四氫嘧啶對人皮膚成纖維細胞衰老的影響

李美妮,李永臻,汪明香,繆增強,雙杰

皮膚是人體的第一道屏障,其屏障功能主要體現(xiàn)在防止皮膚水分流失,防止病原菌、病毒的侵入,防止物理化學性損傷等[1],人體皮膚老化的原因包括自然老化、壓力、環(huán)境和遺傳[2]。人皮膚真皮層主要由人皮膚成纖維細胞(human skin fibroblasts,HSFs)及其分泌的基質(zhì)構成,對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用,HSFs是皮膚衰老過程中的主要受損細胞之一[3]。

四氫嘧啶[(S)-2-methyl-1,4,5,6-tetrahydropyrimidine-4-carboxylic acid, ectoine]作為相容性溶質(zhì),1985年在嗜鹽光合紫細菌鹽綠需鹽紅螺菌 (Ectothiorhodospirahalochloris) 中首次發(fā)現(xiàn)并鑒定其結構[4],目前研究報道[5-7]四氫嘧啶已作為添加劑用于諸如保濕、抗衰老、防紫外線等功效的護膚品中。然而,針對于體外單一細胞實驗中,四氫嘧啶抗HSFs衰老的細胞代謝機制、分子機理尚未闡明,本試驗以體外培養(yǎng)的HSFs為研究對象,觀察四氫嘧啶對HSFs相關衰老指標的影響,分析其能否減緩HSFs的衰老,探討四氫嘧啶對抗衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料和儀器 HSFs(上海中喬新舟生物科技有限公司,貨號:2630)。 Trizol 試劑盒、細胞增殖活性檢測試劑盒、β-半乳糖苷酶染色試劑盒、ROS試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),相關引物合成(上海生工生物技術公司),DMEM培養(yǎng)基(Gibco 公司,美國),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、DCFH-DA細胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma 公司,美國),酶標儀(Bio-Rad 公司,美國),Insight-PlusIQ 型激光共聚焦顯微鏡(Meridian 公司,美國),熒光相差顯微鏡(北京榮興光恒科技有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1HSFs的培養(yǎng) HSFs復蘇至含20% 胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng),隔天換液,倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況,待細胞融合度達到80%～90%,取狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2四氫嘧啶處理細胞 待細胞傳至第7代且匯合度達90%,用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理細胞24 h后,對照組更換新的無四氫嘧啶培養(yǎng)基,實驗組用不同濃度四氫嘧啶(0.50、1.50、2.50 μmol/L)作用24 h。收集細胞上清,提取細胞總RNA,保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細胞MTT活性檢測 取對數(shù)生長期HSFs接種于96孔板,貼壁后加入不同濃度四氫嘧啶處理24 h,加入MTT和DMSO在全自動酶標儀波長568 nm下測定各孔吸光度(OD 值),細胞存活率=(OD實驗組/OD對照組)×100%。

1.2.4β-半乳糖苷酶染色 取對數(shù)生長期的HSFs接種于6孔板,貼壁后加入不同濃度四氫嘧啶處理24 h,然后按β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進行染色。

1.2.5細胞凋亡檢測 使用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒進行檢測:加入 Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI后在流式細胞儀上檢測經(jīng)過處理后細胞凋亡情況。

1.2.6細胞ROS檢測 使用ROS試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS水平。步驟均嚴格按說明書操作。

1.2.7熒光定量PCR 用RNA抽提試劑提取細胞總RNA, 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以GAPDH為內(nèi)參,引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成(引物序列見表1),按照熒光定量PCR反應程序進行擴增。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.3統(tǒng)計學處理 qPCR 結果采用2-ΔΔCT法,所得數(shù)值利用IBM SPSS22進行數(shù)據(jù)處理,采用 GraphPad Prism 5進行作圖。多組之間比較采用單因素方差分析,兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01視為差異極顯著。

2 結果

2.1四氫嘧啶對HSFs 細胞活性的影響 MTT檢測結果顯示,經(jīng)不同濃度四氫嘧啶處理,HSFs細胞增殖活力與對照組相比略有上升趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(F=1.569,P>0.05)(圖1),表明四氫嘧啶對HSFs并無毒害作用,可以進行后續(xù)實驗。

圖1 MTT法檢測 HSFs 細胞的增殖活性 (n=3)

2.2四氫嘧啶對HSFs細胞衰老的影響 將不同濃度的四氫嘧啶作用于HSFs 24 h后,在倒置顯微鏡下觀察SA-β-gal 法染色結果。結果顯示,對照組(圖2a)細胞碎片相對較多,且細胞間排列疏松。四氫嘧啶濃度組(圖2b～2d)細胞碎片相對較少;細胞形態(tài)正常,呈典型的梭形,細胞形態(tài)較對照組更為規(guī)則;細胞密度大,細胞排列更加緊密,且隨著四氫嘧啶濃度增加,細胞密度逐漸增大;觀察結果提示,四氫嘧啶濃度組衰老細胞所占比例較對照組減少。

Control group; 0.50 μmol/L ectoine concentration group; 1.50 μmol/L ectoine concentration group; 2.50 μmol/L ectoine concentration group

2.3流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 HSFs經(jīng)四氫嘧啶處理后,用流式細胞儀測定細胞凋亡率。在流式細胞檢測中,觀察不同濃度的四氫嘧啶刺激HSFs凋亡的情況,流式細胞術檢測各組HSFs凋亡的結果顯示:四氫嘧啶處理組的HSFs凋亡率較對照組顯著降低,與對照組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=233.20,P<0.01);且在本研究中,隨著四氫嘧啶濃度的遞增(0.50、1.50、2.50 μmol/L),HSFs凋亡率呈顯著降低趨勢,差異有統(tǒng)計學意義(F=199.81,P<0.01),見圖3。

Note: Ectoine treatment group compared with the control group, **P<0.01,****P<0.000 1.

2.4四氫嘧啶對HSFs細胞ROS水平的影響 實驗在保證細胞存活率95%以上的前提下,以DCFH-DA熒光探針法檢測細胞內(nèi)ROS水平變化,結果發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶能明顯清除細胞中的ROS,并且隨著四氫嘧啶濃度的升高,HSFs的ROS活性逐漸被抑制,其中,2.50 μmol/L濃度的四氫嘧啶的ROS清除活性最強,見圖4。

Note: Ectoine treatment group compared with the control group, ****P<0.000 1.

2.5各組HSFs細胞中p16、p21、p53 mRNA表達檢測 結果顯示,不同濃度四氫嘧啶處理均可下調(diào)HSFs細胞中衰老相關基因p16、p21、p53 mRNA的表達量。p16 mRNA的相對表達量,隨四氫嘧啶濃度的增加而顯著下調(diào),與四氫嘧啶濃度呈負相關(F=65.20,P<0.05);1.50 μmol/L 四氫嘧啶濃度顯著降低p21、p53 mRNA的表達水平(F=33.89、35.84,P<0.01),2.50 μmol/L 四氫嘧啶濃度作用組p16、p21、p53 mRNA相對表達量與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(t=-14.47、9.28、9.78,P<0.000 1)。實驗表明,四氫嘧啶對衰老相關分子p16、p21、p53基因的表達有一定的下調(diào)作用,見圖5。

Note: Comparing the differences in p16, p21 and p53 mRNA expression between the cells in each group, ectoine treatment group compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01;***P<0.001,****P<0.000 1.

3 討論

四氫嘧啶是嗜鹽微生物提供給人類的一類寶貴的資源,其具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)、核酸、生物膜以及整個細胞的功能,目前在生物保護、化妝品和生物制藥等方面均具有應用潛力[8],但有關四氫嘧啶抗衰老的藥理學研究鮮有報道。

本研究首先通過設置四氫嘧啶濃度梯度明確了其對HSFs無細胞毒性,這和既往的研究報道[8]是一致的。通過細胞周期檢測,可以看到,四氫嘧啶可降低細胞凋亡率,這也表明,四氫嘧啶進入細胞后可參與細胞周期的調(diào)控,發(fā)揮關鍵作用。

在關于皮膚衰老機制的探索研究中,ROS作為線粒體有氧代謝電子傳遞鏈的副產(chǎn)物不斷產(chǎn)生,除遺傳因素外,ROS被認為是內(nèi)源性衰老的主要原因[9],ROS能誘導并加速皮膚衰老過程,盡管少量ROS的存在已被證明在維持身體或細胞穩(wěn)定方面發(fā)揮有益作用,如激活環(huán)加氧酶和脂氧合酶,調(diào)節(jié)炎癥過程等[10-11]。同樣,光老化的發(fā)生也與ROS的產(chǎn)生有關。紫外線可導致ROS增加,破壞細胞的結構和功能,并介導炎癥反應[12-13]。目前已有一些天然植物提取物如千年草籽提取物等被報道對HSFs中ROS活性具有抑制作用從而延緩衰老[14]。但四氫嘧啶對HSFs氧化應激狀態(tài)的影響尚未見報道,而本研究結果表明,四氫嘧啶可降低HSFs內(nèi)ROS的水平,說明四氫嘧啶具有一定的抗氧化、清除自由基能力。

細胞衰老涉及多種機制和途徑,而關于細胞老化相關蛋白的研究已比較透徹,細胞周期抑制蛋白p16、p21和p53是衰老相關通路中三個重要的信號分子,p53作為衰老的關鍵調(diào)節(jié)因子,在多種應激信號下可被激活,DNA雙鏈斷裂、端粒磨損均可通過活化p53,激活下游信號蛋白p16及p21等細胞周期激酶抑制劑,從而出現(xiàn)明顯的細胞周期阻滯,導致細胞迅速出現(xiàn)老化特征[15-16]。值得注意的是,Buenger等[16]的研究發(fā)現(xiàn),四氫嘧啶能夠預防UVA誘導的第二信使釋放、轉(zhuǎn)錄因子AP-2激活、細胞間黏附分子-1表達和線粒體DNA突變,從而提高皮膚的再生能力和延緩UVA引起的皮膚老化。本研究也以線粒體DNA為靶點探索了四氫嘧啶對衰老相關基因表達的影響,結果表明四氫嘧啶可下調(diào)衰老相關基因p16、p21、p53 mRNA表達,這與Buenger等[16]的報道有相似之處,均證實了線粒體DNA可作為四氫嘧啶抗皮膚細胞老化的作用靶點,不同的是,本研究中四氫嘧啶是通過調(diào)節(jié)線粒體DNA上細胞衰老相關因子p16、p21、p53的表達來延緩HSFs的復制性衰老。

綜上所述,本研究通過檢測四氫嘧啶對HSFs相關衰老指標的影響,發(fā)現(xiàn)其可能通過降低細胞凋亡率、細胞內(nèi)ROS水平以及抑制細胞老化相關分子p16、p21、p53 mRNA表達來延緩衰老。這些結果均提示四氫嘧啶通過不同的分子機制對HSFs的衰老具有一定的減緩作用,但其具體機制仍有待深入研究。本研究為四氫嘧啶在體外單細胞中的抗皮膚老化領域提供了研究基礎,提示四氫嘧啶可作為針對減緩HSFs衰老的有效成份,但其在抗皮膚衰老產(chǎn)品中的應用需要進一步研究。