基于補(bǔ)益脾腎研究獨(dú)活寄生貼對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用

董立財(cái)，王德龍，趙義軍，林春盛，王銳（. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 5000；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 50040）

在我國(guó)關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)18%[1]，且人數(shù)在逐漸上升，其臨床治療上多以手術(shù)治療、服用激素等化學(xué)藥物緩解癥狀，但費(fèi)用高，還具有胃腸道和心血管不良反應(yīng)[2-3]，同時(shí)患者依從性低。患者若未進(jìn)行規(guī)范治療，易發(fā)生關(guān)節(jié)損傷甚至殘疾[4-5]。

中醫(yī)認(rèn)為，關(guān)節(jié)炎屬于痹癥范疇[6]。獨(dú)活寄生貼是在獨(dú)活寄生湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行劑型改造而得。獨(dú)活寄生貼由獨(dú)活、細(xì)辛、桑寄生等藥材組成，能夠祛風(fēng)濕，止痹痛，治療痹證日久、肝腎兩虧之證[7]?！案嗨幠苤尾。瑹o(wú)殊湯藥，用之得法，其響立應(yīng)”，把湯劑改為貼膏劑后，不但可以規(guī)避湯藥的苦味及煎藥之煩瑣，而且還可以避免“陡然下咽、入胃、并可以斃”的弊端[8]。故本文將獨(dú)活寄生的湯劑改變成貼劑，使藥性從毛孔而入其腠理，通經(jīng)貫絡(luò)，起到治療關(guān)節(jié)炎的作用。

1 材料

1.1 試藥

獨(dú)活、桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥、干地黃飲片（哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為211004、200415、211004、200907、200704、210710、201021、200907、210804、211021、210709、210805、201102、211005、210504），均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定符合2020年版《中國(guó)藥典》要求；完全弗氏佐劑（CFA，美國(guó)Sigma公司）；甲氨蝶呤片（規(guī)格：2.5 mg/片，通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)：220903）；布洛芬片（規(guī)格：0.1 g/片，吉林萬(wàn)通藥業(yè)集團(tuán)鄭州萬(wàn)通復(fù)升藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：220605）；大鼠白介素（IL）-β、IL-10酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒（北京冬歌生物科技有限公司，貨號(hào)分別為 DG20049D、DG94478Q）；乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液（飛凈生物科技有限公司，批號(hào)：20220705）。

1.2 儀器

Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；WD-2105A微型離心機(jī)（美國(guó)六一儀器廠）；微量移液器（德國(guó)Eppendof公司）；Scope A1正置熒光顯微鏡（德國(guó)卡爾蔡司）；RM2235切片機(jī)（德國(guó)徠卡）；YLS-6B熱板儀（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar健康大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g；昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，均購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（黑）2018-007。將大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度55%～60%的標(biāo)準(zhǔn)居住環(huán)境，自由攝食及飲水。

2 方法

2.1 獨(dú)活寄生貼的制備

獨(dú)活、桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥、干地黃粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目藥典篩。將上述藥物混勻，加入姜汁∶食醋＝1∶10調(diào)和至糊狀裝入空白穴位貼內(nèi)，備用。

2.2 佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型的建立、給藥及取材

2.2.1 AA模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)挑選6只作為正常對(duì)照組，剩余大鼠于大鼠右足趾處，朝向踝關(guān)節(jié)注射CFA 0.15 mL以致炎[9]，制備大鼠AA模型。正常對(duì)照組大鼠同法注射等體積生理鹽水。

2.2.2 分組及處理 將造模成功的大鼠分為模型組、治療組（穴位貼組）、陽(yáng)性組（甲氨蝶呤片），每組6只。穴位貼組：將獨(dú)活寄生貼貼敷于“腎俞”“脾俞”，2 次·d－1、4 h/次。陽(yáng)性組：甲氨蝶呤片按照每周0.8 mg·kg－1的劑量進(jìn)行灌胃。正常對(duì)照組和模型組大鼠不作任何干預(yù)。

2.2.3 取材 戊巴比妥鈉麻醉（45 mg·kg－1）大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1 h后，4℃、3000 r·min－1離心15 min分離血清，－80℃保存?zhèn)溆?。戊巴比妥鈉（60 mg·kg－1）過(guò)量麻醉大鼠安樂(lè)死，固定，大鼠踝關(guān)節(jié)上下兩側(cè)斷開，保存在組織固定液中固定備用[10]。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 一般情況觀察 在給藥第3、6、9、12、15、18、21日觀察上述各組大鼠的生活狀態(tài)（飲食及活動(dòng)變化，毛色的改變）和關(guān)節(jié)部位紅腫的情況。

2.3.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分 各組大鼠參考AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（見表1），對(duì)其雙側(cè)后足關(guān)節(jié)進(jìn)行炎性評(píng)分[11]，每個(gè)足爪的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度由0到4分表示：AI為每只大鼠兩只后足的累積評(píng)分，最大值為8分。當(dāng)AI≥3分即認(rèn)定為AA模型復(fù)制成功。

表1 AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Scoring criteria for AI

2.3.3 大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)足腫脹度 首先在大鼠的踝關(guān)節(jié)處用畫筆做標(biāo)記，每隔3日稱定大鼠體質(zhì)量，同時(shí)用排水法測(cè)量左右后足體積大小作為基礎(chǔ)值。以造模當(dāng)日為第0日，每隔3日采用足容積法測(cè)量足腫脹體積，每次測(cè)量3次取平均值，記錄并計(jì)算足腫脹度。比較各組間腫脹度大小的差異，并繪制變化圖形。

大鼠足腫脹度（%）＝（造模后足容積－初始足容積）/初始足容積×100%。

2.3.4 IL-β、IL-10檢測(cè) 取各組大鼠離心血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定大鼠血清中的IL-β、IL-10。

2.3.5 HE染色 取大鼠踝關(guān)節(jié)，修剪大約5 mm厚度，在組織固定液中固定48 h后，先后用PBS和蒸餾水清洗3次，每次20 min。轉(zhuǎn)移到約20倍體積的EDTA脫鈣液中，置于37℃溫箱中，每2日更換一次EDTA脫鈣液。直到用針刺無(wú)阻力，表示到達(dá)脫鈣終點(diǎn)。將脫鈣終點(diǎn)的踝關(guān)節(jié)置于不同濃度的乙醇中，之后用二甲苯將其脫水至透明。石蠟包埋，切成約5 mm的切片，進(jìn)行染色后使用中性樹脂封片，并在光學(xué)顯微鏡下觀察其組織病理形態(tài)變化。

2.3.6 脾臟、胸腺指數(shù) 摘取處死大鼠的脾臟和胸腺，稱定質(zhì)量，計(jì)算脾臟和胸腺指數(shù)。脾臟（胸腺）指數(shù)（%）＝脾臟（胸腺）（g）/大鼠質(zhì)量（g）×100%。

2.3.7 小鼠熱板致痛實(shí)驗(yàn) 取小鼠50只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前選擇舔足時(shí)間在5～30 s內(nèi)的小鼠，將符合條件的小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（布洛芬片）、貼劑組。啟動(dòng)儀器，將小鼠置于事先預(yù)熱的熱板儀上（55.0±0.5）℃，以小鼠舔后足為疼痛反應(yīng)指標(biāo)，觀察小鼠出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間（s）作為該鼠痛閾值。連續(xù)給藥6日，于末次給藥后30、60、90、120 min分別測(cè)量各組小鼠給藥后的痛閾值。

2.3.8 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均用±s表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Donnett T3檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠在注射后1日，后足趾局部開始出現(xiàn)紅腫，緊接著紅腫部位變大，注射部位潰瘍結(jié)痂，結(jié)果見圖1。模型組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，進(jìn)食減少、毛發(fā)干枯且發(fā)黃、活動(dòng)減少，體質(zhì)量增加緩慢甚至減少。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、治療組大鼠精神狀態(tài)較佳、皮毛光澤、飲食正常、自由活動(dòng)關(guān)節(jié)、無(wú)異常狀態(tài)出現(xiàn)。

圖1 獨(dú)活寄生貼對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)及足腫脹程度的影響Fig 1 Effect of Duhuo Jisheng paste on ankle swelling and paw in AA rat

3.2 對(duì)AA大鼠AI的影響

各組大鼠造模前足跖腫脹度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠在給予CFA的第6日開始AI顯著升高，在第9日達(dá)到峰值（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、治療組大鼠AI均顯著降低。結(jié)果見圖2。

圖2 獨(dú)活寄生貼對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（ ±s，n＝6）Fig 2 Effect of Duhuo Jisheng paste on arthritis index of AA rat（ ±s，n＝6）

3.3 對(duì)AA大鼠體質(zhì)量影響

各組大鼠造模前體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模第9日，模型組大鼠體質(zhì)量較正常對(duì)照組顯著減輕（P＜0.01）；貼敷干預(yù)12 d后，治療組的大鼠體質(zhì)量均高于模型對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 獨(dú)活寄生貼對(duì)AA大鼠體質(zhì)量的影響(g， ±s，n＝6)Tab 2 Effect of Duhuo Jisheng paste on body mass of AA rat (g， ±s，n＝6)

表2 獨(dú)活寄生貼對(duì)AA大鼠體質(zhì)量的影響(g， ±s，n＝6)Tab 2 Effect of Duhuo Jisheng paste on body mass of AA rat (g， ±s，n＝6)

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別劑量/（g·kg－1）第0日第3日第6日第9日第12日第15日第18日第21日正常對(duì)照組－198.21±7.01204.26±6.13207.51±5.20212.65±5.07214.94±2.86218.96±2.81222.81±5.28228.15±5.44模型組－200.93±4.09202.35±5.63204.09±4.19192.36±8.59**194.07±7.07** 199.4±9.90**204.54±4.87**209.88±5.50**陽(yáng)性對(duì)照組0.5×10－3199.93±3.22203.48±2.42207.35±4.16209.38±3.37##209.84±2.92##210.13±3.21##210.15±2.17#217.12±1.93#治療組10.62200.76±4.36203.33±2.77205.94±2.54208.32±1.94212.49±2.13##215.50±2.95##218.20±2.53##221.15±3.57##

3.4 對(duì)AA大鼠足腫脹的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠在致炎后第6～15日足趾腫脹度逐漸升高，18日達(dá)到峰值。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、治療組大鼠足趾腫脹度上升速度較慢，呈先上升后下降趨勢(shì)。結(jié)果見圖3。抑制率%＝（右后足腫脹后厚度－右后足腫脹前厚度）/右后足腫脹前厚度×100%。

圖3 獨(dú)活寄生貼對(duì)AA大鼠足腫脹度的影響（ ±s，n＝6）Fig 3 Effect of Duhuo Jisheng paste on foot swelling of rat（ ±s，n＝6）

3.5 對(duì)AA大鼠血清IL-1β及IL-10水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β水平顯著升高（P＜0.01），IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、治療組大鼠血清中IL-1β水平顯著下降（P＜0.01），IL-10水平出現(xiàn)不同程度的升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖4。

圖4 獨(dú)活寄生貼對(duì)AA大鼠血清炎癥因子水平的影響（ ±s，n＝6）Fig 4 Effect of Duhuo Jisheng paste on inflammatory factors levels of AA rat（ ±s，n＝6）

3.6 對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組踝關(guān)節(jié)組織中壞死骨組織增多、被大面積增生的結(jié)締組織取代，同時(shí)中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、治療組關(guān)節(jié)軟骨表面無(wú)增生、關(guān)節(jié)軟骨邊緣的滑膜組織腫脹減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)降低，提示能夠抑制滑膜細(xì)胞增生和纖維組織滲出。結(jié)果見圖5。

圖5 獨(dú)活寄生貼對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)的影響（HE，×100）Fig 5 Effect of Duhuo Jisheng paste on histopathological morphology of ankle joint in AA rats（HE，×100）

3.7 對(duì)AA大鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟、胸腺指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、治療組大鼠脾臟、胸腺指數(shù)降低（P＜0.05），結(jié)果見圖6。

圖6 獨(dú)活寄生貼對(duì)大鼠脾臟/胸腺指數(shù)的影響（ ±s，n＝6）Fig 6 Effect of Duhuo Jisheng paste on spleen/thymus index in AA rats（ ±s，n＝6）

3.8 對(duì)小鼠熱板痛閾值的影響

結(jié)果表明，各組小鼠給藥前的痛閾值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、貼劑組小鼠出現(xiàn)舔足所需時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），提示該貼劑具有鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果見圖7。

圖7 獨(dú)活寄生貼對(duì)小鼠熱板痛閾值的影響（ ±s，n＝10）Fig 7 Effect of Duhuo Jisheng paste on pain threshold of mouse pain model induced by hot plate method（ ±s，n＝10）

4 討論

中藥穴位敷貼是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，將藥物制成需要的穴位貼，用于特定穴位。穴位貼通過(guò)化學(xué)、溫度等方式刺激穴位發(fā)揮作用。穴位敷貼作用機(jī)制描述為“切于皮膚，徹于肉理。攝于吸氣，融于滲液”。膏方用藥，其法通于湯丸，凡湯丸行之有效者，其方皆可熬膏以用。因此本文以獨(dú)活寄生湯為基礎(chǔ)，改變其湯劑為貼劑。

獨(dú)活寄生貼在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，方中各味藥按照君臣佐使的配伍關(guān)系，相互協(xié)調(diào)發(fā)揮治療作用。藥理研究發(fā)現(xiàn)，該貼劑的各味藥具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、免疫抑制等作用，可預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎。

研究表明，致病大鼠外周血T細(xì)胞遷移到病變的關(guān)節(jié)組織，或許是與參與關(guān)節(jié)免疫損傷有關(guān)，導(dǎo)致血T細(xì)胞比例降低[12]。循環(huán)系統(tǒng)和關(guān)節(jié)腔中的T細(xì)胞過(guò)度活化，導(dǎo)致T細(xì)胞功能紊亂、Th1/Th2細(xì)胞失衡、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞異常等免疫應(yīng)答[13]。病變關(guān)節(jié)組織的T細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑膜組織的纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞相結(jié)合，以組織相容性復(fù)合體-Ⅱ（MHCⅡ）類分子依賴的方式遞呈修飾后自身的抗原，活化T細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞生成自身抗體，形成免疫復(fù)合物，沉積在關(guān)節(jié)組織，進(jìn)一步加速免疫反應(yīng)，參與滑膜炎癥反應(yīng)[14]。Th1、Th2細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β等炎性因子加速破骨細(xì)胞形成，參與骨與軟骨的破壞，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎病理?yè)p傷[15-16]。炎癥相關(guān)因子持續(xù)影響著關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程。關(guān)節(jié)炎發(fā)生后，在炎性因子的刺激下，關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生炎性反應(yīng)，NF-κB通路被激活，導(dǎo)致下游白介素系列炎性因子大量增多。在相關(guān)因子的作用下，軟骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能被破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)損傷與衰減[17]。

本研究采用CFA制備AA模型，模型大鼠關(guān)節(jié)存在與AA相似的滑膜病理改變和骨質(zhì)破壞。模型組大鼠造模后，精神倦怠、食欲減退、四肢出現(xiàn)明顯紅腫及變形、足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高，顯示造模成功。大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生明顯，可見滑膜組織充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨細(xì)胞破壞、血管翳生成，表明模型大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。因此本研究檢測(cè)IL-1β、IL-10水平，研究獨(dú)活寄生貼對(duì)關(guān)節(jié)炎的作用，結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β水平顯著升高，IL-10水平顯著降低；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、治療組大鼠血清中IL-1β水平顯著下降，IL-10水平出現(xiàn)不同程度的升高。提示該貼劑可能參與了關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，不僅減少了關(guān)節(jié)炎性損傷，而且明顯減輕了關(guān)節(jié)病理?yè)p傷。

脾臟和胸腺是機(jī)體發(fā)揮免疫作用的關(guān)鍵器官，常用其指數(shù)的高低來(lái)反映免疫器官發(fā)育的程度，脾臟和胸腺發(fā)育越好，質(zhì)量越大，機(jī)體的免疫能力越強(qiáng)[18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)稱質(zhì)量大鼠的脾臟、胸腺的重量，計(jì)算其指數(shù)，評(píng)估該貼劑對(duì)免疫系統(tǒng)的作用。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)顯著升高，標(biāo)志著AA大鼠免疫系統(tǒng)的激活，滑膜組織中炎癥因子釋放，發(fā)生炎癥癥狀。經(jīng)獨(dú)活寄生貼干預(yù)后，與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、治療組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)明顯降低，提示治療組能在一定程度上改善大鼠的免疫功能。同時(shí)大鼠造模成功后，炎性反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致模型組大鼠的足腫脹程度增高。給予穴位貼敷后，抑制炎性的發(fā)生，陽(yáng)性對(duì)照組、治療組足腫脹度降低。

綜上，獨(dú)活寄生貼對(duì)AA大鼠具有一定的防治作用，可明顯減輕大鼠足腫脹程度、踝關(guān)節(jié)滑膜炎癥。其作用機(jī)制可能與IL-1β和IL-10水平有關(guān)，可抑制炎性反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力，本研究對(duì)獨(dú)活寄生貼的開發(fā)與應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用。