基于Notch/STAT信號通路研究神香草對哮喘免疫失衡的調(diào)節(jié)作用

潘雅朦，康雨彤，蔡曉翠，張思蓉，賀金華*（. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 8300；. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 83000）

支氣管哮喘簡稱為哮喘，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征，由多種炎性細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及細(xì)胞組分共同參與的氣道疾病[1]，其中T淋巴細(xì)胞起著非常重要的作用。在哮喘免疫異常發(fā)病過程中，Thl、Th2、Thl7和Treg細(xì)胞比例失衡以及細(xì)胞因子效應(yīng)失調(diào)扮演著重要角色，Th1/Th2以及Th17/Treg免疫失衡是哮喘發(fā)病的重要免疫學(xué)機(jī)制[2]。

在Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞的分化過程中，Notch發(fā)揮著重要作用[3]。Notch信號通路包括4種Notch受體（包括Notch3）和5種Notch配體（包括Delta1和Delta4），它們表達(dá)在T細(xì)胞和多個(gè)成熟免疫細(xì)胞的表面，同時(shí)參與T細(xì)胞的分化。當(dāng)Notch受體結(jié)合配體后，下游產(chǎn)物被激活以抑制分化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，從而影響T細(xì)胞的發(fā)育過程[4]。研究證實(shí)，Notch信號通路的異?；罨c哮喘中Th1/Th2的免疫失衡密切相關(guān)，能夠調(diào)節(jié)哮喘Th1/Th2平衡[5]；Treg細(xì)胞可以通過Delta4-Notch信號通路來改善氣道重塑[6]。CD4＋T細(xì)胞表達(dá)的Notch3與Delta1結(jié)合，促使Th0向Th1細(xì)胞分化，從而減弱Th2型免疫反應(yīng)；Treg細(xì)胞表達(dá)的Notch3與Delta4結(jié)合，可減少肺內(nèi)新生血管生成[7-8]。STAT信號通路在哮喘發(fā)病過程中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用。當(dāng)肺部感染時(shí)，存在Th17/Treg失衡以及STAT3和STAT5信號通路的異常表達(dá)[9]。STAT3和NF-κB能協(xié)同調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞因子和趨化因子，在慢性炎癥中發(fā)揮重要作用[10]。STAT6激活后通過JAK-STAT6通路介導(dǎo)哮喘炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性[11]。有研究表明通過抑制JAK1/STAT6通路能夠改善哮喘的氣道黏液分泌失衡，從而達(dá)到緩解癥狀的效果[12]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)神香草提取物（JAX2）能減輕肺組織支氣管周圍、血管周圍的Eos浸潤，減少黏液的過度分泌，降低哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、IL-4及血清中特異性IgE的含量，升高IFN-γ含量，對哮喘小鼠氣道炎癥具有顯著的抑制作用；JAX2作用于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞后能顯著降低一氧化氮（NO）的釋放、抑制TNF-α和IL-6的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）濃度；并且能夠顯著抑制乙酰膽堿、組胺導(dǎo)致的氣管平滑肌收縮，緩解支氣管痙攣。T淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子效應(yīng)失調(diào)在哮喘免疫異常發(fā)病中扮演著重要角色，而介導(dǎo)T細(xì)胞間及胞內(nèi)傳遞信息的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在疾病發(fā)生發(fā)展過程中作用尤為重要。因此，本研究建立小鼠哮喘模型，觀察JAX2對哮喘小鼠肺組織Notch/STAT信號通路蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討JAX2治療哮喘免疫失衡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性健康Balb/c小鼠，共42只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g。由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)于新疆藥物研究所動(dòng)物房，溫度20～25℃，濕度50%～60%，自由攝食及飲水，動(dòng)物許可證號：SYXK（新）2022-0002。

1.2 試藥與儀器

神香草經(jīng)新疆藥物研究所何江研究員鑒定為唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatusBoriss.的干燥地上部分，提取物由新疆藥物研究所制備；卵清白蛋白（OVA，Sigma）；氫氧化鋁膠生理鹽水（哈藥集團(tuán)生物有限公司）；Delta4抗體（美國R&D公司）；STAT3、P-STAT3抗體（美國CST公司）；Delta1（ab10554）、Notch3（ab23426）、STAT6抗體（ab263947）（美國Abcam公司）；小鼠IL-10 ELISA試劑盒（美國賽默飛公司）；小鼠IL-4（abs520003）、IL-17（abs520009）、IFN-γ（abs520007）ELISA試劑盒（上海愛必信公司）；全自動(dòng)脫水儀（TP1020）、石蠟包埋機(jī)（EG1150H）、手轉(zhuǎn)軸式切片機(jī)（RM2235）（德國萊卡）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 JAX2制備

神香草干燥地上部分用50%乙醇加熱回流提取，再經(jīng)過減壓濃縮、干燥，將干浸膏用水混懸后經(jīng)聚酰胺樹脂分離純化，收集40%乙醇水洗脫液并濃縮、干燥，即得JAX2。JAX2主要含咖啡酸、咖啡酸甲酯、木犀草素7-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→6）-β-D吡喃葡萄糖苷、香葉木苷、迷迭香酸、新西蘭牡荊苷、三裂鼠尾草素、金絲桃苷、金合歡素、3，4-二甲氧基肉桂酸等黃酮類和酚類化合物[13]。課題組采用高效液相色譜法對提取物中主要活性成分迷迭香酸、總多糖和總黃酮進(jìn)行了定量研究[14]。

1.4 哮喘模型的建立

模型組與各給藥組小鼠分別于實(shí)驗(yàn)第1、8日腹腔注射10%OVA致敏液0.2 mL致敏；空白組于實(shí)驗(yàn)第1、8日腹腔注射0.2 mL生理鹽水代替OVA溶液。從第15日起，將小鼠置于霧化箱內(nèi)，模型組、給藥組小鼠用壓縮霧化器噴入OVA溶液激發(fā)哮喘，空白組霧化噴入生理鹽水，每日1次，每次30 min。小鼠出現(xiàn)呼吸和運(yùn)動(dòng)失常，連續(xù)刺激后小鼠狀態(tài)持續(xù)變差，出現(xiàn)呼吸困難，躁動(dòng)，動(dòng)作遲緩，食欲不振為造模成功。

1.5 分組及給藥

42只小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，JAX2（高、中、低劑量）組，肺寧片組和地塞米松組，每組6只。給藥組小鼠從第15日開始分別給予相應(yīng)藥物治療1 h后霧化刺激30 min，每日1次。

1.6 標(biāo)本采集

末次激發(fā)24 h后，快速摘去小鼠右眼球，按壓腹部，使血液盡可能完全滴入抗凝管中。小鼠取血后，暴露并剪開氣管，將1 mL注射器針頭插入氣管內(nèi)并固定。每次注入0.5 mL生理鹽水回吸，總共灌洗3次（回抽率為80%～90%），將收集到的BALF于4℃、1500 r·min－1離心2次，每次10 min，取上清液置－80℃保存?zhèn)溆?。迅速打開胸腔，暴露肺及心臟，摘取肺組織，用4℃的生理鹽水沖洗干凈后，使其完全浸透在4%多聚甲醛中固定后備用。

1.7 小鼠外周血淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞數(shù)量及比例測定

利用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取適宜濃度細(xì)胞懸液待用。① Th1、Th2、Th17細(xì)胞檢測：取細(xì)胞懸液加入細(xì)胞刺激劑，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，洗滌1次，加入CD4抗體，4℃避光孵育15 min后，加入破膜劑孵育30 min；再加入IFN-γ、IL-4、IL-17抗體，4℃避光孵育30 min后，用PBS洗1次，重懸后上機(jī)檢測。② Treg細(xì)胞檢測：取細(xì)胞懸液加入CD4、CD25抗體，4℃避光孵育20 min后，加入破膜劑孵育30 min；接著加入FOXP3抗體避光孵育20 min，洗滌2次，重懸后上機(jī)檢測。

1.8 肺組織中受體/配體蛋白的表達(dá)

采用免疫組化染色，將肺組織切片烘片、脫蠟、水化、封閉、抗原修復(fù)后滴加對應(yīng)的一抗，置于干燥箱內(nèi)37℃下孵育1.5 h，再用PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，于37℃下繼續(xù)孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；加入SABC，37℃下恒溫30 min，PBS洗3次，每次5 min；加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色5～8 min后，用自來水沖洗2 min終止顯色；用蘇木精染色沖洗后封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織切片的染色情況及蛋白在肺組織切片中的分布情況，記錄各組數(shù)據(jù)。

1.9 BALF中細(xì)胞因子的含量檢測

采用ELISA法檢測IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17的水平，酶標(biāo)儀測定OD值，根據(jù)樣品OD值算出相應(yīng)樣品的含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩個(gè)變量服從正態(tài)分布，其相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析；若不符合正態(tài)分布，其相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)變化

模型組小鼠毛發(fā)直立稀疏、枯燥無光澤，呼吸急促常伴有喘息、抓耳撓腮，連續(xù)霧化后小鼠呼吸頻率增加，精神逐漸變差，多數(shù)出現(xiàn)咳嗽現(xiàn)象，煩躁不安，反應(yīng)遲鈍，食欲減少；與模型組相比，治療組小鼠激發(fā)后出現(xiàn)呼吸頻率增加，喘息等現(xiàn)象，經(jīng)過治療，食欲增加，呼吸和喘息頻率下降，毛發(fā)有光澤，偶爾咳嗽，癥狀減輕；空白組小鼠毛發(fā)油亮，呼吸正常，情緒穩(wěn)定，食欲良好。

2.2 Th1、Th2細(xì)胞比例及Th1/Th2比值

模型組Th2細(xì)胞占CD4＋T淋巴細(xì)胞比例顯著高于空白組，Th1細(xì)胞占CD4＋T淋巴細(xì)胞比例較空白組無明顯變化。JAX2組和陽性藥組Th1細(xì)胞數(shù)量及Th1/Th2顯著高于模型組，JAX2組Th2細(xì)胞數(shù)量顯著低于模型組（見圖1和圖2）。

圖1 小鼠Th1細(xì)胞（A）、Th2細(xì)胞（B）占CD4＋T淋巴細(xì)胞百分比（%）Fig 1 Percentage of Th1（A） and Th2 （B）cells in mice CD4＋T lymphocytes（%）

圖2 小鼠Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞比例及Th1/Th2比值變化Fig 2 Changes in the proportion of Th1 and Th2 cells and the ratio of Th1/Th2 in each group of mice

2.3 Th17、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比值

模型組Th17細(xì)胞占CD4＋T淋巴細(xì)胞比例與Th17/Treg均顯著高于空白組；模型組Treg細(xì)胞占CD4＋T淋巴細(xì)胞比例較空白組無明顯變化。JAX2組和陽性藥組Treg細(xì)胞數(shù)量高于模型組，JAX2組Th17細(xì)胞數(shù)量與Th17/Treg顯著低于模型組，陽性藥組Th17/Treg明顯低于模型組（見圖3和圖4）。

圖3 小鼠Th17細(xì)胞（A）、Treg細(xì)胞（B）占CD4＋T淋巴細(xì)胞百分比（%）Fig 3 Percentage of Th17（A） and Treg （B）cells in mice CD4＋T lymphocytes（%）

圖4 小鼠Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg的比值變化Fig 4 Changes in the proportion of Th17 and Treg cells and the ratio of Th17/Treg in each group of mice

2.4 Notch/STAT信號通路受體/配體蛋白的表達(dá)

小鼠肺組織染色后觀察各組染色情況。與空白組相比，模型組小鼠肺組織內(nèi)Delta1、Delta4顯著升高，而Notch3、STAT3、P-STAT3及STAT6表達(dá)無顯著差異；與模型組相比，JAX2組小鼠肺組織內(nèi)Delta1表達(dá)升高，Delta4顯著降低，其中JAX2中劑量組治療后，Notch3表達(dá)顯著降低，而STAT3、P-STAT3、STAT6表達(dá)均無明顯變化。上述結(jié)果提示，JAX2對于哮喘小鼠肺組織中STAT信號通路活性的調(diào)控作用弱于Notch通路，因此將進(jìn)一步對Notch通路進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果見圖5和6。

圖5 免疫組化法測定各組受體/配體蛋白的表達(dá)（×200）Fig 5 Receptor/ligand protein expression of each group by immunohistochemistry（×200）

圖6 各組小鼠肺組織受體/配體蛋白表達(dá)的比較Fig 6 Receptor/ligand protein expression in the lung tissue of each group

2.5 JAX2對小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠BALF中IL-4、IL-17水平顯著升高，IFN-γ和IL-10水平顯著下降。與模型組比較，JAX2治療后小鼠BALF中IL-4和IL-17的表達(dá)水平明顯降低，而IFN-γ和IL-10的表達(dá)明顯升高。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠BALF中細(xì)胞因子的水平( ±s，n＝6)Tab 1 Content of cytokines in the BALF of mice ( ±s，n＝6)

表1 各組小鼠BALF中細(xì)胞因子的水平( ±s，n＝6)Tab 1 Content of cytokines in the BALF of mice ( ±s，n＝6)

注：與空白組比較，**P＜0.01，****P＜0.0001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，####P＜0.0001。Note：Compared with the blank group，**P＜0.01，****P ＜0.0001；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，####P＜0.0001.

－1－1－1組別IL-4/（pg·mL）IL-10/（ng·mL）IFN-γ/（pg·mL）IL-17/（pg·mL－1）空白組505.0±21.76 1.561±0.06631.3±21.80426.0±18.69模型組832.2±35.10****0.4719±0.04**445.2±29.07****888.8±41.28****JAX2高劑量組553.4±39.33### 1.239±0.03##613.0±21.96####593.9±35.03####JAX2中劑量組669.6±31.700.9767±0.04#588.8±13.29###633.4±15.65####JAX2低劑量組735.6±18.480.6110±0.02509.9±8.64#684.0±12.36###肺寧片組600.3±9.70##0.8165±0.02598.4±10.49###602.5±16.33####地塞米松組648.6±9.38 1.164±0.05##557.2±17.33###632.0±11.63####

2.6 Delta1、Delta4、Notch3蛋白與T細(xì)胞比例及各比值的相關(guān)性分析

小鼠肺組織內(nèi)Delta1與Th1、Th2、Th17細(xì)胞水平成正相關(guān)，與Treg細(xì)胞水平、Th1/Th2、Th17/Treg不相關(guān)；Delta4與Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞水平、Th1/Th2、Th17/Treg均不相關(guān)；Notch3與Th2、Th17細(xì)胞水平、Th17/Treg成負(fù)相關(guān)，與Treg細(xì)胞水平、Th1/Th2成正相關(guān)，與Th1細(xì)胞水平不相關(guān)。結(jié)果見表2。

表2 Delta1、Delta4、Notch3與T細(xì)胞比例和比值的相關(guān)性分析(r)Tab 2 Correlation analysis of Delta1，Delta4，Notch3 and T cell proportions (r)

3 討論

哮喘是一種由淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等許多細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥性疾病。本課題組前期研究證實(shí)JAX2可能通過抑制炎癥因子產(chǎn)生和炎性介質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)Th1/Th2免疫平衡；能通過抑制小鼠支氣管壁增厚和hASMC的增殖和遷移，防止氣道重塑[15]；還能通過抑制MAPK/NF-κB炎癥信號來預(yù)防哮喘的發(fā)生[16]。因此，鑒于免疫變態(tài)反應(yīng)與氣道炎癥在哮喘中的密切關(guān)系，進(jìn)一步深入研究T細(xì)胞、相關(guān)細(xì)胞因子以及信號通路間的相互作用，分析神香草對哮喘相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平的影響，使得揭示神香草抗哮喘免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制更具完整性。

近年來研究顯示，Notch信號通路在許多疾病的T細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，更與哮喘的免疫失衡關(guān)系密切[17]。研究結(jié)果表明，通過上調(diào)Deltal蛋白的表達(dá)，抑制Jagged1、Notch1和NICD蛋白表達(dá)可緩解豚鼠的哮喘癥狀[18]。Notch能直接調(diào)控GATA-3水平，通過阻斷Notch通路，降低GATA-3的表達(dá)[19]，抑制Th2細(xì)胞反應(yīng)，從而改善哮喘氣道炎癥。實(shí)驗(yàn)證明Notch3在哮喘大鼠氣道上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)，下調(diào)Delta4-Notch信號后，能夠減輕哮喘氣道重塑和氣道高反應(yīng)性[20]。本研究結(jié)果顯示，哮喘小鼠肺組織Delta1、Delta4表達(dá)水平與空白組相比明顯增加，JAX2組治療后，Delta1表達(dá)明顯升高，Delta4明顯降低，Notch3表達(dá)下降，說明三者均參與了哮喘的氣道炎癥反應(yīng)，故推測Notch信號可能影響哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)過程。同時(shí)，Th1/Th2細(xì)胞比值降低是氣道炎癥和高反應(yīng)性形成過程中重要的起始和維持因素[21]，Th17/Treg免疫失衡也在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[22]。本研究結(jié)果顯

示JAX2能明顯提高哮喘小鼠Th1、Treg細(xì)胞水平，升高Th1/Th2比值，且提高哮喘小鼠BALF中IFN-γ和IL-10表達(dá)水平；Th2、Th17細(xì)胞水平及Th17/Treg均低于模型組，且哮喘小鼠BALF中IL-4和IL-17表達(dá)降低。JAX2干預(yù)哮喘小鼠后，Notch3表達(dá)降低與Th17/Treg降低、Th1/Th2增加相關(guān)，Delta1表達(dá)與Th1、Th2、Th17相關(guān)。因此推斷JAX2對哮喘模型中的免疫失衡具有調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能是通過抑制Notch通路中部分受體/配體蛋白的表達(dá)來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

JAK/STAT通路是一條能夠通過生長因子、細(xì)胞因子、干擾素和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白調(diào)節(jié)激活的保守通路，并且參與炎癥過程[23]。有研究提出，JAK/STAT通路可能是哮喘潛在治療方略的一個(gè)重點(diǎn)[24]。本研究結(jié)果表明，JAX2對STAT3、STAT6、P-STAT3蛋白的表達(dá)并無明顯影響，提示JAX2不能通過下調(diào)STAT3、STAT6、P-STAT3蛋白的表達(dá)來改善哮喘免疫炎癥反應(yīng)。

綜上所述，JAX2可通過調(diào)節(jié)Notch配體/受體蛋白表達(dá)改善哮喘免疫失衡的病理狀態(tài)，這可能是其治療哮喘的作用機(jī)制之一。但是，對調(diào)節(jié)該通路具體調(diào)節(jié)的炎癥因子及靶點(diǎn)均不明確，尚需進(jìn)一步深入研究。