莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體霧化吸入劑的制備及體內(nèi)外評(píng)價(jià)

陳博，劉一帥，田葳，葉田田，楊瑞，王淑君*（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 001；. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)，沈陽(yáng) 110016；. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，沈陽(yáng) 11004；4. 江蘇艾迪納米生物醫(yī)藥有限公司，江蘇 南通61；. 南通市海門長(zhǎng)三角藥物高等研究院，江蘇 南通 61）

肺是人體的重要器官，空氣中的灰塵顆粒、有毒物質(zhì)和細(xì)菌等吸入肺部都有可能引起肺部疾病以及全身疾病[1]。肺部疾病包括各種肺炎（細(xì)菌、真菌、病毒性或吸入性肺炎）、肺纖維化、肺癌和哮喘等。靶向藥物遞送到肺部已成為全身或局部藥物遞送系統(tǒng)的重要研究方向之一。莪術(shù)醇（curcumol，Cur）又名姜黃醇，主要來(lái)自于姜科植物莪術(shù)、姜黃等中藥中提取分離的一種倍半萜類化學(xué)成分，為無(wú)色針狀結(jié)晶，易溶于乙醚、氯仿，溶于乙醇，微溶于石油醚，幾乎不溶于水，在水中的溶解度僅為0.3%[2]。莪術(shù)醇是莪術(shù)揮發(fā)油的重要成分之一，具有抗纖維化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等藥理作用，在臨床治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，莪術(shù)醇可使致纖維化因子α-SMA、Smad2/3、TGF-β的mRNA表達(dá)水平降低[5]。莪術(shù)醇可以降低肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1和PAI-1的表達(dá)，降低肺組織中羥脯氨酸的含量，緩解博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[6]。莪術(shù)醇可以通過(guò)抑制JAK1/STAT3信號(hào)通路激活而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。張國(guó)立等[8]通過(guò)將莪術(shù)揮發(fā)油和莪術(shù)醇制備成肺吸入給藥的粉霧劑，將藥物遞送至肺部，不僅對(duì)急性肺損傷具有良好的治療作用，而且提高了藥物的肺組織分布，減少了全身其他組織分布及不良反應(yīng)。

由于莪術(shù)醇幾乎不溶于水，很難達(dá)到口服或注射給藥的要求，極大地限制了其實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體（liposome，LP）主要是由兩親性的磷脂和其他輔料構(gòu)建的雙層囊泡，具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以作為藥物的有效載體。利用脂質(zhì)體包裹莪術(shù)醇可提高其溶解度，增強(qiáng)穩(wěn)定性，同時(shí)具有低毒性、緩釋、改善穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[9]。其中，柔性脂質(zhì)體又稱為可變形脂質(zhì)體，由于其高變性、高柔韌性、高滲透性的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中，但是在霧化吸入給藥方面報(bào)道較少[10]。相比較于靜脈注射，霧化吸入由于使用方便、肺組織濃度較高、全身不良反應(yīng)少等特點(diǎn)而日益受到重視[11]。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜水化法制備了莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體，優(yōu)化了其處方和工藝，并對(duì)該制劑的質(zhì)量以及體外活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，通過(guò)霧化吸入的給藥方式考察了莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的肺部靶向性，以期提高莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的肺部靶向性和肺部疾病的治療效果，為莪術(shù)醇新劑型的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞和動(dòng)物

A549人肺腺癌細(xì)胞（武漢尚恩生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SNL-089），SPF級(jí)KM雄性小鼠12只[遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001]，在沈陽(yáng)藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證編號(hào)：SYXK（遼）2021-0009]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，操作嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理保護(hù)等相關(guān)規(guī)定。

1.2 試藥

莪術(shù)醇（自制[12]，純度＞97%，批號(hào)：20220401），莪術(shù)醇對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥99.9%，批號(hào)：100185-201908），磷鎢酸負(fù)染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20201130），大豆卵磷脂S100（德國(guó)利寶益公司，批號(hào)：903910B），吲哚菁綠（批號(hào)：C14185060），葡聚糖凝膠G50（批號(hào)：C14185058），膽固醇（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C12398354），TGF-β1[派普泰克生物科技（蘇州）有限公司，批號(hào)：0719354]，磷酸鹽緩沖液（含5%海藻糖，pH 7.2，聯(lián)科生物，批號(hào)：A20635），RPMI-1640培養(yǎng)基、1×磷酸鹽緩沖液（Gibco公司），胎牛血清（HyClone公司），無(wú)水乙醇、二氯甲烷為國(guó)產(chǎn)分析純，甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純。

1.3 儀器

2 方法與結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為DB-WAX（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為240℃；檢測(cè)器溫度為250℃；柱流量為1.5 mL·min－1；進(jìn)樣方式為液體直接進(jìn)樣；分流比為5∶1；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?85℃，保持10 min，以20℃·min－1升溫至225℃，保持8 min。

2.1.2 專屬性實(shí)驗(yàn) ① 空白溶劑為甲醇；② 取空白脂質(zhì)體0.2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得空白脂質(zhì)體溶液；③ 精密稱取莪術(shù)醇對(duì)照品20 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得2 mg·mL－1的莪術(shù)醇對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密移取莪術(shù)醇對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，即得0.04 mg·mL－1的莪術(shù)醇對(duì)照品溶液；④ 精密稱取莪術(shù)醇供試品20 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得2 mg·mL－1的莪術(shù)醇供試品儲(chǔ)備液，同莪術(shù)醇對(duì)照品儲(chǔ)備液處理，即得0.04 mg·mL－1的莪術(shù)醇供試品溶液。取空白溶劑、空白脂質(zhì)體、供試品溶液及對(duì)照品溶液各2 μL，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果如圖1所示，莪術(shù)醇對(duì)照品及供試品在該色譜條件下的保留時(shí)間分別為8.919、8.921 min，空白溶劑、空白輔料溶液均不干擾莪術(shù)醇測(cè)定，專屬性良好。

圖1 專屬性色譜圖Fig 1 Specificity chromatogram

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取莪術(shù)醇儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，以莪術(shù)醇的質(zhì)量濃度（C，mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程為：A＝4.769×106C＋1.382×103，r為0.9992。結(jié)果表明，莪術(shù)醇在0.020～0.120 mg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.4 儀器精密度考察 取莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次。取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果莪術(shù)醇的保留時(shí)間RSD值為0.02%，峰面積RSD值為0.48%，儀器精密度符合規(guī)定。

2.1.5 重復(fù)性考察 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，平行6份，進(jìn)樣分析，結(jié)果莪術(shù)醇含量的RSD值為0.52%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 溶液穩(wěn)定性考察 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法配制溶液，對(duì)照品溶液和供試品溶液分別于0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，考察放置穩(wěn)定性。結(jié)果對(duì)照品溶液、供試品溶液峰面積RSD值分別為0.61%、0.59%，說(shuō)明供試品溶液、對(duì)照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法配制溶液，精密稱取莪術(shù)醇對(duì)照品溶液，分別配制成低、中、高（0.02、0.04、0.06 mg·mL－1）3個(gè)質(zhì)量濃度，加入等量莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體，平行配制3份；測(cè)得低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為99.05%、101.89%、102.05%，其RSD分別為0.71%、0.20%、0.15%，結(jié)果表明加樣回收率良好。

準(zhǔn)確稱取樣品10.0 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋10 min，加入3～4 g NaCl（140 ℃，烘烤4 h），渦旋1 min，在5000 r/min下離心5 min；取上清液1.5 mL，加入30 mg PSA和50 mg無(wú)水硫酸鎂，振蕩1 min，10000 r/min下離心5 min；取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

2.1.8 包封率的測(cè)定 采用微柱離心法[13]測(cè)定脂質(zhì)體包封率，取制備好的微型凝膠柱，精密吸取0.2 mL脂質(zhì)體溶液，加于微型凝膠柱的頂端，3000 r·min－1離心3 min，繼續(xù)加入0.2 mL純化水于凝膠柱的頂端，3000 r·min－1離心3 min，用相同體積的純化水分別連續(xù)洗脫，重復(fù)上述操作4次，合并洗脫液，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，取2 μL進(jìn)樣分析，得峰面積A樣，平行測(cè)定3份；另分別精密吸取0.2 mL脂質(zhì)體溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，取2 μL進(jìn)樣分析，得峰面積A對(duì)，平行測(cè)定3份。包封率（%）＝A樣/A對(duì)×100%。

2.2 莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體制備方法篩選

2.2.1 薄膜水化法[14]分別精密稱取處方量莪術(shù)醇、大豆卵磷脂S100和膽固醇于茄形瓶中，加入5 mL無(wú)水乙醇，超聲至固體全部溶解，得到淡黃色澄清透明溶液，待脂質(zhì)膜材料溶解后。將茄形瓶于40℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min，除去乙醇，得干燥的脂質(zhì)沉積物。量取10 mL純化水，于40℃下預(yù)熱，預(yù)熱完全后加入茄形瓶中，水化30 min。將水化后脂質(zhì)體混懸液置于EP管在冰浴中，于400 W探頭超聲15 min（工作3 s，間歇3 s），隨后過(guò)1次0.8 μm微孔濾膜，過(guò)2次0.22 μm微孔濾膜，即得，測(cè)定脂質(zhì)體包封率及粒徑。

2.2.2 逆向蒸發(fā)法[15]分別精密稱取處方量莪術(shù)醇、大豆卵磷脂S100和膽固醇于EP管，加入6 mL二氯甲烷，超聲至固體全部溶解。用注射器將2 mL純化水抽出，將針頭完全插在有機(jī)相液面下方，緩緩打入其中，在冰浴中于400 W探頭超聲5 min（工作3 s，間歇3 s），成白色乳濁液，靜置10 min穩(wěn)定無(wú)明顯分層。45℃減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑約30 min，成凝膠狀。取10 mL純化水40℃下預(yù)熱，預(yù)熱完全后加入茄形瓶中，水化30 min。將水化后脂質(zhì)體混懸液于EP管在冰浴中400 W探頭超聲10 min（工作3 s，間歇3 s），隨后過(guò)1次0.8 μm微孔濾膜，過(guò)2次0.22 μm微孔濾膜，即得，測(cè)定脂質(zhì)體包封率及粒徑。

2.2.3 乙醇注入法[16]分別精密稱取處方量莪術(shù)醇、大豆卵磷脂S100和膽固醇，加入5 mL無(wú)水乙醇，超聲至固體全部溶解。將有機(jī)相通過(guò)注射器緩緩注入處方量純化水中。于45℃水浴磁力攪拌至無(wú)醇味后將脂質(zhì)體混懸液置于EP管，在冰浴中于400 W探頭超聲15 min（工作3 s，間歇3 s），隨后過(guò)1次0.8 μm微孔濾膜，過(guò)2次0.22 μm微孔濾膜，即得，測(cè)定脂質(zhì)體包封率及粒徑。

2.2.4 確定制備方法 根據(jù)包封率選擇合適的脂質(zhì)體制備方法，測(cè)定其包封率、中值粒徑（D50）、跨度（Span），結(jié)果見表1。薄膜水化法制得脂質(zhì)體包封率最高。薄膜水化法可能由于在旋蒸過(guò)程中，在茄形瓶?jī)?nèi)壁上形成一層脂質(zhì)薄膜，使莪術(shù)醇與磷脂有序且均勻地排列在薄膜上，經(jīng)水化后得到包封率較高、均勻、穩(wěn)定的脂質(zhì)體混懸液。因此，最終選用薄膜水化法制備莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體。

表1 不同方法制備的脂質(zhì)體包封率、粒徑Tab 1 Encapsulation rate and particle size of liposomes prepared by different methods

2.3 莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體處方的單因素考察

根據(jù)脂質(zhì)體常用的輔料及種類，以包封率為重點(diǎn)考察指標(biāo)，參照表2條件對(duì)輔料的種類及用量進(jìn)行篩選，對(duì)脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)藥脂比為1∶30（w/w）時(shí)，包封率達(dá)到最大值，當(dāng)磷脂用量過(guò)大時(shí)包封率反而會(huì)下降，穩(wěn)定性降低；當(dāng)無(wú)膽固醇時(shí)包封率高、Span值小，粒徑分布均勻，最終選擇無(wú)膽固醇為進(jìn)一步的優(yōu)化條件；成膜溫度在50℃時(shí)脂質(zhì)體的包封率較高；水化溫度在40℃時(shí)包封率最高，再結(jié)合磷脂的相變溫度，考慮制劑穩(wěn)定性，最終選擇水化溫度40℃為進(jìn)一步的優(yōu)化條件；水化15 min時(shí)包封率最高，且可水化完全，最終選擇水化時(shí)間15 min為進(jìn)一步的優(yōu)化條件；水化轉(zhuǎn)速為1204～1212 r·min－1時(shí)包封率最高，且可水化完全，最終選擇水化轉(zhuǎn)速為1204～1212 r·min－1為進(jìn)一步的優(yōu)化條件。

表2 單因素考察(n＝3)Tab 2 Single factor examination (n＝3)

2.4 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體處方

在單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇藥脂比（A）、膜材比（B）、旋蒸溫度（C）3個(gè)影響因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，以包封率為主要考察指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。選用L9（33）正交表，分別制得莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體，測(cè)定其包封率，結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Tab 3 Factor and level

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Orthogonal test

表5 方差分析Tab 5 Analysis of variance

重要程度依次為藥脂比（A）＞膜材比（B）＞旋蒸溫度（C），最終確定最佳處方為A2B2C2，即藥脂比為1∶30，不加膽固醇，旋蒸溫度為50℃。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按最優(yōu)處方制備3批莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體，測(cè)定其包封率和粒徑，結(jié)果見表6，脂質(zhì)體的平均包封率為83.92%，平均粒徑為0.116 μm。

表6 3批脂質(zhì)體的包封率和粒徑Tab 6 Encapsulation rate and particle size of the 3 batches of liposomes

2.6 透射電子顯微鏡觀察

取稀釋后的莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體10 μL滴在銅網(wǎng)上，靜置10 min后用毛邊濾紙吸去多余的水分，向銅網(wǎng)表面滴加2%磷鎢酸溶液，負(fù)染3 min，烘干后將樣品放置在透射電鏡下觀察并拍攝電鏡照片，可觀察到脂質(zhì)體外觀呈圓整球形，粒徑在100～200 nm，如圖2所示。

圖2 莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的透射電鏡圖Fig 2 Transmission electron micrograph of curcumol liposomes

2.7 體外釋放的測(cè)定

精密量取莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體以及莪術(shù)醇溶液2 mL，加入透析袋中，兩端夾緊后置于含40%乙醇（V/V）的磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，30 mL）中，每個(gè)樣品平行3份，避光，37℃恒溫振蕩。分別于1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h吸取2 mL透析液，并補(bǔ)加等體積磷酸鹽緩沖液[17-18]。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其含量，并計(jì)算藥物的累積釋放百分率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的體外釋放曲線Fig 3 In vitro release curves of curcumol liposomes

2.8 莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞增殖的影響

目前，對(duì)于細(xì)胞增殖監(jiān)測(cè)的方法采用的是傳統(tǒng)的終點(diǎn)法，即僅僅給出某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果，而在監(jiān)測(cè)的時(shí)候需要破壞細(xì)胞，這種方法無(wú)法獲得細(xì)胞真正的生長(zhǎng)狀態(tài)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程無(wú)法做出動(dòng)態(tài)檢測(cè)和分析。為了更好地觀察和統(tǒng)計(jì)莪術(shù)醇對(duì)A549細(xì)胞的影響，本實(shí)驗(yàn)采用了能夠非傷害的、長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞的功能分析系統(tǒng)（IncuCyte）來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況。

2.8.1 莪術(shù)醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將復(fù)蘇的A549細(xì)胞接種到F-12培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。傳代2～3次，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以5000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，每孔再加入10 μL質(zhì)量濃度為10 ng·mL－1的TGF-β1進(jìn)行造模。再將96孔板置于IncuCyte中，對(duì)每孔持續(xù)拍照24 h。觀察各組細(xì)胞形態(tài)，如圖4所示，對(duì)照組A549細(xì)胞呈鵝卵石樣，細(xì)胞大小均勻，沒有突觸、多角，貼壁狀態(tài)良好。經(jīng)TGF-β1刺激后，A549細(xì)胞呈現(xiàn)梭狀，細(xì)胞圓形度明顯降低，與成纖維細(xì)胞相似，說(shuō)明造模成功。棄去板中液體，再加入不同質(zhì)量濃度的莪術(shù)醇（80、53、35、23、15、10、7、4、3 μg·mL－1）至96孔板中，以0.1% DMSO作為對(duì)照組處理細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入IncuCyte中，每孔持續(xù)拍照48 h，結(jié)果莪術(shù)醇呈濃度依賴性抑制細(xì)胞增殖（見圖5），選取合適濃度的莪術(shù)醇進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 A549細(xì)胞（A）和TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞（B）Fig 4 A549 cells（A）and TGF-β1-induced A549 cells（B）

圖5 不同濃度莪術(shù)醇對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活性的影響Fig 5 Effect of different concentrations of curcumol on the viability of TGF-β1-induced A549 cells

2.8.2 莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將空白脂質(zhì)體、莪術(shù)醇、莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體加至96孔板中（設(shè)置空白組、對(duì)照組），每組5個(gè)復(fù)孔，測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)趨勢(shì)的影響，用Confluence（%）表示細(xì)胞增殖的匯合度。將板放入IncuCyte中，96孔板每孔持續(xù)拍照48 h，結(jié)果如圖6所示，空白脂質(zhì)體48 h時(shí)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)細(xì)胞的存活率大于90%，表明空白脂質(zhì)體無(wú)明顯毒性作用。莪術(shù)醇組和莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體組對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞均具有濃度和時(shí)間依賴性的抑制作用，且莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體組效果優(yōu)于莪術(shù)醇組。在48 h時(shí)，莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的半數(shù)抑制濃度（IC50）為9.11 μg·mL－1，優(yōu)于游離莪術(shù)醇的12.23 μg·mL－1。

圖6 莪術(shù)醇與莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活性的影響Fig 6 Effect of curcumol and curcumol liposomes on the viability of TGF-β1-induced A549 cells

2.9 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

本研究通過(guò)包裹吲哚菁綠光敏劑進(jìn)行動(dòng)物活體成像，將12只健康KM小鼠（提前剃去腹部鼠毛）隨機(jī)分為空白對(duì)照組、霧化吸入莪術(shù)醇溶液組、霧化吸入莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體組、靜脈注射莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體組，每組3只。霧化吸入藥物質(zhì)量濃度為1 mg·mL－1的莪術(shù)醇溶液和莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體5 min，靜脈注射莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體（5 mg·kg－1單次給藥）。在給藥后0 min、5 min、30 min、1 h、3 h、6 h、8 h、12 h、24 h分別測(cè)定小鼠體內(nèi)熒光強(qiáng)弱。結(jié)果如圖7所示，莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體組霧化吸入肺部滯留時(shí)間及滯留量?jī)?yōu)于霧化吸入莪術(shù)醇溶液組和靜脈注射莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體組。24 h后脫頸處死小鼠，取出主要器官（包括心、肝、脾、肺、腎），生理鹽水沖洗后置于血管成像儀中觀察各組織熒光情況并拍照。結(jié)果如圖8所示，霧化吸入莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體組只分布于肺部，霧化吸入莪術(shù)醇溶液在肝部及肺部均有分布，靜脈注射莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體主要分布于肝組織。

圖7 莪術(shù)醇在小鼠體內(nèi)的分布Fig 7 In vivo distribution of curcumol in mice

圖8 莪術(shù)醇在小鼠組織的分布Fig 8 Tissue distribution of curcumol in mice

3 討論

莪術(shù)醇為脂溶性藥物，難溶于水，屬于倍半萜類化合物，且分子中具有共軛雙鍵，因此化學(xué)性質(zhì)比較活潑，使其臨床應(yīng)用具有一定的困難。本研究通過(guò)將莪術(shù)醇包封于脂質(zhì)體中，不僅改善了其脂溶性問(wèn)題，而且提高了其穩(wěn)定性。

本研究采用薄膜水化法制備了莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體，薄膜水化法是一種經(jīng)典的制備方法，可以制備得到多室脂質(zhì)體，經(jīng)過(guò)超聲處理得到小單室脂質(zhì)體。該法所制的莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體粒徑分布均勻，方法簡(jiǎn)單，工藝可行。通過(guò)單因素考察和正交實(shí)驗(yàn)確定了莪術(shù)醇的最優(yōu)處方和制備工藝。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體相比較游離莪術(shù)醇具有更好的緩釋作用。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的抑制作用優(yōu)于游離的莪術(shù)醇，推測(cè)其可能與脂質(zhì)體提高莪術(shù)醇的溶解度和增加莪術(shù)醇在細(xì)胞內(nèi)的滯留時(shí)間相關(guān)。通過(guò)霧化吸入的給藥方式可以極大地提高莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的肺部靶向性，使得藥物能夠更好地到達(dá)疾病部位，減少在其他器官中的蓄積，提高藥物的有效性。

綜上所述，本研究制備的霧化吸入莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體安全可靠，經(jīng)霧化吸入后在肺部緩慢釋放，起到緩釋作用，且在具有肺部靶向功能的同時(shí)減少了在其他健康組織的蓄積，可減輕不良反應(yīng)，增加治療效果。而本實(shí)驗(yàn)僅在細(xì)胞水平初步驗(yàn)證了莪術(shù)醇抗纖維化活性及其在體內(nèi)的肺部靶向性，未進(jìn)行莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的抗肺纖維化藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)本課題組將繼續(xù)考察莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體的體內(nèi)外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)等，為進(jìn)一步研究莪術(shù)醇柔性脂質(zhì)體抗纖維化活性奠定基礎(chǔ)。