在37 ℃下恒溫滅活3 個不同時間段(1、12、24 h)的病毒液，期間每2 h 攪拌1 次。經(jīng)過規(guī)定時間后，剩余BEI 以50∶1 的體積比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% 的硫代硫酸鈉使滅活中止，制成WSSV 滅活制劑。每100 mL WSSV 滅活制劑中含45 mg WSSV 粒子，WSSV 滅活制劑中WSSV 的質(zhì)量濃度為0.45 g·L-1。

1.4 免疫攻毒實(shí)驗(yàn)

克氏原螯蝦養(yǎng)殖于(25±1) ℃控溫玻璃缸中，隨機(jī)分成10 組，每組20 只，每組設(shè)3 個重復(fù)，投喂配合飼料暫養(yǎng)7 d。將WSSV 超聲破碎液與飼料混合均勻，混合5 min 后用蜂膠液包被，風(fēng)干10 min 后投喂受試克氏原螯蝦。將WSSV 提純液與克氏原螯蝦飼料混合均勻，混合5 min 后用蜂膠液包被，風(fēng)干10 min后投喂受試克氏原螯蝦。7 d 后所有實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行攻毒研究，期間保證每組克氏原螯蝦攝食等量的飼料，同時記錄每日死亡率。

2 結(jié)果與分析

從表2可見：經(jīng)BEI 處理WSSV 24 h 后，注射和口服免疫克氏原螯蝦的死亡率為0，說明沒有感染性；而BEI 滅活WSSV 破碎處理液1 h 的注射死亡率為100.0%，口服死亡率為10.0%，BEI 處理12 h的注射死亡率為33.3%，口服死亡率為0，說明口服免疫更安全，注射免疫危險性比較高，但是BEI 處理時間過短也會使病毒沒有完全滅活，因此BEI 滅活24 h 較為安全，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用BEI 滅活WSSV 破碎液24 h 的制劑。

表2 BEI 滅活WSSV 感染克氏原螯蝦的死亡率Table 2 Mortality of P. clarkii infected with BEI-inactivated WSSV

從表3可見：WSSV 無論是通過口服感染還是注射感染，死亡率均為100%。用BEI 滅活WSSV破碎液1 和12 h 分別采用注射或口服免疫克氏原螯蝦，雖然免疫過程中死亡了一些，但將活著的克氏原螯蝦7 d 后攻毒，口服的存活率為30%～40%，注射的效果較差，最后的存活率為20%(圖1)。以上結(jié)果說明滅活時間延長后，不但滅活更完全，而且滅活制劑的保護(hù)效果更好，因此在后續(xù)的研究中采用了24 h 的滅活時間。用BEI 滅活WSSV 破碎液24 h制成滅活制劑，采用注射或口服免疫克氏原螯蝦7 d后分別注射、口服攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WSSV 滅活制劑的口服免疫效果明顯，比起注射WSSV 組和口服WSSV 組的100% 死亡率，注射免疫的克氏原螯蝦在攻毒后存活率為40%，口服免疫的存活率為50%(圖2)；經(jīng)滅活制劑免疫7 d 后，再去感染W(wǎng)SSV，極大地降低了死亡率，免疫效果比較明顯。

圖1 BEI 滅活WSSV 破碎液免疫7 d 后攻毒克氏原螯蝦的存活率Figure 1 Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

圖2 BEI 滅活WSSV 制劑免疫7 d 后攻毒克氏原螯蝦的存活率Figure 2 Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV immunization

表3 BEI 滅活WSSV 制劑免疫7 d 后攻毒克氏原螯蝦的死亡率Table 3 Mortality rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

3 討論與結(jié)論

已有研究表明：WSSV 囊膜蛋白可以誘導(dǎo)甲殼動物對WSSV 產(chǎn)生抵抗力，從而大幅提高WSSV 攻毒后的成活率；多糖(如葡聚糖、殼聚糖、甲殼素)也被認(rèn)為能提高甲殼動物的免疫力，并被廣泛用于提高甲殼動物抗細(xì)菌性和病毒性疾病的研究[6-8]。由BEI 滅活的WSSV 滅活制劑，可以保護(hù)WSSV 囊膜蛋白的完整性[16]，使其免疫原性最大限度不受破壞。

本研究表明：用BEI 滅活的WSSV 滅活制劑免疫接種克氏原螯蝦7 d 后，可在一定程度上保護(hù)克氏原螯蝦免受WSSV 的侵害?？耸显r對WSSV 非常敏感，通過口服和注射途徑的克氏原螯蝦死亡率都超過90%[17]。在本次研究中，隨著滅活時間的延長，注射和口服2 mmol·L-1BEI 滅活WSSV 制劑的克氏原螯蝦存活率越來越高，說明只要滅活時間足夠，使用BEI 滅活的WSSV 滅活制劑可以成功地保護(hù)克氏原螯蝦免受WSSV 的侵害。NAMIKOSHI 等[11]使用甲醛滅活的WSSV 也獲得了類似的結(jié)果，受免疫保護(hù)的對蝦Penaeusjaponicus在WSSV 攻毒實(shí)驗(yàn)中存活率顯著升高。同樣，紫外線滅活的WSSV對日本對蝦Marsupenaeusjaponicus也有一定的免疫保護(hù)效果[18]。這就引發(fā)了甲殼動物中是否存在免疫記憶的猜想[19]，但要證實(shí)其中的免疫機(jī)制還有待更深入的研究。

綜上所述，BEI 滅活的WSSV 免疫克氏原螯蝦的效果十分明顯，并且口服免疫的保護(hù)效果優(yōu)于注射免疫。與BEI 的滅活純病毒液24 h 相比，BEI 滅活的WSSV 破碎液減少了滅活時間，但最終也是口服免疫的效果較好。用BEI 滅活的WSSV 滅活制劑飼喂克氏原螯蝦后，可以有效地降低克氏原螯蝦感染病毒的死亡率，說明用BEI 滅活的WSSV 滅活制劑對克氏原螯蝦抗WSSV 具有保護(hù)性效果，可成為抗白斑綜合征的一種免疫策略。

4 致謝

感謝浙江杭州康德權(quán)科技有限公司的經(jīng)費(fèi)支持。