桂花OfACOs基因家族鑒定及表達(dá)分析

張 耀，王家璇，蔡 璇,2，曾祥玲,2，楊 潔,2，陳洪國(guó),2，鄒晶晶,2

（1.湖北科技學(xué)院 國(guó)家林業(yè)草原桂花工程技術(shù)研究中心，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市高新桂花產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 咸寧 437100）

桂花Osmanthusfragrans為木犀科Oleaceae 園林觀賞植物，是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，桂花樹(shù)形優(yōu)美、葉色青翠、香味馥郁，在園林中應(yīng)用廣泛[1]。目前，桂花在食品、化妝品和藥品中的應(yīng)用已經(jīng)逐漸成熟[2]，新興的桂花香水、乳液、香熏和精油等高檔化妝品也逐漸打開(kāi)市場(chǎng)[3-5]。然而，桂花花期較短，最佳觀賞期和采收期僅2～3 d，極大地限制了其觀賞價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6-7]。

已有研究證明：OfABFs 基因可能參與調(diào)控桂花花瓣衰老[8]；蔣琦妮等[9]研究發(fā)現(xiàn)：桂花OfAP1 基因在桂花成花轉(zhuǎn)變、花芽分化和發(fā)育中有重要作用。向其柏等[10]研究發(fā)現(xiàn)：許多經(jīng)濟(jì)采收價(jià)值較高的桂花品種對(duì)乙烯敏感，非授粉誘導(dǎo)的內(nèi)源乙烯躍變是其衰老的重要調(diào)控因子。朱誠(chéng)等[11]研究表明：盛花末期乙烯釋放量的迅速增加及膜脂過(guò)氧化程度加劇是導(dǎo)致‘薄葉金桂’O.fragrans‘Baoye Jingui’衰老的主要生理原因。ZHOU 等[12]發(fā)現(xiàn)：外源乙烯利處理明顯加速‘厚瓣金桂’O.fragrans‘Houban Jingui’和‘柳葉金桂’O.fragrans‘Liuye Jingui’的衰老，而乙烯抑制劑硫代硫酸銀則延長(zhǎng)了其觀賞壽命。ZOU 等[6]發(fā)現(xiàn)‘柳葉金桂’內(nèi)源乙烯躍變峰的出現(xiàn)與花瓣褐化、脫落等衰老特征同時(shí)發(fā)生，外源乙烯處理不僅明顯加速了切花花瓣的萎蔫和脫落，還導(dǎo)致花瓣細(xì)胞中央大液泡破裂、各細(xì)胞器扭曲擠縮變形，加劇了 DNA 斷裂，降低了抗氧化酶活性，增加了超氧自由基的激發(fā)和膜脂過(guò)氧化程度。由此可見(jiàn)：桂花是乙烯敏感型花卉，乙烯參與了其花瓣衰老過(guò)程中花瓣脫落和萎蔫、細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、氧化還原系統(tǒng)及核酸降解等多個(gè)過(guò)程的調(diào)節(jié)，是桂花衰老的重要調(diào)控因子。然而，尚不清楚該過(guò)程中內(nèi)源乙烯合成途徑。

氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carbox-ylate oxidase,ACO)作為乙烯生物合成途徑中的最后一個(gè)關(guān)鍵酶，直接催化乙烯的合成，被認(rèn)為是高等植物中乙烯應(yīng)答的主要標(biāo)志[13]。ACO 早期被ADAMS 等[14]發(fā)現(xiàn)，并命名為乙烯形成酶，后來(lái)發(fā)現(xiàn)需要抗壞血酸和氧作為輔助底物，因此稱為ACC 氧化酶。目前，ACO 基因家族在多個(gè)物種中都有研究，SORNCHAI 等[15]通過(guò)導(dǎo)入石斛DendrobiumCpACO基因延長(zhǎng)了其花期；有研究表明：楊樹(shù)PopulusACO 基因參與調(diào)節(jié)林木莖的生長(zhǎng)發(fā)育[16]。植物ACO 基因的表達(dá)受到生長(zhǎng)素、干旱以及鹽脅迫的抑制[17]；番茄Lycopersiconesculentum、花椰菜Brassicaoleraceavar.botrytis的ACO 基因表達(dá)受脫落酸、外部機(jī)械損傷和低溫的誘導(dǎo)[18]。在擬南芥Arabidopsisthaliana中[19]，ACO1 受多種信號(hào)調(diào)控，影響植株的乙烯產(chǎn)量。然而，目前桂花中還未見(jiàn)相關(guān)基因的報(bào)道。本研究以‘柳葉金桂’為試材，利用生物信息學(xué)方法和工具對(duì)桂花OfACOs 家族進(jìn)行鑒定、進(jìn)化分析、基因結(jié)構(gòu)分析、表達(dá)模式分析等，為進(jìn)一步探索桂花花瓣衰老機(jī)制以及提高桂花園林賞花價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘柳葉金桂’花瓣采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。分別采集不同開(kāi)花階段的桂花花瓣，稱量后密封，保存在液氮中，立即運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃超低溫冰箱備用。參考CHEN 等[20]對(duì)桂花開(kāi)花級(jí)數(shù)的劃分體系，將‘柳葉金桂’開(kāi)花級(jí)數(shù)劃分為：①鈴梗期(花苞期，S1)，花朵呈緊閉的花苞狀，未展開(kāi)；②初花期(S2)，花朵微張，呈半開(kāi)放狀態(tài)；③盛花初期(S3)，花瓣進(jìn)一步展開(kāi)，夾角為45°～90°；④盛花期(S4)，花瓣完全展開(kāi)，花藥膨大淺黃色；⑤盛花后期(S5)，花瓣完全展開(kāi)，花藥萎縮變?yōu)樯詈稚?；⑥脫落?S6)，花瓣失水，部分從樹(shù)體上自然脫落。

1.2 方法

1.2.1 桂花OfACOs 基因家族成員的鑒定 ACO 基因家族成員大多含有DIOX-N (PF14226)和2OG-FeIIOxy (PF03171)保守結(jié)構(gòu)域[21]。對(duì)‘柳葉金桂’基因進(jìn)行蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)(pfam)保守結(jié)構(gòu)域注釋，以注釋到PF03171 和PF14226 保守結(jié)構(gòu)域的基因作為OfACOs 基因家族候選基因，再通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)域搜索(NCBI Conserved Domain Search Service) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)[22]進(jìn)一步驗(yàn)證候選基因的PF03171 和PF14226 結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 進(jìn)化樹(shù)分析 登錄擬南芥官網(wǎng) (www.arabidopsis.org) 下載擬南芥AtACO 基因序列信息。利用MUSCLE[23]比對(duì)各基因多序列，采用鄰接算法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類分析。

1.2.3 基因全家族鑒定及染色體定位 對(duì)‘柳葉金桂’基因進(jìn)行pfam 保守結(jié)構(gòu)域注釋，獲取OfACOs成員序列信息及其在各染色體上的定位信息，然后使用Mapchart (2.32)[24]繪制染色體上的ACO 基因。

1.2.4 基因結(jié)構(gòu)與保守Motif 分析 利用 MEME 軟件( Suite version 5.0.2，http://meme-suite.org/) 對(duì) OfACOs保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，設(shè)置Motif 個(gè)數(shù)為15 個(gè)。根據(jù)基因注釋的gff 文件，利用TBtools (v1.098775)[25]對(duì)基因結(jié)構(gòu)、Motif 進(jìn)行可視化。

1.2.5 共線性分析 為分析OfACOs 基因家族成員的重復(fù)關(guān)系，通過(guò)使用blast (2.11.0+)和MCScanX[26]對(duì)家族成員進(jìn)行共線性分析，使用默認(rèn)參數(shù)輸出數(shù)據(jù)，結(jié)果使用circos (0.69)圈圖展示。此外，下載了擬南芥ACO 基因家族成員的基因注釋文件，通過(guò)使用blast (2.11.0+)和MCScanX 對(duì)家族成員進(jìn)行共線性分析，使用默認(rèn)參數(shù)輸出數(shù)據(jù)，結(jié)果使用circos (0.69)圈圖展示。

1.2.6 OfACOs 不同組織器官表達(dá)模式分析 從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)下載桂花在根、莖、葉及不同開(kāi)花階段等組織部位的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(PRJNA679852)，以基因表達(dá)量量化指標(biāo)(FPKM)計(jì)算基因表達(dá)水平值，用 TBtools[25]對(duì)數(shù)據(jù)可視化。

1.2.7 OfACOs 不同開(kāi)花階段的表達(dá)分析 取S1～S6 不同開(kāi)花階段的桂花花瓣，按HiPure Universal RNA Kit 提取試劑盒說(shuō)明提取桂花花瓣RNA。用StarScript II RT Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10 倍備用。利用染料法(SYBR) 預(yù)混2×RealStar Fast 在ABI 7500 系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific,Inc.)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析(RT-qPCR)。RT-qPCR 體系為10.0 μL 2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix，上下游引物各0.8 μL，2.0 μL cDNA，6.4 μL ddH2O。RT-qPCR 的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；40 個(gè)循環(huán)：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s。以ACTIN作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)組織每個(gè)基因設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試驗(yàn)的每個(gè)處理進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。所有數(shù)據(jù)用SAS v.8.0 進(jìn)行方差分析和多重比較分析，在0.05 水平上進(jìn)行鄧肯氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 OfACOs 基因鑒定及染色體定位

通過(guò)pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)PF03171 和PF14226 保守結(jié)構(gòu)域注釋分析，從桂花基因組中共鑒定到122 個(gè)OfACOs 基因家族成員(圖1)。這122 個(gè)OfACOs 家族成員主要分布于除19 號(hào)染色體以外的其他22 條染色體上，其中，1 號(hào)14 條、2 號(hào)4 條、3 號(hào)13 條、4 號(hào)4 條、5 號(hào)2 條、6 號(hào)6 條、7 號(hào)和8 號(hào)各1 條、9 號(hào)7 條、10 號(hào)8 條、11 號(hào)2 條、12 號(hào)5 條、13 號(hào)和14 號(hào)各3 條、15 號(hào)4 條、16 號(hào)7 條、17 號(hào)3 條、18 號(hào)6 條、20 號(hào)8 條、21 號(hào)和23 號(hào)各1 條、22 號(hào)11 條。其中1 號(hào)染色體上基因最多，7 號(hào)、8 號(hào)、21 號(hào)和23 號(hào)染色體上分布最少。

圖1 桂花OfACOs 基因家族的染色體定位Figure 1 Chromosomal localization of OfACOs gene family in O. fragrans

用桂花OfACOs 和擬南芥AtACOs 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。通過(guò)系統(tǒng)聚類，大致將OfACOs 分為7 組，其中擬南芥基因AT1G05010、AT1G62380、AT1G77330、AT2G19590 和AT1G12010與桂花LYG005871、LYG00776 等21 個(gè)OfACOs 共存于第3 組中。其他組不存在擬南芥AtACOs基因。通過(guò)擬南芥官網(wǎng)查找發(fā)現(xiàn)這5 個(gè)基因都具有促進(jìn)乙烯生成的功能。

圖2 桂花與擬南芥ACOs 基因進(jìn)化分析Figure 2 Phylogenetic analysis of ACOs in O. fragrans and A. thaliana

2.2 桂花OfACOs 基因家族結(jié)構(gòu)及保守基序分析

進(jìn)一步對(duì)桂花122 個(gè)OfACOs 進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析(圖3)?；蚪Y(jié)構(gòu)編碼區(qū)(CDS)、非翻譯區(qū)(UTR) 分析結(jié)果表明：OfACOs 基因的CDS 數(shù)量為2～11 個(gè)，其中52 個(gè)成員含有3 個(gè)CDS 區(qū)(42.6%)，41 個(gè)成員含有4 個(gè)CDS 區(qū)(33.6%)。其中LYG025988、LYG018295、LYG001228、LYG001225、LYG028156 和LYG030913 的CDS 區(qū)分布較散。LYG000315 是CDS 區(qū)最多的基因。

圖3 桂花OfACOs 基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域Figure 3 Gene structure and conserved motifs analysis of OfACOs in O. fragrans

對(duì)122 個(gè)OfACOs 的氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析表明：OfACOs 的Motif 為4～25 個(gè)，其中，LYG022698 為最少，只有4 個(gè)Motif，而LYG028155 有25 個(gè)Motif；24 個(gè)OfACOs 成員含有14 個(gè)Motif，且其中有11 個(gè)的Motif 構(gòu)成完全相同，都位于第3 組中；幾乎所有的OfACOs 成員中都含有Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4 和Motif 7，表明在桂花OfACOs 家族中這5 個(gè)Motif 的保守性更高。

2.3 桂花OfACOs 共線性分析

基因組內(nèi)共線性分析結(jié)果(圖4A)表明：染色體復(fù)制事件發(fā)生在桂花的22 條染色體上，OfACOs 共存在394 對(duì)染色體共線性對(duì)，其中1 號(hào)染色體上最多，有84 對(duì)，說(shuō)明該基因家族可能發(fā)生了擴(kuò)張。

圖4 桂花及擬南芥ACO 基因家族共線性分析Figure 4 Collinearity analysis of ACO gene family in O. fragrans and A. thaliana

桂花與擬南芥ACO 基因家族的共線性分析表明：擬南芥的2 條染色體與桂花的15 條染色體共發(fā)生了41 對(duì)染色體復(fù)制對(duì)，其中擬南芥1 號(hào)染色體存在29 對(duì)染色體復(fù)制對(duì)(圖4B)。綜上所述，通過(guò)與擬南芥ACO 基因共線性分析，有助于利用擬南芥的基因功能探索桂花OfACOs 中相應(yīng)基因的功能。

2.4 桂花OfACOs 不同組織部位及開(kāi)花時(shí)期的表達(dá)模式分析

具有相同的DIOX-N (PF14226)和2OG-FeII-Oxy (PF03171)保守結(jié)構(gòu)域并不一定能行使相同的蛋白功能。為更準(zhǔn)確地篩選OfACOs 蛋白，通過(guò)swiss-prot 同源序列對(duì)比[27]，篩選出27 個(gè)基因家族成員。對(duì)27 個(gè)OfACOs 成員在根、莖、葉、花芽，以及不同開(kāi)花階段(S1～S6)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。由圖5可知：除去FPKM 小于1 的成員后，在根莖葉花中表達(dá)的OfACOs 成員共計(jì)17 個(gè)。其中，LYG013745、LYG034324、LYG027159、LYG027160 主要在根中微量表達(dá)；LYG007706 主要在根、葉和花中表達(dá)；LYG007045、LYG030899、LYG036697 主要在莖、葉和花中表達(dá)；LYG034328 在葉和花中表達(dá)；LYG003688、LYG006223、LYG006760、LYG034327、LYG034329 在根、莖、葉、花中均有表達(dá)；LYG034330主要在根、莖、葉中表達(dá)；LYG035696 主要在根和花中表達(dá)；LYG036707 在開(kāi)花后期微量表達(dá)。

圖5 桂花OfACOs 基因家族在桂花不同組織部位以及不同開(kāi)花階段中的表達(dá)分析Figure 5 Expression profiles of OfACOs gene family in different tissues and different flowering stages of O. fragrans

2.5 不同開(kāi)花時(shí)期OfACOs 表達(dá)分析

綜合OfACOs 基因家族在不同組織部位以及不同開(kāi)花時(shí)期的表達(dá)量，以在桂花花瓣中明顯表達(dá)的成員作為參與乙烯途徑花瓣衰老調(diào)控的研究對(duì)象，篩選出LYG003688 、LYG006223 、LYG034327、LYG034329、LYG034330、LYG035696、LYG007706、LYG007045、LYG030899、LYG036697、LYG034328、LYG036707等12 個(gè)成員，其中LYG006223、LYG-007706、LYG007045、LYG035696 等4 個(gè)基因在開(kāi)花后期(S5 或S6)極顯著差異上調(diào)表達(dá)。

進(jìn)一步對(duì)這4 個(gè)OfACOs 成員進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證分析(圖6)。結(jié)果表明：這4 個(gè)成員在開(kāi)花后期(S5 或S6) 顯著性差異上調(diào)表達(dá)(P＜0.05)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

圖6 桂花花瓣候選OfACOs 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析Figure 6 RT-qPCR analysis of candidate OfACOs genes in O. fragrans

3 討論

ACO 基因家族是植物的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物乙烯生物合成中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[28]。本研究從‘柳葉金桂’的基因組中鑒定出122 個(gè)ACO 基因，基因家族總數(shù)量高于普通煙草Nicotiana tabacum(19 個(gè)ACO 基因)[29]、杞柳Salixintegra(42 個(gè)ACO 基因)[21]、玉米Zeamays(8 個(gè)ACO 基因)[30]和甜瓜Cucumismelo(9 個(gè)ACO 基因)[17]中的數(shù)量，低于陸地棉Gossypiumhirsutum(332 個(gè)ACO 基因)[31]。ACO基因在植物基因組中分布不均勻，如玉米[32]中62.0%的基因主要分布在其中2 條染色體上，普通煙草[29]40.0%的基因主要分布在其中的2 條染色體上。本研究中桂花OfACOs 基因的42.6%主要分布在其中的5 條染色體上，推測(cè)可能與基因復(fù)制有關(guān)。

通過(guò)同源序列比對(duì)篩選、不同組織部位及開(kāi)花階段的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，最終篩選到4 個(gè)在花瓣衰老階段(S5 和S6)顯著上調(diào)表達(dá)的成員LYG007706、LYG007045、LYG006223、LYG035696。LYG006223 和LYG007045 位于3 號(hào)染色體上，LYG007706 位于4 號(hào)染色體上。家族內(nèi)共線性分析發(fā)現(xiàn)：LYG007045 與LYG007706 為一對(duì)復(fù)制對(duì)，可見(jiàn)其保守基序、共線性都有緊密聯(lián)系，可能具有相似的功能。LYG035696家族內(nèi)進(jìn)化分析中與LYG006223 聚類較近，兩者可能具有相似的功能。與擬南芥進(jìn)化分析中，LYG007706與擬南芥5 個(gè)基因位于同一個(gè)分組內(nèi)。與擬南芥共線性分析中AT1G12010 與LYG007045 為共線性對(duì)；研究表明AT1G12010 參與乙烯生物合成[32]，通過(guò)負(fù)調(diào)控ACC2 的表達(dá)來(lái)調(diào)控?cái)M南芥內(nèi)源乙烯水平能[33]。AT1G62380 與LYG006223 是一對(duì)共線性對(duì) ；LYG007706 不僅與AT1G62380、AT1G12010 共線性，還與AT2G19590 共線性。AT2G19590 能夠通過(guò)調(diào)控?cái)M南芥乙烯生物合成，調(diào)控黑暗中擬南芥幼苗根系發(fā)育[34]。

此外，進(jìn)化分析及基因結(jié)構(gòu)分析表明：桂花中有16 個(gè)OfACOs 成員與擬南芥AtACOs 同時(shí)聚類于第3 組中，其中11 個(gè)OfACOs 成員的Motif 完全相同，且與擬南芥的AtACOs 含有7 個(gè)相同的Motif 基序。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及RT-qPCR 分析，在第3 組中篩選到LYG007706 在桂花花瓣衰老后期(S6)顯著上調(diào)表達(dá)，與ZOU 等[6]研究中乙烯釋放峰(脫落期)一致，推斷其可能參與乙烯途徑的桂花花瓣衰老調(diào)控。由此推斷，第3 組中與擬南芥AtACOs 聚類的10 個(gè)其他OfACOs 成員可能參與桂花其他組織部位的調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)桂花OfACOs 基因家族的鑒定與表達(dá)分析，篩選到4 個(gè)在開(kāi)花后期顯著差異上調(diào)的成員：LYG006223、LYG007706、LYG007045 和LYG035696，它們可能參與桂花花瓣衰老的調(diào)控。其中，LYG006223 和LYG007045 都定位在3 號(hào)染色體上，且有著相同的保守基序；LYG007706 定位在4 號(hào)染色體上；LYG035696 定位于21 號(hào)染色體。后續(xù)將進(jìn)一步驗(yàn)證這4 個(gè)成員的功能，探索其參與桂花花瓣乙烯合成途徑及衰老的調(diào)控機(jī)制。