分離鑒定黃連花薹的差異性成分并測定其中4個成分的含量

王夢琪，羅定強，劉海靜*（1. 陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 71046；. 陜西省食品藥品檢驗研究院，西安 710065）

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch、三角葉黃連Coptis deltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云連Coptis teetaWall.的干燥根莖[1]，收載于《中國藥典》2020年版一部中，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效；常用于治療濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，目赤，牙痛等疾病[2]。黃連花薹為毛茛科植物黃連屬黃連的干燥花序，春季開花，其花為淡黃色；黃連的花期較短，一般為每年2～4月，在移栽后第2年春季開花，開花后會消耗植物大量養(yǎng)分，為了提高藥用部分（根莖）的產(chǎn)量，黃連生產(chǎn)基地除了會將少數(shù)黃連花薹留種外，其余均摘除丟棄，造成了資源的浪費。現(xiàn)代藥理學研究表明，黃連花薹具有抗氧化、潤腸通便和保護心肌缺血再灌注損傷等藥理作用[3-5]，具有良好的開發(fā)利用價值。目前在黃連種植基地已將黃連花薹開發(fā)成花茶保健品供應于市場[6-7]，但是黃連花薹的化學成分還未得到充分研究，與其根莖的物質基礎和作用機制差別也不明確，同時又缺乏相關的質量控制與評價方法，從而造成了黃連植物資源的浪費?；谖覈熬G色發(fā)展”及“資源綜合利用”的發(fā)展理念，為了綜合利用黃連中藥材資源[8]，本文以黃連花薹為研究對象，采用薄層鑒別法（TLC）與高效液相色譜法對比，尋找出黃連藥材與黃連花薹中含量最大的差異性成分，采用聚酰胺柱層析等分離手段對黃連花薹與黃連藥材差異性成分進行提取分離純化，并采用液質聯(lián)用以及核磁鑒定的方法對差異性成分進行確證，同時建立一測多評法（QAMS）[9]測定黃連花薹中酚酸類（綠原酸）、黃酮類（蒙花苷、蘆?。?、生物堿類（小檗堿）4個成分的含量，并進行方法學驗證，為黃連花薹質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

AVANCE 3HD 600 MHz 型核磁共振波譜儀（美國布魯克公司）；LC-2030C 3D高效液相色譜儀（日本島津）；e2695高效液相色譜儀（美國Waters）；質譜儀AB 5500＋（美國AB公司）；UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津公司）；ME-204電子分析天平（梅特勒-托利多儀器公司）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯公司）；高純水儀 UPH-Ⅱ-10T（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；數(shù)控超聲儀（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（LABORIA4001，德國Heidoph公司）。

1.2 試藥

乙醇（工業(yè)乙醇）、乙腈（色譜純）（霍尼韋爾國際公司），高純水、磷酸（分析純）（天津市科密歐化學試劑有限公司），三乙胺（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），聚酰胺（30～60目，國藥集團化學試劑有限公司）。對照品綠原酸（批號：11053-202018，純度：96.1%）、蘆?。ㄅ枺?00080-201610，純度：91.9%）、鹽酸小檗堿（批號：110713-202015，純度：85.9%）、蒙花苷（批號：111528-201710，純度：96.6%）（中國食品藥品檢定研究院）。

黃連花薹采自陜西省安康市南皋縣、重慶市石柱縣，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗研究院中藥室主任羅定強主任藥師鑒定為毛茛科植物黃連（Coptis chinensisFranch）的干燥花序。

2 黃連花薹特征成分的分離與純化

2.1 提取

取黃連花薹樣品700 g 粉碎，過二號篩，以85%乙醇溶液回流提取3次，8倍量溶劑，每次1.5 h，合并濾液，真空減壓干燥，得到總浸膏（191 g），備用。

2.2 聚酰胺柱層析分離與純化[10-14]

用少量的5%乙醇溶液溶解黃連花薹浸膏50.04 g，加入已處理好的聚酰胺，水浴上低溫揮去溶劑，干法上樣，柱規(guī)格為 6.0 cm×100 cm，有效柱長 88 cm，分別用95%水-乙醇、90%水-乙醇進行梯度洗脫，洗脫過程每100 mL收集餾分，用TLC跟蹤檢查，合并Rf值相似餾分，減壓濃縮至干，趁熱加入少量20%乙醇溶液使溶解，放置室溫后轉入冰箱內進行低溫析晶，靜置過夜后得到大量晶體，抽濾后，得到化合物Ⅰ（116.5 mg）。將所得晶體經(jīng) HPLC 法測定，利用峰面積歸一化法，測定純度＞95%。

2.3 結構鑒定

化合物Ⅰ為淡黃色無定型粉末，純度為95%；分子式為C28H32O14，ESI-MSm/z：593.1（[M＋H]＋）；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.92（s，1H，5-OH），8.06（d，J＝8.9 Hz，2H，H-2'，6'），7.16（d，J＝8.9 Hz，2H，H-3'，5'），6.96（s，1H，H-3），6.80（d，J＝2.5 Hz，1H，H-8），6.46（d，J＝2.5 Hz，H-6），5.45（m，1H，-OH），5.24（d，J＝5.0 Hz，1H，-OH），5.21（m，1H，-OH），5.07（d，J＝7.4 Hz，1H，H-1''），4.71（m，1H，-OH），4.62（m，1H，-OH），4.56（s，1H，H-1'''），4.47（m，1H，-OH），3.87（s，3H，4'-OCH3），3.86（s，1H，H-6''），3.68（m，1H，H-2'''），3.62（m，1H，H-5'''），3.45（m，1H，H-3''），3.45（m，1H，H-6''），3.42（m，1H，H-5'''），3.33（m，1H，H-3''），3.29（m，1H，H-2''），3.17（m，1H，H-4''），3.15（m，1H，H-4'''），1.09（d，J＝6.3 Hz，3H，H-6'''）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：18.30（C-6'''），56.06（4'-OCH3），66.57（C-6''），68.81（C-5'''），70.07（C-4''），70.83（C-3'''），71.22（C-2'''），72.53（C-4'''），73.55（C-2''），76.14（C-5''），76.73（C-3''），95.26（C-8），100.13（C-1''），100.40（C-1'''），101.01（C-6），104.30（C-3），105.94（C-10），115.20（C-3'，5'），123.16（C-1'），128.95（C-2'，6'），157.46（C-7），161.63（C-5），162.92（C-4'），163.44（C-9），164.43（C-2），182.53（C-4）。以上波譜數(shù)據(jù)與已知化合物Ⅰ的譜圖數(shù)據(jù)[15]一致，確認為蒙花苷（linarin），結構式見圖1。

圖1 化合物Ⅰ的化學結構式Fig 1 Chemical structure of compound Ⅰ

圖2 混合對照品（A）和黃連花薹樣品（B）的HPLC圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substance（A）and Coptis chinensis flower moss sample（B）

3 QAMS法同時測定黃連花薹特征成分及其他3個成分的含量

3.1 對照品溶液的制備[16-20]

精密稱取綠原酸對照品5.92 mg置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到質量濃度為0.2368 mg·mL－1儲備液；精密稱取蘆丁對照品6.18 mg置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到質量濃度為0.1236 mg·mL－1儲備液；精密稱取鹽酸小檗堿對照品7.16 mg置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到質量濃度為0.2864 mg·mL－1儲備液；精密稱取蒙花苷對照品3.46 mg，置25 mL量瓶中，分別加入綠原酸、蘆丁、鹽酸小檗堿儲備液2 mL、3 mL、5 mL，配制成含綠原酸0.018 21 mg·mL－1、蘆丁0.013 63 mg·mL－1、鹽酸小檗堿0.049 20 mg·mL－1、蒙花苷0.1337 mg·mL－1對照品混合溶液（注：儲備液配制濃度為原始濃度，混合對照品溶液配制濃度均已進行折算）。

3.2 供試品溶液的配制

取6批黃連花薹樣品各 0.2 g，分別加入70%乙醇25 mL，稱量，超聲處理（500 W，40 kHz）45 min，取出，放冷，再稱量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 色譜條件

采用資生堂C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（每1000 mL加20 μL三乙胺）（B）為流動相，梯度洗脫（0～27 min，92%B；27～45 min，92%→80%B；45～50 min，80%→77%B，50～65 min，77%B→73%B，65～70 min，73%→20%B，70～72 min，20%→92%B，72～75 min，92%B），流速 1.0 mL·min－1，檢測波長340 nm，柱溫 40℃，進樣量 10 μL。

3.4 方法學考察[21-24]

3.4.1 系統(tǒng)適用性試驗 在“3.3”項色譜條件下，4個待測成分的理論塔板數(shù)均大于5000，且色譜峰峰形良好，與相鄰峰的分離度大于 1.5。混合對照品及黃連花薹樣品色譜圖見圖 2。

3.4.2 線性關系考察 取“3.1”項下混合對照品溶液適量，稀釋成系列濃度混合對照品溶液（綠原酸：0.018 21、0.036 42、0.091 05、0.1821、0.2732 μg；蘆?。?.013 63、0.027 26、0.068 15、0.1363、0.2044 μg；鹽酸小檗堿：0.049 20、0.098 40、0.2460、0.4920、0.7380 μg；蒙花苷：0.1337、0.2674、0.6685、1.3370、2.0055 μg），每個質量濃度平行測定3次，以對照品質量X和平均峰面積Y進行線性回歸分析，得到回歸方程及相關系數(shù)，結果見表1。

表1 線性關系考察Tab 1 Linearity

3.4.3 相對校正因子計算 取“3.1”項下混合對照品溶液，分別進樣 1、2、5、10、15 μL進樣測定，按公式[相對校正因子（fsi）＝（As×Wi）/（Ai×Ws）]（As為內標物質峰面積，Ws為內標物質的質量濃度，Ai為其他待測組分的峰面積；Ws為其他待測組分的質量濃度）計算鹽酸小檗堿對綠原酸、蘆丁、蒙花苷的相對校正因子，結果見表2。

表2 黃連花薹中4個成分的相對校正因子結果Tab 2 Relative correction factors of 4 components in Coptis chinensis flower moss

3.4.4 精密度試驗 取“3.1”項下混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，計算得綠原酸、蘆丁、鹽酸小檗堿、蒙花苷峰面積RSD分別為 0.99%、1.1%、0.09%、0.43%，表明儀器精密度良好。

3.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一黃連花薹供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、25、30、35、40 h進樣分析，平行測定3次，記錄峰面積，計算得到40 h內綠原酸、蘆丁、鹽酸小檗堿、蒙花苷色譜峰峰面積的RSD分別為1.9%、0.97%、1.2%和1.1%，表明供試品溶液在40 h內穩(wěn)定性良好。

3.4.6 重復性試驗 取同一批黃連花薹樣品，每份 0.2 g，共 6 份，精密稱定，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，得到6份樣品綠原酸、蘆丁、鹽酸小檗堿、蒙花苷的平均含量分別為2.2486、1.9353、6.1675、21.5566 mg·g－1，RSD分別為0.59%、0.31%、0.32%、0.28%，表明此方法重復性良好。

3.4.7 加樣回收試驗 取已知含量的黃連花薹樣品適量，每份約 0.1 g，共 9 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入相當于含有量80%、100%、120%的混合對照品溶液，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果4種成分的平均加樣回收率在 94.88%～96.68%，RSD均小于3.0%，表明該方法的準確性較好。

3.4.8 QAMS法與外標法測定結果的比較 取6批黃連花薹樣品各2份，分別按“3.2”項下方法制備供試品溶液，以“3.3”項下色譜條件進樣測定，采用QAMS法和外標法（ESM）計算各成分含量。結果表明，QAMS法與ESM法測得綠原酸、蘆丁、蒙花苷含量基本一致，驗證了采用QAMS法測定黃連花薹中含量具有可行性，見表3。

表3 QAMS與外標法ESM測得黃連花薹中4個成分的含量比較結果(mg·g－1，n＝3)Tab 3 Content of 4 components in Coptis chinensis flower moss measured by QAMS and ESM (mg·g－1，n＝3)

3.4.9 校正因子耐用性考察

① 不同儀器和色譜柱對相對校正因子的影響：分別考察 Waters 2495、島津LC-2030C 3D、安捷倫1260 型 3種高效液相色譜儀及Agilent TCC18、Kromasil 100-5C18、資生堂C183 種色譜柱對相對校正因子的影響，結果RSD均＜3.0%，表明不同儀器和色譜柱對相對校正因子無明顯影響，結果見表4。

表4 不同條件對相對校正因子的考察結果Tab 4 Relative correction factors under different conditions

② 不同流速對相對校正因子的影響：采用Waters e2695高效液相色譜儀和資生堂C18，分別考察流速為0.8、1.0、1.2 mL·min－1對相對校正因子的影響，結果RSD均＜3.0%，表明不同流速對相對校正因子無明顯影響，結果見表4。

③ 不同柱溫對相對校正因子的影響：采用Waters e2695高效液相色譜儀和資生堂C18色譜柱，分別考察不同柱溫30、35、40℃時的相對校正因子。結果表明不同柱溫對相對校正因子無明顯影響，結果見表4。

4 討論

4.1 黃連花薹特征成分的選擇

通過兩種不同的TLC系統(tǒng)：① 固定相為聚酰胺薄膜，展開劑為50%乙醇；② 固定相為硅膠G，展開劑為乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1），顯色劑為1%三氯化鋁乙醇試液，加熱，置365 nm下觀察，發(fā)現(xiàn)了與黃連藥材明顯不同的清晰斑點；又通過HPLC法，對比找出與黃連藥材不同的色譜峰，其峰面積占黃連花薹峰面積的22.62%，故將其作為黃連花薹與黃連藥材的差異性成分。采用正交試驗設計法考察提取時間（1 h、1.5 h、2 h），乙醇濃度（70%、85%、95%），溶劑用量（6倍、8倍、10倍）三因素三水平對黃連花薹差異性成分提取率的影響，結果顯示，在70%乙醇濃度，加入8倍量溶劑，提取1.5 h，得到黃連花薹差異性成分的出膏率最高。

4.2 檢測波長的選擇

根據(jù)各成分在紫外吸收譜圖來確定檢測波長。綠原酸在326 nm處有最大吸收，蘆丁在354 nm處有最大吸收，鹽酸小檗堿在344 nm處有最大吸收，蒙花苷在332 nm處有最大吸收，混合對照品在340 nm處響應值較好，故最終選擇340 nm 作為檢測波長。

4.3 內參物的選擇

鹽酸小檗堿是2020年版《中國藥典》規(guī)定的黃連質量控制的指標性成分，而且其在供試品溶液中含量較高，性質穩(wěn)定，較易獲得，故選擇為內參物。

4.4 供試品溶液制備方式的考察

本研究考察了提取溶劑、提取方式、提取體積、提取時間對黃連花薹特征成分提取效果的影響，結果顯示超聲提取法對特征成分的提取率較高，考慮到超聲法操作簡便，節(jié)省時間，以及酚酸類化合物的不穩(wěn)定性（待測成分中有綠原酸），最終選擇70%乙醇超聲提取45 min作為提取條件。

4.5 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了采用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1% 磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）溶液作為流動相對 4個待測成分含量測定結果的影響，結果顯示用乙腈-0.1% 磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）時的峰形效果較好，故選擇溶液乙腈-0.1%磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）為流動相?？疾觳煌荻认疵摮绦颍谧罱K確定的色譜條件下，4個待測成分峰形良好，理論塔板數(shù)均大于5000，待測成分間以及與樣品中其他成分之間的分離度良好。

4.6 指標的選擇

2020年版《中國藥典》中以鹽酸小檗堿的含量來控制黃連藥材的質量，規(guī)定以鹽酸小檗堿計，含小檗堿不得少于5.5%，測定的黃連花薹樣品中鹽酸小檗堿含量在0.626%～0.679%，僅用鹽酸小檗堿作為黃連花薹的質量控制指標專屬性較差，同時蒙花苷為黃連花薹與黃連藥材的差異性成分，在測定4個化學成分中含量最高，并且與黃連藥材相比具有專屬性。蒙花苷具有較好抗炎、抗氧化活性，可抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡，對肝、腎等器官有保護作用，可調節(jié)骨代謝，還具有降血壓、抑制膽堿酯酶活性等藥理作用，說明黃連花薹極具開發(fā)利用價值[25]。由于蘆丁、綠原酸在黃連花薹中成分含量較高且易于測定，因此本文選擇用蘆丁、綠原酸、鹽酸小檗堿、蒙花苷作為黃連花薹測定的指標性成分。

5 小結

迄今為止，黃連藥材的化學成分、藥理作用等已有相關的研究，但是對于黃連花薹的化學成分、藥理活性等方面的研究涉及甚少，且其具有降脂、降糖、抗氧化的作用，與黃連藥材的治療功效有所不同。于是，本研究選擇黃連花薹作為研究對象，尋找并分離了黃連藥材與黃連花薹中不同的化學成分，建立了QAMS同時測定黃連花薹差異性成分及其他3個成分的含量，可用于黃連花薹的質量控制，為開發(fā)黃連花薹提供參考。