臨床孤立綜合征轉(zhuǎn)歸多發(fā)性硬化的生物標志物分析

梁葉源 張瀅 丘小慧 唐玉蘭 梁軍利

臨床孤立綜合征(CIS)指單次發(fā)作的急性或亞急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病,持續(xù)時間超過24 h[1]。多數(shù)CIS患者可出現(xiàn)復發(fā),常轉(zhuǎn)歸為多發(fā)性硬化(MS),少部分患者轉(zhuǎn)歸為視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(NMOSD)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病[2]。基于CIS和MS治療策略和預后的差異,從MS發(fā)病機制角度探索CIS的轉(zhuǎn)歸特點,可能為MS的診斷、預后以及早期干預措施提供依據(jù)。近期研究發(fā)現(xiàn),維生素D通過抑制記憶T細胞分化為促炎輔助T細胞1(Th1)和Th17淋巴細胞,減少白細胞介素17A(IL-17A)、IL-23、IL-21、IL-22等因子分泌[1],從而抑制MS等疾病的炎癥反應[3]。血清維生素D及其受體(VDR)水平的降低與MS的發(fā)病相關[4]。本研究通過分析CIS患者轉(zhuǎn)歸MS前后血清維生素D〔25(OH)D2和25(OH)D3〕、VDR水平及血清和腦脊液(CSF)Th17細胞因子水平的變化,旨在探討其在MS病情演變評估及CIS轉(zhuǎn)歸中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象納入2018年1月至2020年11月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院及廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的CIS患者74例,其中女54例,男20例,平均年齡(31.64±8.42)歲。納入標準:(1)符合2017年McDonald診斷標準[5];(2)年齡18～60歲;(3)首次發(fā)病急性期(癥狀開始1周內(nèi));(4)發(fā)病前1個月內(nèi)無免疫治療(包括靜脈/口服激素、免疫抑制劑、丙種球蛋白、血漿置換等);(5)水通道蛋白4(AQP4)抗體和抗髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白免疫球蛋白G(MOG)抗體陰性。排除標準:(1)發(fā)病前2個月內(nèi)補充維生素D;(2)素食者;(3)合并顱內(nèi)外感染急性期患者;(4)妊娠期及哺乳期婦女;(5)合并其他免疫相關疾病、腫瘤患者。另選取長期居住在南寧及周邊的神經(jīng)系統(tǒng)非炎性疾病(non-inflammatory neurological disease,NIND)住院患者30例(包括緊張型頭痛9例,周期性癱瘓21例)作為對照組,其中女19例,男11例,平均年齡(31.17±5.78)歲。對照組排除標準同病例組。兩組間性別構(gòu)成、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義。本研究通過廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過(2019-KY-0004),且入組對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1一般資料收集:記錄患者性別、年齡、擴展殘疾狀況量表評分(expanded disability status scale,EDSS)、影像學資料、血及CSF炎癥因子、血清維生素D及VDR水平、治療及隨訪轉(zhuǎn)歸等資料。比較CIS組和NIND組、CIS轉(zhuǎn)歸MS組和未轉(zhuǎn)歸MS組、轉(zhuǎn)歸MS患者轉(zhuǎn)歸前后間細胞因子、維生素D水平等差異,并進一步分析維生素D、VDR、EDSS評分與Th17細胞相關因子的相關性。

1.2.2血及CSF采集:CIS患者于入院第2天(均為急性期未經(jīng)免疫治療時)、NIND患者于入院時禁食8 h后于5:00～6:00點晨起采集靜脈血5 mL,離心取上清液,置-80 ℃冰箱保存待測。采集外周血同時,進行腰椎穿刺留取CSF 3 mL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3維生素D及VDR檢測:采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)分別檢測 25(OH)D2和25(OH)D3水平。以25(OH)D2和25(OH)D3含量之和計算維生素D水平。采用ELISA法檢測血清VDR水平。所有樣品一式兩份進行測定,取均值。

1.2.4炎性因子檢測:采用全自動酶免儀檢測血清及CSF中IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)水平。IL-6、IL-21、IL-22、IL-23和TGF-β水平檢測的靈敏度為10 pg/mL,IL-17A水平的靈敏度為2 pg/mL。板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于5%。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。所有樣品一式兩份進行測定,取均值。

1.2.5影像學檢查:對所有患者進行頭和脊髓MRI檢查,觀察病灶部位、數(shù)量、強化情況、脊髓病灶長度。如CIS患者轉(zhuǎn)歸為MS時復查頭和脊髓MRI。

1.2.6CSF檢查:包括白細胞計數(shù)、總蛋白、寡克隆帶(oligoclonal band,OCB)等。

1.2.7治療與隨訪:CIS患者均給予激素治療(甲潑尼龍0.5 g×3 d、250 mg×3 d靜脈滴注,后改為潑尼松口服,1 mg/kg,遞減后1個月內(nèi)停服)。同時給予抑制胃酸、補鉀治療,所有患者未給予補充維生素D治療,隨訪期間未給予其他免疫治療。入組CIS患者每個月電話隨訪1次,3個月門診隨訪1次,出現(xiàn)臨床復發(fā)為隨訪終點。由兩位資深神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師共同判斷患者是否出現(xiàn)臨床復發(fā)及是否確診為MS[5]。如出現(xiàn)新發(fā)癥狀或原有癥狀加重,包括轉(zhuǎn)歸為診斷MS的患者,則在1周內(nèi)按照前文方法進行血清和CSF采集。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料比較采用卡方檢驗;相關性分析采用Pearson相關系數(shù)分析。以P<0.5為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CIS和NIND組細胞因子水平比較與NIND組比較,CIS組未治療前血清維生素D、 25(OH)D2、25(OH)D3、VDR、IL-6以及血清和CSF TGF-β水平均明顯降低(均P<0.01),血清和CSF IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23水平增高(均P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 CIS和NIND患者基線細胞因子水平比較

2.2 轉(zhuǎn)歸與未轉(zhuǎn)歸MS組臨床特征及CSF檢測比較74例CIS患者隨訪時間6～42個月,中位數(shù)為25個月。失訪3例,分別于隨訪9、11、22個月時各失訪1例,失訪前均未復發(fā)。最終共71例CIS患者完成隨訪,納入研究。其中轉(zhuǎn)歸為MS 43例(60.56%),未轉(zhuǎn)歸組28例(39.44%)。與未轉(zhuǎn)歸組比較,轉(zhuǎn)歸組平均年齡低(P<0.01),CSF白細胞計數(shù)增多、總蛋白升高及OCB陽性者比例均高(表2)。

表2 CIS患者轉(zhuǎn)歸與未轉(zhuǎn)歸MS組間臨床特征及CSF檢測結(jié)果比較

2.3 轉(zhuǎn)歸和未轉(zhuǎn)歸MS組患者基線細胞因子水平比較轉(zhuǎn)歸為MS的CIS患者基線CSF IL-17A、IL-23水平高于未轉(zhuǎn)歸組(P<0.01)。見表3。

表3 CIS患者轉(zhuǎn)歸與未轉(zhuǎn)歸MS組基線細胞因子水平比較

2.4 CIS患者轉(zhuǎn)歸MS前后Th17細胞相關因子水平比較與轉(zhuǎn)歸前基線水平相比,轉(zhuǎn)歸MS后血清IL-17A、IL-23、IL-6水平增高,而TGF-β水平降低(均P<0.05),CSF IL-17A、IL-23、TGF-β水平升高(均P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 CIS患者轉(zhuǎn)歸為MS前后Th17細胞相關因子水平比較

2.5 維生素D、VDR、EDSS與Th17細胞相關因子的相關性CIS患者EDSS評分與血清IL-17A和IL-21水平呈負相關(P<0.05),與其他細胞因子無相關性。血清維生素D、VDR與血清及CSF IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23、TGF-β水平均無相關性(均P>0.05)。結(jié)果見表5。

表5 CIS患者維生素D、VDR、EDSS與血清和CSF Th17細胞相關因子的相關性

3 討論

有研究表明,85%的MS患者首發(fā)癥狀表現(xiàn)為CIS,而約45%的CIS患者2年內(nèi)將轉(zhuǎn)歸為MS,偶有轉(zhuǎn)歸為NMOSD者[2]。本研究結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)歸MS患者比較,轉(zhuǎn)歸為MS組CIS患者治療前CSF IL-17A、IL-23水平均升高,提示CSF IL-17A和IL-23可能是CIS轉(zhuǎn)歸為MS的生物標志物;此外,年齡低、CSF細胞數(shù)增多、CSF總蛋白增高、OCB陽性對CIS轉(zhuǎn)歸為MS有預測價值,這與既往研究結(jié)果相似。

近期研究發(fā)現(xiàn),在隨訪1年期內(nèi),轉(zhuǎn)歸為MS的CIS患者血清維生素D水平顯著低于非轉(zhuǎn)歸組,提示低水平維生素D可作為預測CIS轉(zhuǎn)歸為MS的獨立預測因子[6]。本研究入組患者居住在北緯20°～26°之間亞熱帶氣候,與年齡、性別和長期居住地相匹配的NIND患者比較,CIS患者血清維生素D、VDR水平降低,維生素D的降低主要以25(OH)D3為主,這與Shaheen等[6]研究結(jié)果相似。此外,本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)歸為MS的CIS患者治療前維生素D水平較未轉(zhuǎn)歸組有降低趨勢,盡管兩組間比較無統(tǒng)計學差異,亦提示維生素D,尤其是25(OH)D3水平減低可能是CIS轉(zhuǎn)歸為MS的重要生物標志物。

研究發(fā)現(xiàn)Th17細胞相關的因子在自身免疫性疾病的炎癥組織中富集。在MS動物模型中,阻斷IL-23或其下游因子IL-17可降低炎癥反應,抑制疾病的發(fā)展[7]。IL-6、IL-17和TGF-β等炎癥細胞因子之間存在復雜的關系網(wǎng)絡,共同誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應,與MS發(fā)病密切相關[8],但其在CIS發(fā)病機制中的研究未見報道。本研究結(jié)果顯示,與NIND組比較,CIS組治療前血清維生素D、25(OH)D2、25(OH)D3、VDR、IL-6以及血清和CSF TGF-β水平均明顯降低,血清和CSF IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23水平增高;進一步研究發(fā)現(xiàn),CIS患者向MS轉(zhuǎn)歸的過程中,其血清IL-6、IL-17A、IL-23水平增高,TGF-β水平降低,CSF IL-17A、IL-23、TGF-β水平升高,這與既往研究結(jié)果一致[9],提示IL-6、IL-17A、IL-23和TGF-β可能是預測CIS向MS轉(zhuǎn)歸的生物標志物,在CIS發(fā)病及轉(zhuǎn)歸為MS的機制中可能發(fā)揮重要作用。

目前,針對MS或CIS患者維生素D與Th17細胞相關因子相關性的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn),維生素D能夠抑制MS患者單核細胞來源的樹突狀細胞的分化和成熟,抑制IL-23分泌,最終抑制MS進展和復發(fā)[10]。對人外周血單核細胞進行體外培養(yǎng),加入維生素D 72 h后,培養(yǎng)液上清中IL-17、IL-23和TGF-β水平明顯降低,提示維生素D可能減少促炎因子的表達和分泌[11]。本研究未發(fā)現(xiàn)CIS患者血清維生素D、VDR與Th17細胞相關因子存在相關性,僅發(fā)現(xiàn)患者EDSS評分與血清IL-17A和IL-21水平呈負相關,這與既往多數(shù)研究結(jié)論并不一致[12]。近年來Hernandez-Ledesma等研究亦發(fā)現(xiàn)MS患者維生素D與Th17細胞相關因子水平不存在明顯的相關性[13]。作者猜測,導致研究結(jié)論不一致的原因可能與樣本量較少有關,也可能維生素D和Th17細胞相關因子對MS具有獨立的調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)歸為MS的患者基線CSF OCB陽性率及細胞計數(shù)和總蛋白水平增高患者比例高于未轉(zhuǎn)歸組,提示這些指標可能成為預測MS的潛在指標。本研究轉(zhuǎn)歸為MS的CIS患者中OCB陽性達72.09%,CSF細胞數(shù)和總蛋白均為輕度增高,這與既往研究結(jié)果相似[14-15]。其原因可能為在MS患者的慢性淋巴細胞炎癥過程中,微血管內(nèi)皮被激活并產(chǎn)生前列腺素,抑制淋巴細胞轉(zhuǎn)化,出現(xiàn)巨噬細胞和淋巴細胞浸潤,導致淋巴細胞在CSF中占主導地位[16]。同時血腦屏障被破壞,外周血蛋白成分進入CSF及鞘內(nèi)合成免疫球蛋白,引起CSF總蛋白呈現(xiàn)輕度升高。

針對CIS急性期患者的治療,專家共識建議應用大劑量、短療程糖皮質(zhì)激素,原則上總療程不超過3～4周[17]。越來越多的研究結(jié)果顯示疾病修正療法可延緩CIS向MS的轉(zhuǎn)歸,或可降低復發(fā)率[18]。但亦有研究指出在CIS發(fā)病后和轉(zhuǎn)化為MS之前使用疾病修正療法并無顯著的保護作用[19]。本研究納入的CIS患者急性期激素治療療程均小于1個月,絕大多數(shù)的患者癥狀達到完全緩解的程度,但3年的隨訪中復發(fā)率為58.11%,稍高既往報道的平均水平,進一步為CIS患者緩解期仍需要免疫調(diào)節(jié)治療提供證據(jù)。此外,Th17細胞相關因子變化,包括IL-6水平升高、IL-10水平降低等是NMOSD等多種自身免疫疾病的共有現(xiàn)象,其特異性較低[20]。后續(xù)仍需對CIS轉(zhuǎn)歸MS預測指標的特異性進行深入研究。

綜上所述,CSF IL-17A和IL-23水平增高可能是預測CIS轉(zhuǎn)歸為MS的潛在生物標志物。在臨床診療中,監(jiān)測CIS患者CSFIL-17A和IL-23水平有可能預防CIS轉(zhuǎn)歸為MS,這可能為CIS患者制定新的治療方案提供科學依據(jù)。