土壤酶活性對不同植物連作的差異響應(yīng)

顏顧浙，方 偉，盧絡(luò)天，蔣逸捷，張 笑，馬曉敏，邱 巍，徐秋芳

（浙江農(nóng)林大學 環(huán)境與資源學院，浙江 杭州 311300）

同一塊土地連續(xù)種植同一作物或近緣作物，即使在正常的栽培管理狀況下，也會出現(xiàn)植株長勢變?nèi)?、病蟲害嚴重、作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降等的現(xiàn)象為連作障礙[1]，很多作物都存在這一現(xiàn)象[2-5]。目前，中國連作危害程度高的地塊面積超過10%，當季作物損失占20%～80%，嚴重的甚至幾乎絕產(chǎn)。連作障礙每年造成數(shù)百億元的經(jīng)濟損失，同時還降低了農(nóng)作物的安全性[6]。作物輪作、間作、套作等增加生物多樣性的方法是解決連作障礙的有效措施，但都僅是短期內(nèi)的改善，且操作上存在諸多不便，推廣應(yīng)用不理想。中國土地利用指數(shù)高、經(jīng)營強度大，同一地區(qū)集中連作1～2 種植物是當下農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要模式[7]。因此，目前提出的解決連作障礙的技術(shù)與方法，難以從本質(zhì)上解決連作障礙問題[8]。以“作物連作障礙”為關(guān)鍵詞，統(tǒng)計1989—2018年的結(jié)果表明：突現(xiàn)度(某變量出現(xiàn)頻次在較短時間內(nèi)突然增加)排名前二位的分別是黃豆Glycinemax(35.309 4)、馬鈴薯Solanumtuberosum(28.986 6)[9]，說明這2 種植物連作障礙問題嚴重。而禾本科植物連作障礙的研究報道極少，說明實際生產(chǎn)中禾本科Poaceae 植物很少出現(xiàn)連作障礙。禾本科作物還常常作為連作障礙首選的間作或輪作對象，如對枸杞Lycium chinense與禾草間作研究發(fā)現(xiàn)：土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性、枸杞生長速率和產(chǎn)量以及禾草生物量等指標均表現(xiàn)為間作高于枸杞單獨連作，間作對枸杞分枝的促進作用尤為顯著[10]。胡麻Linum usitatissimum與小麥Triticumaestivum輪作可減弱土壤水提液對胡麻種子萌發(fā)以及生長的自毒作用，利于胡麻的生長[11]。可見，不同植物耐受連作障礙的能力不同。

土壤酶是大部分物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的執(zhí)行者[12]，土壤酶活性是衡量土壤肥力的重要指標之一[13]。在植物生長過程中，根系不斷分泌代謝產(chǎn)物到根際土壤，對土壤微生物活動產(chǎn)生顯著影響，從而影響土壤酶活性，由此改變了根際環(huán)境土壤的理化性質(zhì)，特別是各種養(yǎng)分的生物有效性以及養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化速率[14]。隨著連作時間的延長，植株細胞膜的通透性增加，養(yǎng)分物質(zhì)運輸功能下降，引發(fā)自毒作用，作物的正常生長也受到影響[15]，雖然對連作障礙這一農(nóng)業(yè)生產(chǎn)老大難問題已經(jīng)開展了大量研究[9]，但同時比較多科植物連作過程中生物化學變化的研究未見報道。為此，本研究通過比較多科植物連作過程中土壤酶活性的差異變化，假設(shè)植物遺傳特性是耐連作障礙的重要因子，為耐連作障礙的發(fā)生機制研究提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江農(nóng)林大學實習基地的森林土壤和育苗基質(zhì)1∶1 的體積比混合均勻后為盆栽本底土，該土結(jié)構(gòu)疏松、質(zhì)地優(yōu)良，具有良好的保水保肥效果。森林土壤基本理化性質(zhì)：pH 5.21，速效鉀為193.33 mg·kg-1，堿解氮為51.17 mg·kg-1，有效磷為6.00 mg·kg-1，全氮為1.33 g·kg-1，全碳為28.50 g·kg-1。育苗基質(zhì)基本理化性質(zhì)：有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)大于45%，pH 5.50～7.00，含少量的氮磷鉀物質(zhì)?；旌虾蟮耐羛H 5.42。植物包括：豆科Fabaceae 花生Arachishypogaea、黃豆Glycinemax，葫蘆科Cucurbitaceae 西瓜Citrulluslanatus、南瓜Cucurbitamoschata，茄科Solanaceae 番茄Solanumlycopersicum、馬鈴薯Solanum tuberosum，禾本科Poaceae 早熟禾亞科Pooideae 二穗短柄草Brachypodiumdistachyon(Bd-21，模式植物)、黑麥草Loliumperenne、小麥Triticumaestivum，黍亞科Pamicinae 玉米Zeamays、高粱Sorghum bicolor。選擇飽滿，大小均勻的種子，所有種子在播種前均經(jīng)過氧化氫滅菌消毒和催芽。

1.2 試驗設(shè)計

進行單一作物長期連作的盆栽試驗，每種植物至少6 盆(即重復(fù))，連續(xù)種植3 季?？紤]不同植物的生物量盡量一致的原則，花生、黃豆、西瓜、南瓜、番茄、馬鈴薯、二穗短柄草、黑麥草、小麥、玉米、高梁分別栽培5、5、5、5、7、2、10、40、10、5、5 株·盆-1，所選植物生長均勻，長勢一致。

1.3 盆栽試驗

于浙江農(nóng)林大學人工氣候箱進行試驗，氣候箱栽培條件為25 ℃、光照16 h，18 ℃、黑暗 8 h 的晝夜循環(huán)，生長旺季時溫度調(diào)至30 ℃。土壤水分基本保持在75%的田間持水量，其他栽培管理措施按一般要求進行，各盆保持一致。注意抗旱、防病蟲，保證全苗及植株正常生長發(fā)育。

種植時間和采樣時間如表1所示，每茬植物的收獲時間處于該植物營養(yǎng)生長時期，根據(jù)植物生長的情況可適當調(diào)整采樣時間，栽培時長為38～55 d，共采集3 茬，鑒于本底土壤速效鉀質(zhì)量分數(shù)高、而氮磷質(zhì)量分數(shù)低的實際情況，在第1 季時選擇磷酸二銨[(NH4)2HPO4]作為追肥[氮磷鉀質(zhì)量比(N∶P2O5∶K2O)為18∶46∶0]。肥料按照肥質(zhì)量比1∶50 進行配置，每盆每次澆50 mL，均以每季植物能正常生長為依據(jù)適當補施肥料，每季澆施3 次。選擇生長一致的4 個重復(fù)，分別采集第1 季和第3 季的土壤樣品，分析土壤酶以及土壤性質(zhì)。收獲時植物根系基本充滿整個盆，密布于土壤之間，植物根系對土壤的影響涉及大部分土壤，可以認為盆中土壤均為根區(qū)土壤。將植物取出后的盆中土壤充分混勻后得到混合樣品，風干待測。

表1 植物栽培和收獲時間表Table 1 Schedule for transplanting and harvesting

1.4 土壤酶活性的測定

測定土壤碳、氮、磷循環(huán)的3 類土壤酶：①碳循環(huán)土壤酶，包括α-葡萄糖苷酶(AG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、纖維二糖水解酶(CB)、β-木糖苷酶(XYL)；②氮循環(huán)土壤酶，包括亮氨酸氨基肽酶(LAP)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)；③ 磷循環(huán)土壤酶，為酸性磷酸酶(PHOS)。酶活性測定采用SAIYACORK 等[16]的熒光微孔板檢測技術(shù)，具體測定方法：稱取2 g 土壤，加入醋酸緩沖液進行浸提，取200 μL 浸提液與96 孔板后立即加入反應(yīng)底物，25 ℃ 培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 h，使用多功能酶標儀(SynergyTM H1，Biotek)在365 和450 nm 波長下測定吸光度并計算土壤酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物土壤pH 及有效氮、磷差異

重點分析與土壤碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活關(guān)聯(lián)最大的pH、堿解氮和有效磷等3 個指標(表2)。與本底土壤pH 5.42 相比，除玉米土壤外，其他植物種植1 季后，土壤pH 普遍下降，其中豆科植物下降幅度最小，而西瓜最大；第3 季又比第1 季下降，所有土壤pH 均在4.5 以下，土壤呈強酸性。連作后土壤堿解氮及有效磷明顯增加，第1 季土壤堿解氮質(zhì)量分數(shù)西瓜最低、玉米最高，有效磷質(zhì)量分數(shù)則是南瓜最高、小麥最低。第3 季時土壤有效磷質(zhì)量分數(shù)比第1 季大幅增加，而堿解氮則有增有減。

表2 第1 季和第3 季植物收獲后不同植物根區(qū)土壤化學性質(zhì)比較Table 2 Comparison of soil chemical properties in root zone of different plants after harvest in the first and third seasons

2.2 不同植物土壤根際酶活性差異

2.2.1 第1 季不同植物土壤碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性差異 第1 季土壤碳循環(huán)相關(guān)的AG 和BG 活性水平相近(圖1A 和B)，AG 活性較高的有南瓜、番茄、黑麥草和玉米，而小麥和高粱最低；BG 活性較低為黃豆、馬鈴薯和玉米，較高組為花生、南瓜、黑麥草和高粱，同科植物均存在較大差異，甚至達顯著水平(P＜0.05)。CB 活性總體低于AG 和BG，不同植物之間的高低水平與AG 基本一致； XYL 活性最高的是馬鈴薯，最低是黑麥草(圖1C 和D)。綜上所知，種植1 季后，不同植物之間4 種土壤碳循環(huán)酶活性高低順序沒有顯著分異，相對而言，幾種禾本植物的波動較大，特別是玉米在所有植物中的排序處于最高(AG 和CB)或最低(BG)的位置。與土壤氮循環(huán)相關(guān)的LAP 和NAG 活性其重復(fù)之間的變異比碳循環(huán)酶活性小，但南瓜土壤LAP 活性異常高，其他植物之間沒有顯著差異(圖1E)；NAG 活性最高的是高粱，最低是馬鈴薯和二穗短柄草(圖1F)。PHOS 活性在不同植物之間的差異是所有酶中最小的，總體而言，禾本科植物高于非禾本科植物，其中最高的還是高粱(圖1G)。

圖1 第1 季不同植物土壤根區(qū)酶活性Figure 1 Soil rhizosphere enzyme activities of different plants after the first season

分析第1 季所有植物土壤酶活性之間的相關(guān)性結(jié)果發(fā)現(xiàn)：顯著相關(guān)性只存在于AG 與PHOS(R=-0.647)、BG 與XYL (R=-0.605)及LAP (R=0.653)、CB 與XYL (R=-0.704)，說明不同植物對土壤酶活性影響強度、甚至方向不相同，顯著負相關(guān)(3 組)多于顯著正相關(guān)(1 組)。

2.2.2 第3 季不同植物土壤碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性差異 第3 季植物土壤酶活性，除XYL 外，土壤酶活性的重復(fù)之間變異也顯著縮小(圖2)，其主要規(guī)律為非禾本科植物AG 高于禾本科植物、而CB 則相反；不同植物之間土壤BG 活性差異不顯著；禾本科植物XYL 活性總體高于非禾本科植物。綜上所知，種植3 季植物后，二穗短柄草土壤幾種碳循環(huán)相關(guān)酶活性總體較高，而玉米則總體較低。不同植物土壤2 種氮循環(huán)酶活性沒有一致的差異規(guī)律。土壤磷循環(huán)相關(guān)的PHOS 活性則是同科的不同種出現(xiàn)一高一低相反的結(jié)果，二穗短柄草、黑麥草和小麥之間差異較小。

圖2 第3 季不同植物土壤根區(qū)酶活性Figure 2 Soil rhizosphere enzyme activities of different plants after the third season

分析第3 季所有植物7 種土壤酶活性之間的相關(guān)性結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有AG 與BG (R=0.763)、LAP 與PHOS (R=0.642)之間顯著相關(guān)，說明植物對不同土壤酶活性影響分異性增加。

分析土壤酶的動態(tài)變化(圖3)發(fā)現(xiàn)：與第1 季相比，第3 季植物收獲后土壤酶活性多數(shù)呈增加趨勢，其中CB 活性的增幅最明顯，而玉米則除BG 外其余土壤酶活性均出現(xiàn)降幅。

圖3 不同植物第1 季和第3 季土壤酶活性平均增幅或減幅Figure 3 Average increase or decrease percentage of soil enzyme activities in the first and third plant seasons

2.3 不同科及禾本科亞科植物根區(qū)土壤酶活性差異

將非禾本科植物以科為單位、禾本科以亞科為單位進行比較。禾本科包括二穗短柄草、黑麥和小麥等組成的早熟禾亞科(C3 植物)以及由玉米和高粱組成的黍亞科(C4 植物)。由圖4發(fā)現(xiàn)：第1 季不同科或亞科之間AG 活性無顯著差異，而第3 季的茄科顯著高于豆科和黍亞科(P＜0.05)。BG 活性第3 季各科、亞科之間無顯著差異，第1 季的葫蘆科顯著高于豆科和茄科(P＜0.05)，茄科的平均值最低。第1 季土壤的CB 活性表現(xiàn)為黍亞科顯著高于茄科(P＜0.05)，而第3 季則是黍亞科顯著低于早熟禾亞科及豆科(P＜0.05)，豆科顯著高于葫蘆科(P＜0.05)。XYL 活性第1 季無差異，而第3 季早熟禾亞科顯著高于其他科(P＜0.05)。土壤氮循環(huán)酶LAP 活性第1 季的葫蘆科顯著高于其他科(P＜0.05)，而第3 季卻沒有顯著差異；NAG 活性第1 季無差異，第3 季黍亞科顯著低于豆科、葫蘆科和早熟禾亞科(P＜0.05)。PHOS 活性第1 季時黍亞科顯著高于其他科(P＜0.05)，第3 季則是豆科顯著低于其他科(P＜0.05)。

圖4 不同科及禾本科亞科第1 季和第3 季植物根區(qū)土壤碳循環(huán)酶活性的差異Figure 4 Difference of carbon cycling enzyme activity between family or subfamily of rhizosphere soil in the first and third seasons

以科或亞科為單位統(tǒng)計分析的動態(tài)變化結(jié)果(圖5) 表明：多科植物不同酶活性大多增加；豆科、茄科和早熟禾亞科增幅最大的是CB，葫蘆科增幅最大的是PHOS，黍亞科增幅最大的是LAP。

圖5 不同科植物第1 季和第3 季土壤酶活性平均增幅或減幅Figure 5 Average increase or decrease percentage of soil enzyme activities in the first and third plant seasons based on plant family

3 討論

3.1 不同植物之間土壤根區(qū)酶活性差異分析

種植1 季植物后不同植物土壤的多項性質(zhì)產(chǎn)生差異變化，pH 5.00 以上的花生、黃豆和玉米，其中玉米pH 最高，而西瓜和二穗短柄草pH 較低，分別為4.23 和4.57。土壤堿解氮的差異規(guī)律與pH 基本一致，說明植物對氮利用越多，則土壤pH 下降越大(西瓜和高粱)，這一結(jié)果符合氮肥引起土壤酸化的結(jié)論[17]。第1 季后玉米土壤各項養(yǎng)分指標及pH 均處于較高水平，可能是其吸收利用養(yǎng)分相對較少的結(jié)果，與高粱、小麥土壤差異明顯。另外，除BG 外，玉米土壤的其他3 種碳循環(huán)酶活性均較高，而小麥則較低。玉米土壤酶活性與土壤養(yǎng)分呈正相關(guān)，與已有研究結(jié)果[18]一致。玉米和小麥土壤AG 活性與BG 活性相反，說明高水平土壤養(yǎng)分不利于BG 活性發(fā)揮。BG 水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵，與纖維素降解有關(guān)，由于纖維素的貧營養(yǎng)特征，因此，分解纖維素的微生物能夠長期適應(yīng)低養(yǎng)分水平土壤環(huán)境[19]。番茄和馬鈴薯土壤也是AG 活性高，BG 活性低，土壤氮磷水平總體與玉米相近。除了土壤養(yǎng)分外，植物也能通過根系分泌物影響土壤微生物，從而間接影響土壤酶活性。土壤LAP 活性除南瓜異常高外，其他植物之間差異不大。南瓜土壤LAP 活性異常高的原因可能與其根系分泌物存在誘導(dǎo)LAP 活性提高的成分。南瓜被廣泛用作砧木以緩解西瓜、黃瓜、甜瓜、冬瓜和苦瓜等多種植物連作障礙[20-24]，這與南瓜土壤較高的LAP 活性有關(guān)。高粱土壤的NAG 活性最高，BG 活性也最高，NAG 與幾丁質(zhì)降解有關(guān)，幾丁質(zhì)是真菌細胞壁的主要成分。高粱土壤可能存在較豐富的纖維素[25]，促進降解纖維素的真菌大量繁殖，從而積累含幾丁質(zhì)的大量真菌生物殘體，誘導(dǎo)NAG 活性增加。高粱土壤PHOS 活性顯著高于其他植物，已有研究表明：土壤有效磷較低可誘導(dǎo)PHOS 活性[26-28]，由此推測，高粱土壤PHOS 活性顯著高是因為其土壤有效磷低于其他植物。本研究土壤PHOS 活性總體均低于其他研究報道[29-30]。

種植3 季作物后，土壤pH 較第1 季下降0.50～1.16，玉米仍然是所有植物中最高(4.27)，而西瓜、馬鈴薯和二穗短柄草則低于4.0；土壤堿解氮、有效磷顯著增加，特別是有效磷增加了2～3 倍，原因是本底土壤有效磷很低(6.00 mg·kg-1)，氮素水平也偏低(堿解氮51.17 mg·kg-1)，而速效鉀豐富(193.33 mg·kg-1)，因此種植過程中追施高磷的磷酸二銨肥料以保證植物養(yǎng)分需求。第3 季時土壤養(yǎng)分水平過高對土壤酶活性產(chǎn)生一定的負面影響，而二穗短柄草雖然其土壤pH 僅3.93，但土壤氮磷水平較低，反而其各種土壤酶活性均較高；馬鈴薯土壤pH、養(yǎng)分水平與二穗短柄草相近，除XYL 和NAG 酶外，其他5 種酶活性也較高。相反的情況發(fā)生在玉米，土壤養(yǎng)分水平較高但土壤各種酶活性相對較低，說明高水平養(yǎng)分對玉米土壤酶活性的負面影響比其他植物強。從第3 季土壤酶的增減幅度結(jié)果證明：玉米土壤僅BG 活性有小幅增加，其他6 種酶均下降；而CB 活性總體增幅最大，其中小麥和馬鈴薯分別增加519%和267%。CB 水解纖維素釋放纖維二糖，其增幅最大的原因可能：一是連作后真菌數(shù)量增加[31-32]，真菌是分解纖維素的最主要類群； 二是隨著種植次數(shù)增加，土壤中纖維素不斷積累，誘導(dǎo)微生物分泌CB。這與王雨晴等[33]的研究一致，即CB 活性與纖維素含量及真菌基因豐度呈極顯著正相關(guān)。

3.2 不同科及禾本科亞科植物根區(qū)土壤酶活性的差異分析

禾本科植物存在著廣泛的基因序列和功能的保守性[34]，其他同科植物也有共性的遺傳基因。一般而言，遺傳相近的植物具有相似的根系分泌物、對養(yǎng)分的需求也較相似，由此推測，同一科植物對土壤微生物以及土壤酶活性可能有共性影響。第1 季植物收獲后，只有BG (葫蘆科顯著高于豆科和茄科)和CB(黍亞科顯著高于茄科) 2 種酶存在科之間的顯著差異，而第3 季收獲后僅BG 和LAP 不存在顯著差異，說明隨著種植季數(shù)的增加，同科植物對土壤的共性影響逐漸顯現(xiàn)。BG 和CB 都是降解纖維素的酶，最初的本底土壤微生物較少，而種植1 季后土壤微生物大量繁殖，由于不同植物根系分泌物以及根系殘體化學組成的差異，特別是根系殘體中纖維素較多，由此引起不同科植物纖維素降解相關(guān)酶的差異。第3 季時不同科植物土壤酶活性之間的差異加大，雖同為早熟禾亞科植物，但二穗短柄草在遺傳上與小麥及黑麥草距離相對較遠，因此第3 季時其土壤AG 和BG 活性明顯高于小麥及黑麥草。第3 季時非禾本科植物土壤AG 活性明顯高于禾本科植物，最高是茄科，而XYL 則正好相反，其中最高的是早熟禾亞科。AG 和XYL 都是大分子有機物水解的末端酶，非禾本科植物土壤AG 活性高，說明土壤中其上游大分子有機物中α-葡萄糖苷鏈接的多糖(如淀粉)較多，而禾本科植物土壤XYL 活性高，說明土壤中上游大分子有機物中β-木糖苷酶鏈接的半纖維素多糖較多。也可能是禾本科植物的根系分泌物與非禾本科植物存在差異[35]。禾本科植物中早熟禾亞科土壤CB 活性較高，但黍亞科則明顯低于非禾本科植物，可能C3 和C4 植物的碳代謝物存在差異，需要后繼分析根系分泌物。不同科植物第3 季土壤CB 和XYL 活性的高低與第1 季正好相反，豆科和茄科土壤CB 活性明顯升高，而黍亞科下降，茄科土壤XYL 活性明顯下降，而早熟禾亞科升高，說明CB 和XYL 可能存在互補關(guān)系。另外，禾本科植物土壤的XYL 活性顯著高于非禾本科植物，可能是禾本科植物土壤中半纖維素含量較豐富。XYL 水解半纖維素產(chǎn)生種類豐富的五碳糖和六碳糖，是否有利于土壤微生物活動值得深入研究。黍亞科土壤PHOS 活性在第1 季和第3 季土壤中均為最高，而其土壤NAG 活性在第3 季為最低。分科統(tǒng)計則土壤酶活性總體以上升為主，其中CB 活性增幅最大，而豆科和茄科的XYL 活性、葫蘆科的LAP 活性出現(xiàn)下降，黍亞科植物土壤的NAG 活性和PHOS活性都出現(xiàn)下降，說明黍亞科植物土壤的氮、磷循環(huán)能力下降，可能是氮、磷養(yǎng)分增加顯著，加上黍亞科植物對氮、磷的需求不高，因此，相關(guān)循環(huán)酶活性下降。

4 結(jié)論

通過不同科11 種植物第1 季和第3 季土壤碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)酶活性分析發(fā)現(xiàn)：同科的2 種植物不同土壤酶、同種土壤酶不同科植物的動態(tài)變化規(guī)律并不一致，第1 季和第3 季黍亞科植物土壤PHOS 活性均為最高，其中，高粱又顯著高于比玉米；第3 季時禾本科植物土壤的XYL 活性顯著高于非禾本科植物，而3 種早熟禾亞科植物土壤又顯著高于黍亞科植物。禾本科植物土壤PHOS 和XYL 活性較高是否與其耐連作有關(guān)，需要深入研究連作次數(shù)和土壤微生物指標等。