微流控芯片技術(shù)檢測蝦肝腸胞蟲及其在浙江省對蝦流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用

孫福英 白斐 祝波 盧先東 錢冬

摘 要 南美白對蝦是浙江省養(yǎng)殖的主要蝦類，蝦肝腸胞蟲感染（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）是南美白對蝦養(yǎng)殖中危害最大的疾病，引起嚴(yán)重的生長遲緩，造成極大的損失。蝦肝腸胞蟲個體微小，給顯微鏡檢測造成較大的困難，因此嘗試建立快速、靈敏的定量檢測微流控芯片檢測技術(shù)。結(jié)果表明，所建立的微流控芯片檢測方法特異性良好，重復(fù)性良好，擴增結(jié)果穩(wěn)定可靠，最低檢出限為3.23×100 copies·μL-1。將該檢測技術(shù)應(yīng)用于浙江省對蝦流行病學(xué)特點分析中，發(fā)現(xiàn)三門縣和舟山市對蝦腸胞蟲感染率比較高，除嘉興市未出現(xiàn)對蝦通用型傳染皮下及造血組織壞死病毒感染，其他地方均有感染。試驗證明，微流控芯片快速檢測技術(shù)有望應(yīng)用于對蝦規(guī)模化養(yǎng)殖中蝦肝腸胞蟲感染的快速檢測。

關(guān)鍵詞 微流控芯片技術(shù)；蝦肝腸胞蟲；流行病學(xué)；浙江省

中圖分類號：S945.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.06.063

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）

屬于真菌界（Fungi）微孢子蟲門（Microsporidia）單倍期綱（Haplophasea）壺孢目（Chytridiopsida）腸胞蟲科（Enterocytozoonidae）腸胞蟲屬（Enterocytozoon），是一種可感染多種真核生物的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲[1-3]。EHP主要感染對蝦的肝胰腺，感染較嚴(yán)重時也感染中腸、血淋巴、腮和肌肉等組織[4]。對蝦感染EHP后，可與急性肝胰腺壞死弧菌共感染，死亡率可明顯上升，兩者具有累加效應(yīng)[5]。

EHP個體微小，給顯微鏡檢測造成較大困難，EHP傳播迅速，危害大，需要快速、靈敏的檢測技術(shù)。常規(guī)的PCR檢測耗時較長，熒光定量PCR靈敏度高，但上述檢測技術(shù)均需要在實驗室完成。微流控芯片技術(shù)也叫芯片實驗室（lab on a chip，LOC），是一種以在微米尺度空間完成對化學(xué)或生物樣品的常規(guī)化學(xué)和生物實驗室功能為主要特征的技術(shù)平臺[6]。其把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。

為建立快速、便捷、定量檢測EHP的方法，方便養(yǎng)殖場現(xiàn)場對EHP的流行規(guī)律進(jìn)行定量評估，本文嘗試建立EHP定量檢測的微流控芯片檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

微流控?zé)晒鈾z測儀，寧波愛基因科技有限公司；熒光定量PCR，瑞士Roche公司；PCR儀，德國Analitik Jena AG公司；NanoDrop微量UV-Vis分光光度計，美國Thermo Fisher公司。

熒光等溫擴增液，寧波愛基因科技有限公司；通用SYBR qPCR預(yù)混液，南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，美國Omege公司；pMD19-T Vecto專用載體，日本TaKaRa公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計和篩選

腸胞蟲采用GenBank公布片段，選擇高度保守基因序列片段，PrimerExplorV5 在線軟件設(shè)計引物。一共設(shè)計4條引物，每條引物中均包含上/下游外引物F3/B3、上/下游內(nèi)引物FIP/BIP，具體設(shè)計情況見表1。引物由杭州有康生物公司合成，通過加熱干燥的方式將預(yù)篩選引物包埋于反應(yīng)室中，篩選出最佳反應(yīng)引物。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的合成

取提取的腸胞蟲基因片段的克隆采用高保真酶Pfu預(yù)混液，進(jìn)行EHP目的基因擴增，將獲得的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化，與pMD19-T載體連接，后轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆重組質(zhì)粒，送生物科技有限公司測序鑒定，對于鑒定正確的重組質(zhì)粒，名為pMD-EHP，對陽性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定，拷貝數(shù)計算，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 微流控芯片檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

樣本充分均質(zhì)，試劑于室溫下解凍，充分混勻并短暫離心后使用。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

微流控芯片檢測儀恒溫擴增時，儀器會自動實時檢測熒光，形成熒光檢測擴增曲線。微流控芯片按閾值時間（Ct）判定樣品：1）陽性——反應(yīng)孔出現(xiàn)Ct＜60，有明顯的S型擴增曲線；2）陰性——反應(yīng)孔出現(xiàn)

Ct＞60，無擴增曲線。

選擇腸胞蟲（EHP）、對蝦通用型傳染皮下壞死（IHHNV-U）、虹彩病毒（DIV1）、弧菌（Vibrio）陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒加入樣本內(nèi)標(biāo)孔，按照儀器操作說明書運行程序，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 微流控靈敏度測試

選擇無菌水作為陰性對照，用S01-03-06-18蝦病四聯(lián)（EHP、IHHNV-U、DIV1、Vibrio）微流控芯片快速檢測試劑盒QT進(jìn)行定標(biāo)，根據(jù)優(yōu)化條件和構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定擴增腸胞蟲陽性核酸的最低檢出限。

1.2.5 微流控反應(yīng)特異性與穩(wěn)定性測試

特異性實驗是為了檢查該方法與其他水生動物病原之間是否存在交叉反應(yīng)，分別以腸胞蟲、急性肝胰腺壞死、對蝦通用型傳染、對蝦感染型傳染、對蝦白斑綜合癥、十足目虹彩病毒和羅氏沼蝦諾病毒的DNA為模板，使用優(yōu)化條件檢測其特異性。

使用稀釋至104 copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒在1次實驗中重復(fù)16次，通過分析檢測閾值時間（Ct）評價該方法的重復(fù)性。

1.2.6 實際樣品檢測

2020—2022年，分別在浙江省臺州市、舟山市、嘉興市、寧波市、杭州市采樣，對調(diào)查采集的腸胞蟲患病對蝦、其他疑似發(fā)患病蝦、藥物治療后的蝦共37批，用微流控芯片進(jìn)行腸胞蟲進(jìn)行檢測，統(tǒng)計腸胞蟲陽性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 微流控引物篩選結(jié)果

篩選和比較腸胞蟲微流控檢測的多套引物的Ct值，如圖1所示。結(jié)果表明，引物1擴增反應(yīng)時間比較長，Ct值在22 min左右；引物2反應(yīng)時間短，Ct值在12 min

左右，具有明顯的擴增曲線，但曲線比較分散；引物3無擴增峰；引物4反應(yīng)時間短，Ct值在11 min左右，具有明顯的擴增曲線，且曲線比較集中。因此引物4為最佳引物，后續(xù)實驗均采用引物4。

2.2 EHP微流控芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

用S01-03-06-18蝦病四聯(lián)（EHP、IHHNV-U、DIV1、Vibrio）微流控芯片快速檢測試劑盒QT進(jìn)行定標(biāo)，4種病原標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。微流控芯片最低檢出限為3.23×100 copies·μL-1。

2.3 微流控特異性與重復(fù)性結(jié)果

特異性實驗結(jié)果（圖3）顯示，除EHP為模板的陽性樣品熒光定量出現(xiàn)擴增峰外，其他模板樣品均無擴增曲線出現(xiàn)，說明微流控芯片檢測方法的特異性良好。重復(fù)性結(jié)果見圖4，取104 copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒在重復(fù)檢測16次，Ct值15.40±0.12 min，變異系數(shù)0.78，陽性質(zhì)粒均出現(xiàn)了典型S型擴增，陰性對照均未出現(xiàn)擴增，表明建立的EHP微流控芯片方法有良好的重復(fù)性，擴增結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.4 微流控技術(shù)在蝦肝腸胞蟲流行病學(xué)研究中的應(yīng)用

如表2所示，2020—2022年共采集檢測樣品37批次，感染20批次，腸胞蟲的感染率為54.05%。其中，2020年共調(diào)查11批次，感染6批次，檢出率54.55%；2021年共調(diào)查12次，感染9批次，感染率為75.00%；2022年共調(diào)查14批次，感染5批次，感染率為35.71%。

對所采集的37批樣本進(jìn)行分區(qū)域病原檢測，結(jié)果如表3所示，腸胞蟲的染率達(dá)54.05%，對蝦通用型傳染皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV-U）檢出率32.43%，弧菌（Vibrio）檢出率為45.95%。三門縣和舟山市的腸胞蟲感染率比較高，其次是寧波市、杭州市。除嘉興市未出現(xiàn)IHHNV-U感染，其他地方均有感染。

3 結(jié)論與討論

EHP孢子大小僅為0.7 μm×1.1 μm，感染無明確易判斷的臨床癥狀，很難觀察。雷燕等根據(jù)GenBank中對蝦腸道上皮細(xì)胞的EHP基因保守序列，設(shè)計特異性引物，優(yōu)化PCR擴增條件，建立了EHP的PCR檢測方法[7]。Tangprasittipap等利用套式PCR檢測方法，開展了EHP診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查[8]。然而PCR具有模板質(zhì)量和引物設(shè)計要求較高、需擴展特定DNA、操作復(fù)雜等缺點。劉丹等應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）同時檢測副溶血弧菌與金黃色葡萄球菌[9]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)具有檢測時間短、靈敏性高和檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢，但由于其預(yù)處理時間長，且需要專業(yè)的檢測人員操作，不易在現(xiàn)場及基層推廣[10]。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為，理想的診斷檢測技術(shù)應(yīng)具有敏感性高、特異性強、使用成本低、操作簡單快捷、可用于任何環(huán)境條件下同時容易獲得操作儀器等特點[11]。微流控芯片可以設(shè)計多條微通道，且微通道之間結(jié)構(gòu)封閉，同一個微流控芯片可以對同一樣本同時進(jìn)行不同項目的檢測，有效避免交叉污染，縮短了檢測時間，提高了檢測效率[12]。微流控芯片的微型化提高了傳熱效率，節(jié)約了試劑成本和樣本，且不需要大量的實驗設(shè)備，因此大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)集成的微流體芯片大大降低了生產(chǎn)成本[13]。

對天津市2015年和2016年蝦肝腸胞蟲的流行情況調(diào)查表明，EHP的檢出率分別為56.96%、69.52%[14]。2019年，江蘇省溫室養(yǎng)殖蝦類中EHP患病率為56.3%，土塘養(yǎng)殖蝦類中EHP患病率為79.5%[15]。本實驗室在2020—2022年共采集檢測樣品37批次，腸胞蟲的感染率為54.05%。數(shù)據(jù)顯示，EHP引發(fā)的感染病已嚴(yán)重威脅我國蝦類的健康養(yǎng)殖。此外，本文針對浙江省不同地區(qū)對蝦流行病學(xué)特點的分析發(fā)現(xiàn)，三門縣和舟山市的腸胞蟲感染率比較高，除嘉興市未出現(xiàn)對蝦通用型傳染皮下及造血組織壞死病毒感染，其他地方均有感染。

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（責(zé)任編輯：劉寧寧）