兩樣本孟德爾隨機化研究克羅恩病與玫瑰痤瘡的因果關(guān)系

李曉健,陳施宇,陳小敏,黃李婷 ,堯鑫,邱桂榮,吳允波,劉中勇

玫瑰痤瘡是一種以反復(fù)發(fā)作的毛細血管擴張、潮紅或短暫腫塊性變化、丘疹、持續(xù)性紅斑、膿皰為特征的炎癥性皮膚疾病,皮損主要分布在臉頰及鼻子部位[1]。這種紅色的、布滿粉刺的面部皮疹會使患者感到尷尬、自卑和焦慮,并可能導(dǎo)致其產(chǎn)生抑郁和污名化的感覺,給患者的生活質(zhì)量造成嚴重的負面影響[2-3]。據(jù)報道[4],玫瑰痤瘡在美國、歐洲、亞洲等地的發(fā)病率為1%～22%。關(guān)于玫瑰痤瘡的發(fā)病機制尚無權(quán)威解釋,目前大多數(shù)學(xué)者認為與先天免疫功能異常以及神經(jīng)血管調(diào)節(jié)功能紊亂密切相關(guān)[5]。有趣的是,最近的研究[6]表明,玫瑰痤瘡的發(fā)病與心血管、胃腸和精神疾病有顯著的關(guān)聯(lián),腸道菌群可能會影響玫瑰痤瘡的發(fā)病[7]。

克羅恩病(Crohn′s disease,CD)是一種影響胃腸道的慢性炎癥性疾病,它可以引起從口腔到肛門的病變,并可能導(dǎo)致腸外并發(fā)癥[8]?？肆_恩病的發(fā)生主要與遺傳因素與環(huán)境因素及黏膜相關(guān)黏附侵襲性大腸桿菌數(shù)量增加有關(guān)[9]。有學(xué)者[10]經(jīng)病例對照研究發(fā)現(xiàn),克羅恩病患者的玫瑰痤瘡發(fā)病率比正常人高49%。來自Meta分析的數(shù)據(jù)證明玫瑰痤瘡與克羅恩病之間存在顯著的因果關(guān)系[11]。然而,臨床觀察研究容易受到統(tǒng)計或環(huán)境等偏移風(fēng)險的影響。因此,克羅恩病與玫瑰痤瘡各自發(fā)展過程中的因果雙向作用仍存在爭議。

為了進一步研究克羅恩病與玫瑰痤瘡之間的因果關(guān)系、關(guān)聯(lián)強度以及因果關(guān)系的方向,筆者使用了孟德爾隨機化(MR)來進行研究。該方法由 Katan[12]于1986年提出,通過引入遺傳變異作為工具變量的孟德爾隨機化(MR)分析,可以評估暴露和結(jié)果之間的因果關(guān)系。其基本原理參照孟德爾第二遺傳定律:等位基因是隨機分配的,并且在受孕時是固定的。這個過程類似于傳統(tǒng)RCT試驗中患者被隨機分配到治療組和對照組。該方法利用遺傳變異的隨機分布來消除混雜因素,逆轉(zhuǎn)因果關(guān)系,模擬隨機對照試驗的隨機化過程,避免了傳統(tǒng)隨機對照試驗中遇到的反向因果關(guān)聯(lián)及潛在混雜因子的干擾[13]。

1 研究方法與資料

1.1研究設(shè)計 本研究將克羅恩病作為暴露因素,與克羅恩病顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性作為工具變量,玫瑰痤瘡則作為結(jié)局變量。使用兩樣本MR分析的方法進行因果關(guān)聯(lián)分析,利用 CochranQ檢驗進行異質(zhì)性檢驗,最后對所得結(jié)果進行敏感性分析以驗證其可靠性。為了篩選出合適的工具變量進行雙樣本MR分析,本文采用了以下三個關(guān)鍵假設(shè):①工具變量與克羅恩病之間存在顯著的關(guān)聯(lián);②工具變量與克羅恩病-玫瑰痤瘡關(guān)聯(lián)的所有混雜因素均不相關(guān);③工具變量只能通過與克羅恩病的關(guān)聯(lián)影響結(jié)局[14]。見圖1。

圖1 MR分析的關(guān)鍵假設(shè)圖

1.2數(shù)據(jù)來源 從網(wǎng)站(https://gwas.mrcieu.ac.uk)獲得了關(guān)于克羅恩病和玫瑰痤瘡遺傳數(shù)據(jù)。這是一項來自歐洲生物信息研究中心(EBI)的數(shù)據(jù),其中包括40 266名歐洲男女后裔,SNP數(shù)量為9 457 998。玫瑰痤瘡的遺傳數(shù)據(jù)則來自于芬蘭數(shù)據(jù)庫(The Finn Gen Biobank),其中包括212 334名歐洲男女后裔,SNP數(shù)量為16 380 452。由于所有使用的數(shù)據(jù)都已在公共領(lǐng)域,因此不需要額外的倫理批準。研究人群的遺傳背景均來自歐洲血統(tǒng),以避免因種族相關(guān)混雜因素造成的偏差。基本信息見表1。

表1 兩樣本MR研究中 GWAS 數(shù)據(jù)庫的基本信息

1.3工具變量 選擇匯集與克羅恩病具有顯著意義(P<5.0×10-8,F>10) 的 SNPs,設(shè)置參數(shù)r2閾值為0.001,千堿基對(kb)為10 000,以排除連鎖不平衡(LD)的干擾[15]。異質(zhì)性檢驗剔除顯著異質(zhì)性 SNPs,最后得到與克羅恩病顯著相關(guān)的有效SNPs 作為工具變量。

總F計算公式為:

(1)

其中N為所納入克羅恩病患者的樣本量,K為數(shù)據(jù)庫中SNPs的個數(shù),R2為克羅恩病數(shù)據(jù)庫中由SNPs解釋的變異所占的比例。

R2的計算公式為:

(2)

單個SNP的公式為:

(3)

其中EAF為效應(yīng)等位基因頻率,SE為標(biāo)準誤,SD為標(biāo)準差,β為等位基因效應(yīng)值[16]。

1.4孟德爾隨機化分析 使用了R version 4.1.2中的“TwoSampleMR”包進行MR分析。首先對每個SNP進行關(guān)聯(lián),計算出每個SNP的Wald比值,再運用逆方差加權(quán)法(inverse variance weighted,IVW)方法對Wald比值進行合并以評估克羅恩病與玫瑰痤瘡之間的關(guān)聯(lián)。此外采用MR-Egger回歸法、加權(quán)中位數(shù)法(weighted median,WME)對得出的MR結(jié)果進行驗證以及穩(wěn)定性檢驗。本研究采用的逆方差加權(quán)法主要是將每一個工具變量方差的倒數(shù)作為權(quán)重進行加權(quán)計算,這一過程是在保證所有工具變量都是有效的前提下進行,以此來評估水平多效性[17];MR-Egger回歸法則是使用結(jié)局方差的倒數(shù)作為權(quán)重來進行擬合,它在回歸的同時加入截距項[18]。加權(quán)中位數(shù)法(weighted median,WME)[19]是定義為比率估計值的加權(quán)經(jīng)驗密度函數(shù)的中位數(shù),當(dāng)無效工具變量比例高達50%且工具變量間估計的精度差異較大時,WME仍然能提供一致的效應(yīng)估計值。

1.5敏感性分析 本研究采用留一法(Leave-one-out)、MR-Egger法對結(jié)果進行可靠性評價。MR-Egger法指的是當(dāng)MR-Egger截距項與0差異很大時,說明此時存在水平多效性[20]。留一法主要是依次剔除每個SNP,然后計算剩下所有SNP的結(jié)果,當(dāng)某個MR結(jié)果和總結(jié)果無顯著統(tǒng)計學(xué)差異,則說明該SNP不會對效應(yīng)估計結(jié)果產(chǎn)生非特異性影響[21]。

2 結(jié)果

2.1工具變量 在排除連鎖不平衡后,獲得了18個 SNP,這便是本次研究的工具變量,其基本信息見表 2。其中Position和CHR表示基因的位置和染色體信息;EAF表示效應(yīng)等位基因頻率;EA/OA表示等位基因;β為克羅恩病相關(guān)SNP的效應(yīng)量;SE是β值的標(biāo)準誤;P值表示SNP與克羅恩病的關(guān)聯(lián)程度;F值是用來評估弱工具變量效應(yīng)的統(tǒng)計量。本次研究單一 SNP 對應(yīng)的F統(tǒng)計量分布范圍為30.54～436.43,F值均>10,這表明結(jié)果不存在弱IVs偏倚,說明本結(jié)果可靠。

2.2孟德爾隨機化分析 結(jié)果IVW法結(jié)果[OR=1.11(95%CI:1.01～1.22),P=0.03<0.05]表明,基因預(yù)測克羅恩病與玫瑰痤瘡的風(fēng)險顯著相關(guān),也就是說將克羅恩病的基因數(shù)據(jù)對數(shù)變換后每降低一個標(biāo)準差,則導(dǎo)致玫瑰痤瘡的發(fā)病風(fēng)險增加10%,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。WME分析結(jié)果也證明克羅恩病的玫瑰痤瘡患病風(fēng)險增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義[OR=1.15(95%CI:1.00～1.31),P=0.04<0.05],見圖2～3。

圖2 MR分析森林圖

圖3 MR分析結(jié)果圖

2.3敏感性分析 經(jīng)CochranQ檢驗表明,IVW(P=0.33>0.05)和 MR-Egger回歸(P=0.34>0.05)并不存在異質(zhì)性。MR-Egger的egger_intercept結(jié)果為(P=0.37>0.05),與0比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,這表明本研究結(jié)果不存在水平多效性。漏斗圖結(jié)果表明當(dāng)逐個以SNP為變量時,因果關(guān)聯(lián)效應(yīng)的散點基本呈對稱分布,結(jié)果不存在潛在偏倚(圖4)。 “Leave-one-out”敏感性分析,結(jié)果顯示依次剔除各SNP后,剩余的17個 SNPs的 IVW分析結(jié)果與納入全部 SNPs的分析結(jié)果相近,未發(fā)現(xiàn)對因果關(guān)聯(lián)估計值影響較大的 SNPs(圖5)。

圖4 MR漏斗圖

圖5 “留一法”敏感性分析結(jié)果

3 討論

明確玫瑰痤瘡的病因?qū)ζ漕A(yù)防、診斷和治療具有重要意義。本次研究是國內(nèi)首次運用孟德爾隨機化系統(tǒng)評估克羅恩病與玫瑰痤瘡發(fā)病風(fēng)險之間因果關(guān)系的研究。IVW法[OR=1.11(95%CI:1.01～1.22),P=0.03<0.05]與WME分析[OR=1.15(95%CI:1.00～1.31),P=0.04<0.05]結(jié)果表明,基因預(yù)測克羅恩病患者的玫瑰痤瘡患病風(fēng)險將會增加,多種敏感性分析進一步證實了兩種疾病之間的因果關(guān)系。

以往的觀察性研究已經(jīng)證明克羅恩病等炎癥性腸病會增加玫瑰痤瘡的患病風(fēng)險。來自英國臨床實踐研究數(shù)據(jù)鏈的一項大型回顧性病例對照研究[22]指出,克羅恩病患者發(fā)生玫瑰痤瘡的概率將會提升49%[OR=1.49(95%CI: 1.25～1.77)],特別是在克羅恩病相關(guān)胃腸道炎癥增加的階段。Kim等[23]在美國進行了一項包含40 843例炎癥性腸病患者的橫斷面研究,證明克羅恩病患者的玫瑰痤瘡發(fā)生概率高于白癜風(fēng)、銀屑病等其他炎癥性皮膚病。來自一項針對韓國人口的全國性橫斷面研究也證明,玫瑰痤瘡的發(fā)病與克羅恩病等炎癥性腸病密切相關(guān)[24]。與之前的研究結(jié)果一致,筆者使用MR研究發(fā)現(xiàn),克羅恩病患者的遺傳易感性大約會增加11%玫瑰痤瘡的感染風(fēng)險。

關(guān)于克羅恩病增加玫瑰痤瘡患病風(fēng)險的具體機制尚不清楚,目前多數(shù)學(xué)者認為與炎癥相關(guān)。玫瑰痤瘡作為一種高發(fā)病率的皮膚疾病,很可能有全身起源,亦或者說是一種全身疾病風(fēng)險增加的標(biāo)志[25]。報告顯示,玫瑰痤瘡患者血清中C反應(yīng)蛋白水平升高明顯[26],而C反應(yīng)蛋白正是全身炎癥、氧化介質(zhì)不平衡的標(biāo)志。有趣的是,C反應(yīng)蛋白也是研究得最好的克羅恩病的炎癥非侵入性生物標(biāo)志物之一[27]。除此之外,克羅恩病與玫瑰痤瘡還有些共同的致病炎癥因子,例如白介素1b(IL-1b)和腫瘤壞死因子α(TNF-α),以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),這些炎癥因子在病理上共同導(dǎo)致了玫瑰痤瘡和克羅恩病的發(fā)生發(fā)展[11,28]。這有可能是克羅恩病增加玫瑰痤瘡患病風(fēng)險的機制。

經(jīng)留一法發(fā)現(xiàn),rs7517847的變異可能是克羅恩病影響玫瑰痤瘡發(fā)病的關(guān)鍵所在。rs7517847最靠近的基因是IL-23R,這是一個已經(jīng)被大量數(shù)據(jù)證實的炎癥性腸病相關(guān)基因[29]。IL-23R是編碼IL-23受體的一個亞基,由p19、p40兩個亞基組成,同時也是多種免疫相關(guān)性皮膚病的易感位點,例如銀屑病、白塞病[30-31]。IL-23已被證明能刺激T輔助17細胞(Th17)增殖,并增加炎性細胞因子如IL-1、IL-6、IL-17和TNF-α的產(chǎn)生[32]。值得注意的是,玫瑰痤瘡的發(fā)病同樣與Th1/Th17通路的激活密切相關(guān)。有學(xué)者對玫瑰痤瘡患者的面部活檢進行了免疫組織化學(xué)及轉(zhuǎn)錄分析,發(fā)現(xiàn)了大量Th1/Th17極化免疫細胞主導(dǎo)的T細胞反應(yīng)以及產(chǎn)生的IFN-γ、IL-17等炎癥因子[33]。這在一定程度上與筆者的猜想一致,即克羅恩病影響玫瑰痤瘡的發(fā)病關(guān)鍵在于IL-23R的變異。

據(jù)報道,阻斷IL-23信號通路是克羅恩病的一種有效的治療策略。Mannon等[34]進行了一項雙盲隨機對照試驗,發(fā)現(xiàn)接受了抗IL-12治療的患者中,臨床癥狀得到有效改善,且患者結(jié)腸固有層單個核細胞分泌的IL-12、IFN-α和TNF-α顯著減少。Weinstock[35]的一項對克羅恩病合并玫瑰痤瘡的回顧調(diào)查發(fā)現(xiàn),在使用利福昔明的基礎(chǔ)上加入阿達木單抗后,克羅恩病和玫瑰痤瘡?fù)耆徑獾乃俣缺葐为毷褂美Ｎ裘鞲臁Ｔ撗芯考尤氚⑦_木單抗對患者病情的改善證明TNF-α在克羅恩病和玫瑰痤瘡的雙重發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。由此筆者提出猜想:阻斷IL-23信號通路或許可以達到治療克羅恩病合并玫瑰痤瘡患者的治療和預(yù)防目的。

當(dāng)然本研究還存在一些局限性:第一,納入研究的樣本均是來自于歐洲血統(tǒng),往后還需亞洲、非洲等其他人種的樣本進行擴大研究;第二,獲得的數(shù)據(jù)來自于GWAS匯總數(shù)據(jù),因此無法排除因患者飲酒、熬夜等因素[36]的影響;第三,克羅恩病提高玫瑰痤瘡發(fā)病率的具體機制尚不清楚,后期還需進一步對筆者的猜想進行驗證研究。

綜上所述,本研究使用孟德爾隨機化研究發(fā)現(xiàn),克羅恩病與玫瑰痤瘡的發(fā)生存在因果關(guān)聯(lián),rs7517847的變異可能是克羅恩病影響玫瑰痤瘡發(fā)病的關(guān)鍵所在。因此對于克羅恩病的患者應(yīng)該注意及時用藥阻斷治療,預(yù)防玫瑰痤瘡的發(fā)生。對于克羅恩病合并玫瑰痤瘡的患者,阻斷IL-23信號通路或許可以達到改善和治療目的。