黃芪多糖對急性放射性腸炎大鼠腸黏膜細胞凋亡及TXNIP/NLRP3軸的影響

李浩田，李鵬，王玉鳳，張春禮（.鄭州市第九人民醫(yī)院普外科，鄭州 450053；2.河南中醫(yī)藥大學人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院普外二科，鄭州 450053）

近年來，腫瘤放射治療已達成臨床共識，且其治療逐漸規(guī)范。然而，隨著腫瘤發(fā)病率的增加和放射治療的普及，越來越多的患者在接受盆腔和腹部惡性腫瘤的放射治療后不可避免地發(fā)生急性放射性腸炎（acute radiation enteritis，ARE）[1]。ARE已成為腹部和盆腔惡性腫瘤放射性治療之后常見的腸道并發(fā)癥[2]。研究顯示，電離輻射可導致腸組織內凋亡相關蛋白表達，進而誘導腸黏膜細胞凋亡，是ARE形成的重要機制[3]。黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是從中藥黃芪中提取的主要活性成分之一，有研究表明APS可有效治療三硝基苯磺酸誘導的小鼠結腸炎[4]，提示APS在腸炎中發(fā)揮著保護作用。但目前關于APS治療ARE的研究鮮有報道。硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）/炎性小體3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）通路的激活與潰瘍性結腸炎腸道炎癥有關[5]，但APS對ARE大鼠腸黏膜細胞凋亡及TXNIP/NLRP3軸的影響尚不清楚，因此，本研究擬構建ARE大鼠模型，以探究APS對ARE大鼠腸黏膜細胞凋亡及TXNIP/NLRP3軸的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

72只體質量為（200～250）g的健康雄性SD大鼠，購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司[生產許可證號：SCXK（粵）2020-0055]。所有大鼠均在無特定病原體的環(huán)境下飼養(yǎng)，并在實驗前一周提供自由飲水和飲食。大鼠被飼養(yǎng)在溫度為（25±2）℃，光照/黑暗周期為12 h的環(huán)境中。該動物研究得到鄭州市第九人民醫(yī)院動物倫理委員會的批準（批準號：20200019），所有動物實驗均遵循3R原則。

1.2 試藥

APS（純度：98%，批號：20211223，上海吉至生化科技有限公司）；柳氮磺吡啶腸溶片（批號：20220102，上海信誼天平藥業(yè)有限公司）；白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）；TUNEL檢測試劑盒、ECL發(fā)光檢測試劑盒、BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GAPDH兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的羊抗兔IgG二抗（廣州易錦生物技術有限公司）；JY04S-3C型凝膠成像分析系統(tǒng)（西安明克斯檢測設備有限公司）。

2 方法

2.1 造模及分組

按照隨機數字表法將大鼠分為6組，即對照組（NC組）、模型組（Model組）、黃芪多糖低劑量組（APS-L組）、黃芪多糖中劑量組（APS-M組）、黃芪多糖高劑量組（APS-H組）、陽性藥物組（Positive組），每組12只。參考文獻[6]構建ARE大鼠模型，即除NC組外，其余各組大鼠均給予3%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉后，將大鼠以仰臥位固定于手術臺上，利用直線加速器對大鼠腹部（胸骨劍突至恥骨聯(lián)合處）進行單次照射，照射源距離皮膚50 cm，總照射劑量為12 Gy，照射時間為3 min。照射后24 h內若觀察到大鼠出現(xiàn)腹瀉、稀便、血便等癥狀則表明造模成功。造模24 h后，參考文獻[7]及前期預實驗結果對APS-L組、APS-M組、APS-H組大鼠分別按照100、200、400 mg·kg－1APS的劑量進行灌胃，Positive組大鼠按照300 mg·kg－1柳氮磺吡啶的劑量進行灌胃，NC組及Model組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃15 d。

2.2 疾病活動指數評分

末次給藥24 h后，參照文獻[8]，根據大鼠體質量、糞便性狀和糞便潛血情況進行疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分，包括體質量下降（0分：＜1%；1分：1%～5%；2分：6%～10%；3分：11%～15%；4分：＞15%），大便性狀（0分：正常；1分：軟便成形，不黏附肛門；2分：軟便成形，黏附肛門；3分：腹瀉），糞便潛血（0分：正常；1分：糞便中有暗紅色斑點；2分：肛門可見出血；3分：糞便中有深紅色斑點，肛門有血液黏附）。DAI的計算公式如下：DAI＝（體質量下降分數＋大便性狀分數＋糞便潛血分數）/3。

2.3 標本收集

DAI評分測定完成后，處死大鼠，取大鼠腸黏膜組織，分為兩部分（每部分包含各組6只大鼠的腸黏膜組織），一部分固定于4%多聚甲醛中用于蘇木精-伊紅（HE）、TUNEL染色，另一部分在液氮中迅速冷凍后保存于－80℃中用于ELISA、qRT-PCR、Western blot實驗。

2.4 HE染色

將各組大鼠腸黏膜組織在4%多聚甲醛中固定24 h后，石蠟包埋后將組織切成5 μm的切片并用HE染色，光學顯微鏡觀察HE染色切片的病理形態(tài)變化。

2.5 ELISA法檢測各組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α的含量

取各組大鼠腸黏膜組織，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4），用組織搗碎機以15 000 r·min－1的轉速將腸黏膜組織勻漿，并在4℃下以10 000 r·min－1離心10 min，收集上清液，利用BCA試劑盒檢測上清液蛋白濃度，測量標準品、實驗組樣本的吸光度值，以標準品濃度為X軸，OD值為Y軸建立標準曲線，通過標準曲線計算實驗組樣本IL-6、TNF-α含量。

2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡

將大鼠腸黏膜組織的石蠟包埋切片脫蠟并用乙醇梯度脫水至水化，利用TUNEL檢測試劑盒檢測各組大鼠腸黏膜細胞凋亡情況，利用光學顯微鏡隨機選取5個視野進行觀察，細胞核染色為棕黃色的細胞即為凋亡細胞，細胞凋亡率（%）＝（凋亡細胞數目/總細胞數目）×100%。

2.7 qRT-PCR檢測大鼠腸黏膜組織中相關因子mRNA的表達

使用TRIzol試劑提取腸黏膜組織勻漿中總RNA。將RNA逆轉錄為cDNA后，以cDNA為模板進行定量反應。以GAPDH為內參，通過2－ΔΔCt法計算TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

2.8 Western blot檢測相關蛋白質的表達

利用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解腸黏膜組織，在4℃下以10 000 r·min－1離心10 min收集蛋白質裂解物，并使用BCA蛋白質測定試劑盒測定總蛋白質濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離30 μg蛋白質，電泳分離后轉移至PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜與Bax（1∶2000）、Caspase-3（1∶2000）、TXNIP（1∶1000）、NLRP3（1∶1000）、Caspase-1（1∶1000）、IL-1β（1∶2000）、IL-18（1∶3000）、GAPDH（1∶2500）抗體在4℃下孵育過夜。隨后，將膜與HRP偶聯(lián)的羊抗兔（1∶5000）二抗在室溫下孵育2 h。使用ECL發(fā)光試劑盒觀察蛋白質條帶，以GAPDH為內部參照，利用Image J軟件掃描蛋白條帶的灰度值。

2.9 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。所有數據均表示為平均值±標準差（±s），多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 APS對各組大鼠DAI的影響

經單因素方差分析，6組大鼠的DAI差異具有統(tǒng)計學意義（F＝250.696，P＜0.01，n＝12）。行SNK-q檢驗，與NC組比較，Model組大鼠DAI評分[（2.86±0.32）分]顯著升高（P＜0.05）；與Model組比較，APS-L組[（2.05±0.29）分]、APS-M組[（1.54±0.27）分]、APS-H組[（0.97±0.12）分]、Positive組[（0.89±0.11）分]大鼠DAI顯著降低（P＜0.05），且APS濃度越高，DAI越低。

3.2 各組大鼠結腸黏膜組織病理學變化

NC組大鼠腸黏膜結構完整，無明顯病理變化；與NC組比較，Model組大鼠腸黏膜損傷嚴重，出現(xiàn)炎性細胞浸潤，隱窩及上皮破壞等現(xiàn)象；與Model組比較，APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜損傷程度明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，隱窩及上皮受損逐漸恢復，且APS濃度越高，對應的趨勢越明顯，見圖1。

圖1 HE染色觀察大鼠結腸組織病理學變化（×200）Fig 1 Histopathological changes of rat colon by HE staining（×200）

3.3 APS對各組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α含量的影響

與NC組比較，Model組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α含量顯著升高（P均＜0.05）；與Model組比較，APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α含量顯著降低（P均＜0.05），且APS濃度越高，IL-6、TNF-α含量越低，見圖2。

圖2 APS對各組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α含量的影響Fig 2 Effect of APS on the content of IL-6 and TNF-α in the intestinal mucosa of rats in each group

3.4 APS對各組大鼠腸黏膜細胞凋亡的影響

與NC組比較，Model組大鼠腸黏膜細胞凋亡率及腸黏膜組織中Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著顯著升高（均P＜0.05）；與Model組比較，APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜細胞凋亡率及腸黏膜組織中Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（均P＜0.05），且APS濃度越高，上述指標對應的趨勢越明顯，見圖3～5。

圖3 TUNEL檢測APS對各組大鼠腸黏膜細胞凋亡的影響（×400）Fig 3 Effect of APS on the apoptosis of the intestinal mucosal cells of rats in each group by TUNEL（×400）

圖4 APS對各組大鼠腸黏膜組織中Bax、Caspase-3蛋白表達的影響Fig 4 Effect of APS on the expression of Bax and Caspase-3 protein in intestinal mucosa of rats in each group

圖5 APS對各組大鼠腸黏膜細胞凋亡的影響Fig 5 Effect of APS on the apoptosis of the intestinal mucosal cells in each group

3.5 APS對TXNIP/NLRP3通路相關因子mRNA表達水平的影響

與NC組比較，Model組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA表達水平顯著升高（P均＜0.05）；與Model組比較，APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA表達水平顯著降低（P均＜0.05），且APS濃度越高，上述指標對應的趨勢越明顯，見圖6。

圖6 APS對各組大鼠TXNIP/NLRP3通路相關因子mRNA表達水平的影響Fig 6 Effect of APS on the mRNA expression level of TXNIP/NLRP3 related pathways of the intestinal mucosal cells in various rat groups

3.6 APS對TXNIP/NLRP3通路相關因子表達的影響

與NC組比較，Model組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平顯著升高（P均＜0.05）；與Model組比較，APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平顯著降低（P均＜0.05），且APS濃度越高，上述指標對應的趨勢越明顯，見圖7。

圖7 APS對各組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達的影響Fig 7 Effect of APS on the protein expression of TXNIP，NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 in the intestinal mucosa of rats in each group

4 討論

腹部和盆腔經輻射后引起的ARE是臨床中常見且嚴重的問題，其臨床表現(xiàn)通常包括腹痛、腹瀉、血便、敗血癥、全身炎癥和多器官功能障礙綜合征等[9-10]。目前，對于ARE的治療只是對癥治療[11]。隨著該疾病的發(fā)展，它會引起腸道纖維化和閉塞性動脈內膜炎，并導致高死亡率[12]。最近的研究顯示，誘導細胞凋亡是放射性腸炎形成的重要機制，其中與ARE密切相關的凋亡基因有Caspase-3、Bax等[13]；輻射可使腸黏膜結構的完整性遭到破壞[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，Model組大鼠腸黏膜損傷嚴重，出現(xiàn)炎性細胞浸潤，隱窩及上皮被破壞等現(xiàn)象，DAI評分、炎性因子（IL-6、TNF-α）含量、細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3表達顯著升高，提示ARE大鼠腸黏膜病理損傷嚴重，且存在炎癥反應及細胞凋亡。

黃芪，含有多糖、皂苷、黃酮、氨基酸等成分，可促進抗體產生和免疫反應[15]。APS是從黃芪中提取的有效成分之一，具有多種藥理作用，包括調節(jié)免疫功能、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗纖維化、抗菌、防輻射和抗病毒等[16]。據報道，APS能通過激活Akt/mTOR通路調控凋亡相關蛋白表達，對缺氧/復氧所致乳鼠心肌細胞凋亡起到抑制作用[17]；APS能夠顯著改善潰瘍性結腸炎小鼠體內炎癥水平，促進結腸組織病理學恢復[7]；APS能可改善潰瘍性結腸炎中稀便、血便及體質量下降等癥狀，并且可維持腸黏膜和腸上皮的完整性，減輕炎癥反應程度[18]。而關于APS對ARE大鼠的影響尚未見報道，本研究結果發(fā)現(xiàn)，與Model組比較，APS各劑量組及Positive組大鼠腸黏膜損傷程度明顯減輕，DAI評分、炎性因子（IL-6、TNF-α）含量、細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3表達顯著降低，提示APS可抑制ARE大鼠腸黏膜組織分泌炎性因子及腸黏膜細胞凋亡，對ARE具有明顯的改善作用。

TXNIP/NLRP3通路的激活與炎癥反應的發(fā)生密切相關。經多種內源性損傷信號（如活性氧）刺激后，TXNIP表達上調，促進其與NLRP3結合及NLRP3炎性復合體的形成，進一步激活Caspase-1，進而介導炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌[19-20]。崔勇和等[21]報道白藜蘆醇通過抑制TXNIP/NLRP3信號通路改善脂多糖誘導的腎小管上皮細胞炎性損傷；An等[22]發(fā)現(xiàn)安石榴苷通過調控TXNIP/NLRP3通路抑制細胞凋亡發(fā)揮對糖尿病腎病的保護作用。以上研究表明，抑制TXNIP/NLRP3通路可減輕炎癥反應及細胞凋亡，而關于TXNIP/NLRP3通路在ARE中發(fā)揮何種效應尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，Model組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA及蛋白表達水平顯著升高，提示TXNIP/NLRP3通路可能參與了ARE的發(fā)生；與Model組比較，APS各劑量組及Positive組大鼠腸黏膜組織中上述mRNA及蛋白表達水平顯著降低，且APS濃度越高，上述蛋白表達越低。提示APS可抑制ARE大鼠腸黏膜組織炎性因子的分泌及腸黏膜細胞凋亡，可能與抑制TXNIP/NLRP3通路有關。然而，本研究未在APS作用的基礎上再加上TXNIP/NLRP3通路激活劑來干預ARE大鼠來驗證APS是否通過調控TXNIP/NLRP3通路來抑制ARE大鼠腸黏膜細胞凋亡是本研究的不足之處，后期將會在機制探討中作重要研究，以便更深入地挖掘APS抑制ARE大鼠腸黏膜細胞凋亡的具體機制。

綜上所述，APS可抑制ARE大鼠腸黏膜細胞凋亡，該機制可能與抑制TXNIP/NLRP3軸有關。本研究初步了解TXNIP/NLRP3軸在ARE中的作用，為臨床應用APS及靶向治療ARE提供了理論依據，但APS抑制ARE大鼠腸黏膜細胞凋亡的具體機制較為復雜，有待進一步深入研究。