網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合巨噬細胞差異基因揭示雙氫楊梅樹皮素改善急性肺損傷的作用機制及實驗驗證

唐木蘭，曾春暉，黃鑫波，王溢，朱海濱，楊柯（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指繼發(fā)于非心源性呼吸窘迫的低氧血癥-原發(fā)性肺水腫。ALI隨著病情進一步發(fā)展為更嚴重的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），病死率高達30%～50%[1-2]。巨噬細胞在炎癥發(fā)生過程和免疫系統(tǒng)激活起到關(guān)鍵作用，其具有可塑性和功能多樣性，可以極化為M1或M2亞型。M1 型巨噬細胞與促炎有關(guān)，而 M2型巨噬細胞則與抗炎、傷口愈合及纖維化作用相關(guān)[3-4]。已有研究證實，在ALI/ARDS急性滲出期M1型巨噬細胞的數(shù)量明顯增加，因此巨噬細胞可被作為治療ALI/ARDS的靶細胞。

藤茶[Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang]系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄的嫩莖葉，含有豐富的黃酮類化合物，以雙氫楊梅樹皮素為主[5]。課題組前期實驗已證明藤茶能顯著增加小鼠胸腺、脾臟等免疫器官的重量[6-7]，具有增強非特異性免疫功能和體液免疫功能的作用；前期研究也表明雙氫楊梅樹皮素具有抵抗博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化作用，改善呼吸功能衰退的癥狀[8]。本文構(gòu)建“化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，提示雙氫楊梅樹皮素可通過PI3K-Akt信號通路改善ALI，且進行巨噬細胞極化差異基因KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞的極化也與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)，因此后續(xù)實驗選取PI3K/Akt信號通路的主要蛋白進行驗證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實驗考察雙氫楊梅樹皮素對ALI小鼠肺部調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的功能及蛋白表達進行測定，為后續(xù)探討雙氫楊梅樹皮素調(diào)節(jié)巨噬細胞極化改善ALI/ARDS的機制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試藥

雙氫楊梅樹皮素[廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實驗室提供，從藤茶（Ampelopsis grossedentata（Hand-Mass）W.T.Wang）的莖葉中分離、純化得到，為白色粉末狀，純度≥98%]。醋酸地塞米松（批號：2201222，安徽金太陽生化藥業(yè)有限公司）；脂多糖（LPS，批號：12101031，北京索萊寶科技有限公司）；流式抗體PE-F4/80、FITC-CD11b、CD86-APC、PE-Cy7-CD206（批號分別為12-4801-82、11-0112-82、17-0862-82、25-2061-82，美國賽默飛世爾科技公司）；PI3K抗體、Akt抗體（批號分別為2893S、4691S，Cell Signaling Technology），β-Actin抗體（批號：00078629，Proteintech）；10%SDSPAGE凝膠配制盒（批號：02581100，上海雅酶生物科技有限公司）。BD LSRFortessa流式細胞分析儀（美國BD公司）。

1.2 實驗動物

SPF級KM小鼠36只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g [湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004；動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001]。

1.3 數(shù)據(jù)庫

PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem. ncbi.nlm.nih. gov/），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/），Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），微生信（https：//www.bioinformatics.com.cn/login/）在線作圖平臺，GEO數(shù)據(jù)庫（https：gene expression omnibus），DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

應(yīng)用PharmMapper、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索雙氫楊梅樹皮素的預(yù)測靶點和ALI/ARDS相關(guān)疾病靶點，兩者取交集，上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，根據(jù)Degree≥16、Closeness Centrality≥0.524、Betweenness Centrality≥0.002篩選靶點并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，獲得41個潛在核心靶點。利用Metascape數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行KEGG通路富集分析，主要通路包括PI3K-Akt、雌激素信號通路、內(nèi)分泌抵抗，并運用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1。

圖1 “化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 “Compound-target-pathway” network

根據(jù)篩選出的6個核心靶點與雙氫楊梅樹皮素進行對接。在PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取“ampelopsin”的化學(xué)結(jié)構(gòu)（PubChem CID：25184515），利用AutoDock軟件進行分子對接計算，ΔG值越小表示結(jié)合能越高，越容易與受體結(jié)合，對接結(jié)果見表1，與雙氫楊梅樹皮素對接的相互作用見圖2。其中MMP9、IGF1與雙氫楊梅樹皮素的結(jié)合能力較強，結(jié)合能分別為－7.77 kJ·mol－1、－7.27 kJ·mol－1。

表1 雙氫楊梅樹皮素與關(guān)鍵靶點的分子對接結(jié)果Tab 1 Molecular docking of ampelopsin with key target

圖2 蛋白與雙氫楊梅樹皮素對接的相互作用示意圖Fig 2 Interaction between protein and ampelopsin

2.2 巨噬細胞差異基因篩選及KEGG通路分析

從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得GSE95405基因芯片數(shù)據(jù)集。此數(shù)據(jù)為GPL570平臺Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array基因芯片，選取經(jīng)干擾素-γ（INF-γ）和LPS誘導(dǎo)巨噬細胞M1 型極化的3例樣本，白細胞介素-4（IL-4）誘導(dǎo)巨噬細胞M2型極化的3例樣本，共獲得3980個差異基因。其中1682個基因在M1型巨噬細胞中表達上調(diào)，在M2型巨噬細胞中表達下調(diào)；2298個基因在M1型巨噬細胞中表達下調(diào)，在M2型巨噬細胞中表達上調(diào)。利用GEO2R分析芯片數(shù)據(jù)的差異表達基因，過濾條件為P＜0.001及差異倍數(shù)|logFC|＞2。利用DAVID數(shù)據(jù)庫將篩選的差異基因?qū)?DAVID 在線數(shù)據(jù)庫進行 KEGG 通路富集分析，按照P值排序，主要包括PI3K-Akt、細胞因子-細胞因子-受體相互作用等信號通路，選取前20條信號通路可視化，富集通路結(jié)果見圖3。

圖3 差異基因KEGG通路富集分析Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis of differential gene

2.3 動物實驗

2.3.1 動物分組與給藥方法 將36只SPF級KM小鼠隨機分為6組：正常對照組，模型組，地塞米松組（5 mg·kg－1），雙氫楊梅樹皮素高、中、低（400、200、100 mg·kg－1）劑量組，每組6只。正常對照組小鼠氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水，其余各組小鼠氣管內(nèi)滴注8 mg·kg－1的LPS建立ALI小鼠模型，雙氫楊梅樹皮素各劑量組和地塞米松組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，正常對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)3 d。

2.3.2 肺泡灌洗液的收集與巨噬細胞亞型的檢測 肺泡灌洗液用1 mL注射器向氣管內(nèi)緩慢注入0.5 mL預(yù)冷的生理鹽水灌洗小鼠肺組織，慢慢回抽灌洗液，反復(fù)灌3次，每遍沖洗3次，回收肺泡灌洗液（BALF）。BALF 4℃、1000 r·min－1離心10 min，收集細胞沉淀。向細胞懸液中加入1 mL的紅細胞裂解液，顛倒混勻放置15 min，期間輕輕混勻2次，紅細胞裂解后，溶液為清亮透明液體；4℃、1000 r·min－1離心10 min，小心倒去上清液，獲取細胞沉淀，PBS重懸細胞；每管加入FITC-CD11b、PEF4/80、CD86-APC和PE-Cy7-CD206抗體。冰上避光孵育30 min，孵育完成后，每支流式管加入1 mL PBS洗滌細胞；4℃、1000 r·min－1離心5 min，洗去未結(jié)合或者非特異性結(jié)合的流式抗體，重復(fù)2次；加入1 mL PBS重懸細胞，過濾到流式管中，得到流式抗體染色后的小鼠BALF單細胞懸液，上機檢測。

2.3.3 雙氫楊梅樹皮素誘導(dǎo)肺巨噬細胞向M2型極化 流式細胞術(shù)檢測小鼠BALF中巨噬細胞標志物F4/80和CD11b、M1型標志物CD86以及M2型標志物CD206。如圖4和表2顯示，與正常對照組相比，模型組中表達F4/80＋CD11b＋CD86＋的M1型巨噬細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.001），而F4/80＋CD11b＋CD206＋的M2型巨噬細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.001）；雙氫楊梅樹皮素干預(yù)后F4/80＋CD11b＋CD206＋的M2型巨噬細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），且M1/M2的比例也明顯降低（P＜0.01）。由此可見，雙氫楊梅樹皮素可促進肺巨噬細胞向M2型極化。

表2 雙氫楊梅樹皮素對小鼠BALF中巨噬細胞極化的影響(%，x±s，n＝6)Tab 2 Effect of ampelopsin on macrophage polarization in BALF(%，x ±s，n＝6)

圖4 雙氫楊梅樹皮素對小鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞極化的影響Fig 4 Effect of ampelopsin on macrophage polarization in BALF

2.3.4 雙氫楊梅樹皮素降低小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白的表達 取小鼠肺組織以1∶1比例（1 g組織 ∶1 mL裂解液）使用勻漿機進行研磨，4℃、15 000 r·min－1離心10 min，取上清液，用BCA試劑盒進行蛋白定量。采用SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒制備10%的PAGE膠，上樣，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉40 min后加一抗，其中內(nèi)參β-Actin為1∶5000，PI3K/Akt抗體為1∶1000，4℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗1∶5000，常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯影，利用Image Lab軟件進行灰度值統(tǒng)計得到結(jié)果。與正常對照組相比，模型組PI3K、Akt蛋白表達量明顯增加；與模型組相比，雙氫楊梅樹皮素高劑量組PI3K 蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），雙氫楊梅樹皮素各劑量組Akt蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見圖5。

圖5 雙氫楊梅樹皮素對小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白表達量的影響（x ±s，n＝3）Fig 5 Effect of ampelopsin on the expression level of PI3K and Akt in the lung（x ±s，n＝3）

2.4 數(shù)據(jù)處理

本研究數(shù)據(jù)分析和作圖采用軟件為SPSS 20和GraphPadPrism8.0，結(jié)果用x± s表示。組間差異使用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)AKT1、ALB等為雙氫楊梅樹皮素改善ALI/ARDS的關(guān)鍵靶點，AKT1是肺內(nèi)皮細胞中AKT的主要亞型，對內(nèi)皮細胞遷移和血管滲漏預(yù)防具有重要作用，敲除AKT1會降低層黏連蛋白和基底膜厚度，造成血管通透性增加，從而加重肺損傷[9-10]。KEGG通路分析表明，雙氫楊梅樹皮素改善ALI/ARDS與PI3K/Akt、雌激素等信號通路相關(guān)，其中PI3K/Akt信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，調(diào)控細胞分化、增殖和凋亡等功能，通過激活μ阿片類受體（MOR）抑制PI3K/Akt信號通路可以改善LPS造成的ALI/ARDS[11]。黃芩苷通過降低PI3K/Akt信號通路的活化水平可以誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化和抑制M1型極化[12]。另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能顯著促進巨噬細胞向M2型極化[13-14]，與本研究通路分析結(jié)果一致，雌激素信號通路作為調(diào)節(jié)M2型極化的重要通路之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雙氫楊梅樹皮素能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，降低肺泡內(nèi)IL-6和IL-1β等促炎細胞因子的釋放，同時降低單核-巨噬細胞的比例改善ALI。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，雙氫楊梅樹皮素能明顯增加M2型巨噬細胞極化和降低M1/M2的比例，Western blot結(jié)果表明模型組小鼠肺組織中PI3K和Akt蛋白表達量明顯增加，給予雙氫楊梅樹皮素干預(yù)后，各給藥組PI3K和Akt蛋白表達量顯著降低，證實雙氫楊梅樹皮素具有調(diào)節(jié)巨噬細胞極化改善ALI/ARDS的潛在治療作用，且作用機制可能是與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

綜上，本研究借助多種生物信息學(xué)手段，將雙氫楊梅樹皮素進行靶點預(yù)測、通路分析，聯(lián)合ALI中免疫細胞-巨噬細胞極化差異表達基因，通過流式細胞術(shù)檢測M1/M2型巨噬細胞及肺組織中PI3K和Akt的蛋白表達量驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果。雙氫楊梅樹皮素通過降低PI3K和Akt的蛋白表達量調(diào)節(jié)巨噬細胞極化從而改善ALI。本課題組后續(xù)將進一步深入研究雙氫楊梅樹皮素調(diào)控巨噬細胞極化的作用機制，以期為指導(dǎo)通過藥物調(diào)控巨噬細胞向有利于遏制疾病的方向極化，為疾病的治療提供新的方法。