HPLC雙波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定仙桃草中木犀草素、芹菜素、金圣草素的含量

周倩倩 沈振 王兆昆 張加余 汪冰 林永強(qiáng)

【摘 要】 目的：測(cè)定仙桃草中木犀草素、芹菜素、金圣草素等3種黃酮類成分的含量。方法：以甲醇提取制備分析樣品，采用納譜ChromeCore C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（23：77）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm（木犀草素、金圣草素）和337 nm（芹菜素），柱溫35 ℃。結(jié)果：木犀草素、芹菜素、金圣草素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9996），平均加樣回收率分別為97.79%、98.77%、97.28%，RSD分別為0.94%、0.91%、0.77%。13批樣品的木犀草素含量在0.0391～0.7979 mg/g之間，平均值為0.5503 mg/g；芹菜素含量在0.0556～0.2655 mg/g，平均值為0.1938 mg/g；金圣草素含量在0.0575～0.2484 mg/g，平均值為0.1711 mg/g。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，可用于仙桃草質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 仙桃草；HPLC雙波長(zhǎng)切換；木犀草素；芹菜素；金圣草素

【中圖分類號(hào)】R284.1? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? ? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）08-0045-05

Abstract：Objective To determine the Luteolin，Apigenin and Chrysoeriol from Veronica peregrina L.by HPLC.Methods Samples for analysis were prepared by methanol，the analysis was performed on a 35℃ themostatic Nano ChromeCore C18 column（250 mmx4.6 mm， 5 μm）， with the mobile phase comprising of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （23∶77） flowing at 1.0 mL/min， and the detection wavelength were set at 350 nm for Luteolin and Chrysoeriol and 337 nm for Apigenin.Results Luteolin，Apigenin and Chrysoeriol show good linear relationships within their own ranges（r≥0.9996）， whose average recoveries were 97.79%， 98.77% and 97.28%， with the RSDs of 0.94%， 0.91% and 0.77%， respectively. The contents of the Luteolin， Apigenin and Chrysoeriol of the 13 samples were varied between 0.0391-0.7979 mg/g， 0.0556-0.2655 mg/g and 0.0575-0.2484 mg/g，with the averages of 0.5503 mg/g， 0.1938 mg/g and 0.1711 mg/g， respectively.Conclusion This accurate， reliable and reproducible method can be used for the quality control of Purslane Speedwell.

Key words：Purslane Speedwell; HPLC dual-wavelength method; Luteolin; Apigenin; Chrysoeriol

仙桃草為玄參科植物蚊母草Veronica peregrina L.帶蟲癭的干燥全草。蟲癭內(nèi)的小蟲為象蟲科昆蟲仙桃草直喙象Gymnetron miyoshii Miyoshi。用于吐血、咯血、齟血、便血、跌打損傷，具有活血消腫、止血、止痛的作用［1］。金繼曙等［2］從仙桃草中分離出原兒茶酸、香草酸、木犀草素、金圣草素、甘露醇等5種化學(xué)成分。課題組研究發(fā)現(xiàn)仙桃草中含有芹菜素，并通過(guò)對(duì)照品定位、紫外吸收掃描、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行了確認(rèn)。目前，仙桃草相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，質(zhì)量控制相對(duì)薄弱，劉華本等［3］、宋光偉等［4］分別對(duì)仙桃草中原兒茶酸、木犀草素的含量進(jìn)行了測(cè)定，但金圣草素、芹菜素的測(cè)定尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。木犀草素具有較好的促凝血作用［5］，芹菜素對(duì)腫瘤、衰老及心血管疾病有預(yù)防和控制作用［6］，金圣草素具有抗菌消炎的作用［7］。為有效控制仙桃草質(zhì)量，研究建立木犀草素、芹菜素、金圣草素等3種黃酮類化合物的HPLC含量測(cè)定方法，為克服在同一波長(zhǎng)下某些成分響應(yīng)較低的缺點(diǎn)，提高各成分響應(yīng)程度，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，需保證各成分在最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)，由于三種待測(cè)成分的最大紫外吸收波長(zhǎng)存在差異，因此本研究采用波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定3種成分的含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，為完善和提高仙桃草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津

LC-2030C 3D Plus

液相色譜儀，Mettler Toledo XSE205電子天平，納譜ChromeCore C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。

1.2 材料 木犀草素對(duì)照品（批號(hào)：111520-200504，含量100.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），芹菜素對(duì)照品（批號(hào)：111901-202004，含量99.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），金圣草素對(duì)照品（批號(hào)：0209-RD-0032，含量90.8%，廣州佳途科技股份有限公司）。乙腈為色譜純，甲醇、磷酸分別為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。仙桃草藥材購(gòu)自市場(chǎng)，編號(hào)為S1～S13，共計(jì)13批，其中6批購(gòu)自亳州市云興中藥科技有限公司，7批購(gòu)自河北弘森藥業(yè)有限公司，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院林鶯副教授鑒定為玄參科植物蚊母草（Veronica peregrina L.）帶蟲癭的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 芹菜素的確認(rèn) 從初期研究發(fā)現(xiàn)該色譜峰與芹菜素對(duì)照品保留時(shí)間及最大紫外吸收均一致，初步判定為芹菜素。由于芹菜素具有較強(qiáng)的酸性，易失去氫質(zhì)子形成負(fù)離子被檢測(cè)，靈敏度更高［6］。因此，為進(jìn)一步驗(yàn)證該色譜峰為芹菜素，選用HPLC-MS法進(jìn)行確認(rèn)。采用三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器，電噴霧離子化（ESI）負(fù)離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z 268.99→117.05、m/z 268.99→107.05、m/z 268.99→151.05，以甲醇為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～10 min，A：60%→40%，B：40%→60%，流速為每分鐘0.3 mL。結(jié)果如圖1、圖2所示。

從圖中可以看出，芹菜素對(duì)照品和供試品色譜總離子流（TIC）完全一致，以質(zhì)荷比（m/z）268.99→117.05、m/z 268.99→107.05和m/z 268.99→151.05離子對(duì)提取的供試品離子流色譜中，同時(shí)呈現(xiàn)與芹菜素對(duì)照品色譜保留時(shí)間一致的色譜峰。因此可以判定，該色譜峰為芹菜素。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取木犀草素、芹菜素、金圣草素對(duì)照品，分別加甲醇制成濃度為40 μg/mL的對(duì)照品溶液，以甲醇為空白，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400 nm對(duì)3個(gè)成分進(jìn)行光譜掃描，確定木犀草素的最大吸收波長(zhǎng)為350 nm和254 nm，芹菜素的最大吸收波長(zhǎng)為337 nm和267 nm，金圣草素的最大吸收波長(zhǎng)為348 nm和268 nm。從紫外吸收譜圖看，最大吸收波長(zhǎng)±2 nm時(shí)吸光度差異不大，因此，確定木犀草素、金圣草素的測(cè)定波長(zhǎng)為350 nm，芹菜素測(cè)定波長(zhǎng)為337 nm。譜圖如圖3所示。

2.3 色譜條件 納譜ChromeCore C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（23：77）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)木犀草素、金圣草素為350 nm，芹菜素為337 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取木犀草素對(duì)照品18.37 mg、芹菜素對(duì)照品18.91 mg、金圣草素對(duì)照品16.86 mg，分別置25 mL、50 mL、50 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，定容至刻度，搖勻；分別精密量取上述3種對(duì)照品溶液各1 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 供試品溶液的制備 取本品適量，粉碎使其通過(guò)三號(hào)篩，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，定容?0 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.6 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液及供試品溶液，按“2.3色譜條件”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。結(jié)果，待測(cè)組分色譜峰形較好，與其他組分分離度良好，理論板數(shù)以木犀草素計(jì)為23525，分離度分別為22.760、6.331、1.712。色譜圖如圖4、圖5所示。

2.7 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，分別以木犀草素、芹菜素、金圣草素對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。木犀草素線性回歸方程為Y=4100066X+16538，相關(guān)系數(shù)r=1.0000；芹菜素線性回歸方程為Y=4046730X+23355，相關(guān)系數(shù)r=0.9996；金圣草素線性回歸方程為Y=3298116X+15860，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。結(jié)果表明，木犀草素、芹菜素、金圣草素進(jìn)樣量分別在0.147～2.940 μg、0.0376～0.752 μg、0.0429～0.858 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.8 儀器精密度考察 取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值，結(jié)果木犀草素、芹菜素、金圣草素峰面積積分值相對(duì)平均偏差（RSD）分別為0.56%、0.75%、0.66%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品適量，粉碎使其通過(guò)三號(hào)篩，取約2 g，照“2.5供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法，平行制備供試品溶液6份，注入液相色譜儀，計(jì)算供試品中木犀草素、芹菜素、金圣草素的含量。結(jié)果木犀草素含量平均值為0.6348 mg/g，RSD為0.37%；芹菜素含量平均值為0.2336 mg/g，RSD為0.74%；金圣草素含量平均值為0.2000 mg/g，RSD為0.63%。結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品適量，粉碎使其通過(guò)三號(hào)篩，取約2 g，照“2.5供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算RSD值，結(jié)果木犀草素為1.09%、芹菜素為0.78%、金圣草素為0.82%。結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的仙桃草樣品，精密稱取6份，每份取約1 g，分別加入木犀草素、芹菜素、金圣草素對(duì)照品溶液適量，再加入甲醇使其總體積為50 mL，稱定重量，自“加熱回流2 h”起，照“2.5供試品溶液的制備”方法同法制成回收率試驗(yàn)用供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，仙桃草種木犀草素、芹菜素、金圣草素的平均回收率分別為97.79%、98.77%、97.28%，RSD值分別為0.94%、0.91%、0.77%，回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.12 樣品含量測(cè)定 采用已建立的方法對(duì)收集的13批仙桃草樣品進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算其中木犀草素、芹菜素和金圣草素的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果13批仙桃草樣品的木犀草素含量在0.0391～0.7979 mg/g之間，平均值為0.5503 mg/g；芹菜素含量在0.0556～0.2655 mg/g，平均值為0.1938 mg/g；金圣草素含量在0.0575～0.2484 mg/g，平均值為0.1711 mg/g。13批樣品中有1批樣品的3個(gè)待測(cè)成分含量均遠(yuǎn)低于其他批次，提示藥材市場(chǎng)上流通的不同批次仙桃草的化學(xué)成分含量存在較大差異，可能與不同產(chǎn)地的氣候、環(huán)境、土壤等因素有關(guān)。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 本研究比較了甲醇、乙腈與水、0.1%磷酸溶液、0.1%冰醋酸溶液不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)分離效果最佳，通過(guò)系統(tǒng)耐用性試驗(yàn)考察最終確定流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）。

3.2 色譜柱及儀器耐用性考察 本研究分別比較了Sepax HP-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）、納譜ChromeCore C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）和依利特 Hypersil BDS C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）對(duì)仙桃草藥材種3中待測(cè)成分的分離效果，結(jié)果3種色譜柱均能對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行有效分離。同時(shí)考察了島津LC-2030C 3D Plus和沃特世2695兩種液相色譜儀的分離情況，結(jié)果均能呈現(xiàn)良好的分離效果。

3.3 提取溶劑和方法的選擇 本研究考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇6種提取溶劑，超聲、回流2種提取方式，0.5 h、1 h、1.5 h、2 h等4種提取時(shí)間，料液比 1∶10、1∶20、1∶25、1∶50 4種料液比，結(jié)果顯示以甲醇作為溶劑，回流提取1 h效果最佳，為保證樣品的取樣均勻性又能節(jié)約資源，確定樣品取樣量為2.0 g，提取溶劑為50 mL。

綜上，黃酮類化合物是中藥材中重要的生物活性物質(zhì)，仙桃草所含黃酮類化合物可作為評(píng)價(jià)其質(zhì)量的指標(biāo)成分。本研究采用HPLC雙波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定仙桃草中木犀草素、芹菜素和金圣草素3種黃酮類成分的含量，確認(rèn)了仙桃草中芹菜素的存在，可為仙桃草質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1977：164-165.

［2］金繼曙，于在東，種明才. 仙桃草化學(xué)成分的分離［J］.中草藥，1982，13（4）：10.

［3］劉華本，李曉維，潘旖，等. HPLC法測(cè)定仙桃草中原兒茶酸的含量［J］. 中國(guó)醫(yī)藥指南，2015，13（22）：54.

［4］宋光偉，刑茂，王偉，等. HPLC 法測(cè)定仙桃草中木犀草素的含量［J］. 中國(guó)藥房，2009，20（15）：1166.

［5］都述虎，金繼曙. 仙桃草主要化學(xué)成分體外促凝血作用［J］.中草藥，1996， 27（7）：416.

［6］丁健樺，王興祥，張慧，等. 芹菜素的點(diǎn)噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜［J］. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（8）：1714.

［7］何新. 金圣草黃素在制備治療陰道炎的藥物的應(yīng)用：CN111840273A［P］.2020-10-30.

（收稿日期：2022-08-23 編輯：劉 斌）