載脂蛋白E在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運中作用的研究進(jìn)展

劉欣, 龍雄權(quán), 陳金智,3, 胡密, 唐宛瑩, 何平平, 歐陽新平

1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 湖南省生殖與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心,湖南長沙 410081;2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 神經(jīng)科學(xué)研究所 神經(jīng)變性與認(rèn)知障礙衡陽市重點實驗室,湖南衡陽 421001;3.長沙泰和醫(yī)院,湖南長沙 410004

載脂蛋白E(apoprotein E,ApoE)在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá),參與膽固醇的流出及膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport,RCT),維持人體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)。近年研究已經(jīng)證實,ApoE可以通過促進(jìn)RCT等多種途徑,減少動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)等疾病的發(fā)生[1-2]。ApoE模擬肽類藥物的開發(fā)已成為科學(xué)研究的熱點,最近研究表明,ApoE模擬肽介導(dǎo)循環(huán)性As脂蛋白的清除,促進(jìn)RCT,顯著降低血漿膽固醇水平,從而減少As發(fā)生。ApoE模擬肽還具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用。雖然近年來在ApoE及其模擬肽與RCT的研究取得一些進(jìn)展,但仍存在許多問題尚未闡明。本文對ApoE在RCT中的作用進(jìn)行綜述,期望為As等心血管疾病的治療尋找新的靶點和方法。

1 ApoE的分布

ApoE在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá),包括肝細(xì)胞、肝竇細(xì)胞、脾巨噬細(xì)胞、淋巴結(jié)、肺組織、腎上腺各層的膠質(zhì)細(xì)胞、腎小球囊細(xì)胞和睪丸平滑肌細(xì)胞等。其中,肝細(xì)胞是ApoE合成的主要部位,在大腦(數(shù)量僅次于肝臟)、腎上腺、睪丸、皮膚、腎臟、脾臟和脂肪組織以及各種組織的巨噬細(xì)胞中也很容易檢測到ApoE的產(chǎn)生[3]。ApoE在少數(shù)細(xì)胞中不表達(dá),例如腸道上皮細(xì)胞[4]。

2 ApoE結(jié)構(gòu)、分類、調(diào)控與功能

2.1 ApoE的結(jié)構(gòu)

ApoE含有299個氨基酸殘基,有一個包含四螺旋結(jié)構(gòu)22 kDa(1～199個殘基)的N端結(jié)構(gòu)域和一個包含一系列兩性分子α螺旋10 kDa(215～299個殘基)的C端結(jié)構(gòu)域,N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域通過蛋白酶敏感環(huán)連接,317個氨基酸的蛋白質(zhì)失去18個氨基酸的信號肽,成為含有N-末端、鉸鏈和C-末端結(jié)構(gòu)域的成熟蛋白質(zhì)。后者包含與磷脂、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、硫酸肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)結(jié)合的區(qū)域,以及介導(dǎo)自結(jié)合的區(qū)域(圖1)。N端結(jié)構(gòu)域容納低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)蛋白家族的結(jié)合位點與HSPG的結(jié)合區(qū),C端結(jié)構(gòu)域承載高親和力的脂質(zhì)結(jié)合位點,而在沒有脂質(zhì)的情況下,C端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,從而促進(jìn)ApoE同源二聚體和四聚體形成[5]。ApoE在N-末端螺旋束的螺旋上有許多賴氨酸和精氨酸(arginine,Arg)殘基,形成一個帶正電荷的口袋,與LDLR蛋白家族成員脂蛋白結(jié)合部位的酸性殘基相互作用[6]。在N端,4個螺旋聚集在一起,插入的鉸鏈結(jié)構(gòu)域被C端以折疊回LDLR結(jié)合區(qū)的方式鎖定,只有當(dāng)C末端在嵌入磷脂時移開時,這一區(qū)域才會暴露,這確保ApoE只是脂蛋白的活性配體。

圖1 ApoE的結(jié)構(gòu)

2.2 ApoE的分類

人類ApoE主要有3種亞型,分別為ApoE2、ApoE3和ApoE4,其基因頻率分別為5%、77%和18%[7]。在這些亞型中,涉及單核苷酸多態(tài)性的某些位置彼此不同,導(dǎo)致ApoE基因的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生巨大的變化[8]。ApoE2可以降低人體血漿中LDL水平,促進(jìn)膽固醇的流出,對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用,但可能會引起高脂血癥[9]。ApoE3是34 kDa的可交換蛋白,作為最普遍的亞型,其在血漿和膽固醇穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[10]。與ApoE3相比,ApoE2與LDLR的結(jié)合能力較低,而ApoE4與LDL的結(jié)合能力較高,這主要是因為在ApoE4中Arg-61和Glu-255之間存在鹽橋結(jié)構(gòu),而在ApoE2與ApoE3中都不存在此結(jié)構(gòu)[11]。最近對英國生物庫中382 188名歐洲血統(tǒng)參與者的研究表明,ApoE4純合子人群患嚴(yán)重新冠肺炎的風(fēng)險很高(2.36%),與ApoE3純合子人群相比,這種風(fēng)險高出兩倍[12]。造成這種差異是否與ApoE4的結(jié)構(gòu)有關(guān)仍待研究。

2.3 ApoE的表達(dá)調(diào)控

ApoE的表達(dá)受多種因子的調(diào)控(圖2)。核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、AP-2、cAMP、淀粉樣β蛋白(amyloid beta,Aβ)、睪丸孤兒受體-4(testicular orphan receptor 4,TR4)、特異性蛋白-1(specificity protein 1,Sp1)、肝X受體(liver X receptor,LXR)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome-proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)等因子,這些因子能顯著提高ApoE的表達(dá)。除此之外,成纖維細(xì)胞生長因子-1(gibroblast growth factor-1,FGF-1)通過磷脂酰肌醇3-羥基激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxykinase,PI3K/Akt)刺激ApoE的合成,并依賴維甲酸X受體α(retinoid X receptor α,RXRα)誘導(dǎo)ApoE的表達(dá),ERK通路的激活也可上調(diào)ApoE的表達(dá)[13]。ApoE基因表達(dá)還受到其膽固醇含量的調(diào)控,在人類THP-1巨噬細(xì)胞細(xì)胞中,膽固醇負(fù)荷使其ApoE合成量上調(diào)約15倍,這一過程是通過上調(diào)ApoE基因的表達(dá)實現(xiàn)[14]。Reardon等[15]發(fā)現(xiàn)干擾素(interferon,IFN)-γ可以減少ApoE的分泌,引起腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇的積累,促進(jìn)As的形成。

圖2 ApoE的調(diào)控↑代表上調(diào)表達(dá),⊥代表下調(diào)表達(dá)。很多因子能顯著上調(diào)ApoE的表達(dá)例如AP-1,AP-2,cAMP,Aβ,TR4,Sp1,RXR,ABCA-1,PPAR-γ,NK-κB,FGF-1。一些信號通路例如ERK通路也可上調(diào)ApoE的表達(dá)。值得注意的是,膽固醇負(fù)荷可上調(diào)ApoE的表達(dá),而ApoE可以促進(jìn)RCT降低胞內(nèi)膽固醇。IFNγ下調(diào)ApoE的表達(dá),減少ApoE分泌。

2.4 ApoE的功能

ApoE是LDLR的配體,也是肝細(xì)胞乳糜微粒(chylomicron,CM)殘粒受體的配體,與脂蛋白代謝密切相關(guān),能夠參與膽固醇的流出及RCT,維持人體的膽固醇穩(wěn)態(tài),抑制As的發(fā)生。肝細(xì)胞分泌的ApoE大多數(shù)與極低密度脂蛋白(very slow density lipoprotein,VLDL)顆粒有關(guān),介導(dǎo)清除脂解產(chǎn)生的腸源性脂蛋白殘留物[16]。冷暴露降低血清膽固醇同樣依賴ApoE的作用[17]。細(xì)胞內(nèi)ApoE可能在生理或病理生理上調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程,包括細(xì)胞骨架的組裝和穩(wěn)定、線粒體的完整性和功能以及樹突的形態(tài)和功能[3]。ApoE可以將巨噬細(xì)胞表型從促炎M1型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡譓2型,抑制CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞,減少白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗炎作用。ApoE還具有抗氧化性,可以調(diào)節(jié)各種分子的水平[18]。

3 ApoE與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運

3.1 膽固醇逆向轉(zhuǎn)運

RCT是指外周細(xì)胞的膽固醇通過血漿高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)進(jìn)入肝臟,再經(jīng)糞便排出的過程。外周組織細(xì)胞RCT包括三個連續(xù)的步驟:①外周組織細(xì)胞游離膽固醇(free cholesterol,FC)流出到HDL和(或)載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-I,ApoA-I)上;②HDL內(nèi)FC受血漿卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(lecithin-cholesterolacyltransferase,LCAT)酯化形成膽固醇酯(cholesterol ester,CE)并轉(zhuǎn)移至HDL核心;③HDL內(nèi)CE由肝細(xì)胞HDL受體家族成員(HDL recepter,HDLR)和(或)B族I型清道夫受體(scavenger receptor class B type I,SR-BI)攝取并在肝中被代謝。RCT的第一步是膽固醇的流出,巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇脂滴通過自噬體轉(zhuǎn)移到溶酶體,產(chǎn)生FC,FC轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜,然后流出。膽固醇的流出有4種途徑:簡單擴(kuò)散;SR-BI介導(dǎo)的擴(kuò)散;在細(xì)胞外受體存在時,由ABCA1或三磷酸腺苷結(jié)合匣轉(zhuǎn)運蛋白G1(ATP-binding cassette sub-family G member 1,ABCG1)介導(dǎo)的膽固醇流出。前兩者為被動過程,后兩者則為主動運輸過程。膽固醇的外流需要細(xì)胞外低脂受體的參與,主要是ApoA-Ⅰ,也有含較少FC的新生HDL[4]。流出的膽固醇與細(xì)胞外低脂受體相結(jié)合形成新生的高密度脂蛋白,并在LCAT的作用下酯化,酯化的膽固醇約20%進(jìn)入HDL內(nèi)核,80%轉(zhuǎn)移至VLDL和LDL,自此RCT的第二步已完成。RCT的最后一步有兩種途徑,含有外流膽固醇的HDL可與SR-BI或HDL受體家族成員相結(jié)合,介導(dǎo)膽固醇進(jìn)入肝細(xì)胞。此外,高密度脂蛋白中的膽固醇可以通過膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cholesterolestertransferprotein,CETP)的作用轉(zhuǎn)移到含載脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)的LDL/VLDL中,LDL通過LDLR結(jié)合介導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞。含有ApoE的HDL與LDL都可以與特異的ApoE受體結(jié)合從而被肝細(xì)胞攝取。HDL中的膽固醇約70%在CETP的作用下轉(zhuǎn)移至LDL,通過LDL受體途徑在肝被清除,20%通過HDL受體在肝被清除,10%由特異的ApoE受體介導(dǎo)在肝被清除。一旦進(jìn)入肝細(xì)胞,膽固醇就可以FC的形式轉(zhuǎn)移到膽汁中或在轉(zhuǎn)化為膽汁酸后通過糞便從體內(nèi)排出[4](圖3)。

圖3 ApoE與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運

ApoE促進(jìn)RCT,外源性和內(nèi)源性ApoE都能促進(jìn)膽固醇從膽固醇負(fù)荷的巨噬細(xì)胞外流。內(nèi)源性ApoE通過與細(xì)胞表面LDLR、蛋白聚糖和膜脂質(zhì)結(jié)合促進(jìn)膽固醇外流。外源性ApoE與ABCA1相互作用形成新生的盤狀高密度脂蛋白,作為細(xì)胞外膽固醇低脂受體發(fā)揮作用。新生的盤狀高密度脂蛋白與排出的膽固醇一起進(jìn)入血漿,通過一些步驟結(jié)合到成熟的球形高密度脂蛋白顆粒中。HDL通過與SR-B1或HDLR相互結(jié)合并將膽固醇輸送到肝細(xì)胞。此外,CETP可以識別LDL中的ApoE或ApoB,介導(dǎo)CE從HDL向LDL轉(zhuǎn)移,同時HDL表面的部分ApoE也轉(zhuǎn)移到LDL,新生的LDL與LDLR相互結(jié)合被肝細(xì)胞攝取。含有ApoE的HDL與LDL都可以與特異的ApoE受體結(jié)合從而被肝細(xì)胞攝取。

3.2 ApoE在RCT第一環(huán)節(jié)的作用

HDL通過巨噬細(xì)胞膜表面受體介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇流出是防止血管內(nèi)皮下膽固醇堆積最有效的方式[19],ApoE在這一過程中可能作為膽固醇受體發(fā)揮作用,表達(dá)ABCA1的HeLa細(xì)胞和J774細(xì)胞與人ApoE2、ApoE3和ApoE4 3種亞型蛋白共同孵育后刺激膽固醇的外流證明這一點。ApoE作為膽固醇受體的功能主要是由C-末端結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的,N-末端四螺旋束區(qū)則是膽固醇流出相對較差的受體。在每個分子基礎(chǔ)上,C結(jié)構(gòu)域刺激膽固醇外流的效率與完整的ApoE相同,ApoA-1 N端結(jié)構(gòu)域和ApoE C端結(jié)構(gòu)域組成的嵌合分子,比完整的載脂蛋白和相互嵌合體更具膽固醇受體活性,這也表明ApoE C端結(jié)構(gòu)域有促進(jìn)膽固醇流出的能力[20]。上述實驗皆是研究外源性ApoE對于膽固醇流出的作用,而內(nèi)源性ApoE對于膽固醇流出的作用尚不可知。J774細(xì)胞一般不表達(dá)ApoE,然而在巨細(xì)胞病毒啟動子的控制下,可以表達(dá)人體的ApoE3。使用這種修飾過的J774細(xì)胞實驗,可以排除膽固醇介導(dǎo)ApoE基因表達(dá)上調(diào)的干擾,更好地觀察內(nèi)源性ApoE和外源性ApoE分別對膽固醇流出和細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)的影響,從而找到它們潛在的差異。通過使用J774+E細(xì)胞,Mazzone等[21-22]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性ApoE在促進(jìn)固醇流出方面比外源性ApoE更有效。內(nèi)源性ApoE的分泌是通過與細(xì)胞表面LDLR,蛋白聚糖和膜脂質(zhì)結(jié)合,與質(zhì)膜形成一種特殊的聯(lián)系而完成的。減少內(nèi)源性ApoE與這些細(xì)胞表面分子的聯(lián)系,可以減少膽固醇的流出。然而,外源性ApoE與細(xì)胞表面沒有觀察到這種聯(lián)系。在J774+E細(xì)胞中,研究人員還發(fā)現(xiàn)其膽固醇流出增加與ABCA1無關(guān),這可能提示內(nèi)源性ApoE介導(dǎo)膽固醇流出并不通過ABCA1途徑。不同亞型的ApoE與LDLR結(jié)合能力不同,內(nèi)源性ApoE與LDLR結(jié)合能力與其促進(jìn)膽固醇流出的能力呈負(fù)相關(guān),在巨噬細(xì)胞內(nèi)3種純合子亞型ApoE中,ApoE2促進(jìn)膽固醇流出的能力比ApoE3和ApoE4強(qiáng)。由于外源性ApoE并不與LDLR相互作用,因此3種亞型外源性ApoE促進(jìn)膽固醇流出的能力并無差異[4]。

3.3 ApoE在RCT第二、三環(huán)節(jié)的作用

ApoE除能促進(jìn)膽固醇流出,也影響RCT的其他環(huán)節(jié),在沒有CETP的情況下,ApoE能夠擴(kuò)展HDL2的膽固醇負(fù)荷,從而運載更多的膽固醇至肝臟,分泌到膽汁中去[23]。將HDL2中的ApoE去除,這種擴(kuò)展作用消失。Zanotti等[24]首次證明,ApoE在體內(nèi)對巨噬細(xì)胞RCT有顯著的貢獻(xiàn),并且這一作用完全歸因于ApoE在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。這一結(jié)論是通過分別向野生型小鼠和ApoE-/-小鼠注射膽固醇負(fù)載野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(高表達(dá)ApoE)與膽固醇負(fù)載ApoE-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞得到的,注射膽固醇負(fù)載野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的小鼠膽固醇逆向效率顯著提高,動脈壁上巨噬細(xì)胞是否也符合這一結(jié)論目前仍不清楚。在ApoE與疾病之間的關(guān)系研究領(lǐng)域近年來研究并不深入,大規(guī)模人群研究表明,ApoE4等位基因攜帶者患As風(fēng)險增加1.7倍[25]。ApoE血漿水平與不同的死亡原因有關(guān):高ApoE水平與心血管疾病和癌癥死亡有關(guān),而低ApoE水平與癡呆癥相關(guān)死亡有關(guān)。這可能是因為患有心血管疾病的患者需要更高的ApoE水平降低血漿膽固醇,減緩病程進(jìn)展[26]。

總之,無論是內(nèi)源性ApoE還是外源性ApoE,它們在RCT過程中都起著重要作用,這些作用不局限于RCT某一環(huán)節(jié),缺乏ApoE將嚴(yán)重降低RCT效率從而引起As發(fā)生。

4 ApoE模擬肽

基于對ApoE促進(jìn)RCT機(jī)制的研究,研發(fā)ApoE模擬肽類藥物成為治療As等疾病的一種新思路。ApoE模擬肽類藥物目前正在進(jìn)行臨床前和臨床評估,取得非常好的試驗效果,具有廣闊的發(fā)展前景[27]。如上所述,ApoE刺激膽固醇流出的功能主要是由C結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的,基于這一認(rèn)識,研究人員將C結(jié)構(gòu)域便作為開發(fā)ApoE模擬肽的基礎(chǔ),每個模擬物包含26個氨基酸。ATI-5261是研發(fā)出來的第一種ApoE模擬肽,雖然這種肽在體內(nèi)可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇的流出及逆向轉(zhuǎn)運,減少ApoE-/-老鼠As的發(fā)生,但表現(xiàn)出肌肉毒性[28]。CS-6253作為新型ApoE來源的ABCA1激動肽,它與ATI-5261有著相似的作用,但它沒有肌肉毒性[29]。ApoE模擬肽通過與LDLR和(或)熱休克蛋白相互作用,介導(dǎo)肝臟從循環(huán)中清除致As的ApoB,也具有增強(qiáng)HDL介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流、減輕炎癥和抑制As發(fā)展的能力,同時ApoE模擬肽誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流的效率與天然ApoE3和ApoA-I相似,甚至更高[27]。Ac-hE18A-NH2可以降低動物模型中的血漿膽固醇,并表現(xiàn)出抗炎特性,是目前治療血脂異常的理想藥物,正在進(jìn)行I期臨床試驗[30]。研究發(fā)現(xiàn),ApoE模擬肽COG1410不僅可以減少蛛網(wǎng)膜下腔出血后的血腦屏障的破壞,在早期腦損傷中提供神經(jīng)保護(hù)[31],還能減輕缺血性腦卒中的血腦屏障損傷[32]。COG1410治療還明顯改善早期腦損傷后的前庭運動功能和葡萄糖攝取功能,并使損傷周圍和同側(cè)半球的血管內(nèi)皮生長因子生成減少,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[33]。同時COG1410還對耐藥性鮑曼不動桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性[34]。ApoE模擬肽除擁有抗As、抗炎與抗菌的作用外,還表現(xiàn)出抗腫瘤作用,許多臨床前研究表明,載脂蛋白模擬物在癌癥動物模型中具有治療作用[35]。ApoE模擬肽還可以參與免疫調(diào)節(jié),改善哮喘的疾病進(jìn)展[36]。ApoE模擬肽功能的多態(tài)性與ApoE本身功能多態(tài)性有著密不可分的關(guān)系。

總體而言,ApoE模擬肽的研究正在迅速發(fā)展。除天然ApoE所具有的功能外,ApoE模擬肽還能提高HDL的水平與功能,顯著降低血漿膽固醇水平,其抗炎與抗氧化的功能使其具有極佳的抗As的特性。大量的臨床前與臨床研究都支持ApoE模擬肽具有不錯的治療效果,可以預(yù)測ApoE模擬肽即將成為心血管疾病防治的重要候選藥物。

5 小結(jié)與展望

總的來說,ApoE可以促進(jìn)膽固醇的流出及RCT,降低患As的風(fēng)險。在特定環(huán)境(細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)培養(yǎng))和特定細(xì)胞類型中,ApoE也可以影響膽固醇外流和RCT。在這些情況下,巨噬細(xì)胞膽固醇負(fù)荷在調(diào)節(jié)ApoE轉(zhuǎn)錄中的作用還沒有完全闡明。大多數(shù)研究都使用了放射性標(biāo)記的膽固醇,但并不能探索巨噬細(xì)胞中完整的膽固醇穩(wěn)態(tài)。將不同組織來源的巨噬細(xì)胞在體內(nèi)包埋在藻酸鹽膠囊中,可能成為探索這些問題的可行方法。ApoE模擬肽類藥物是治療As和AD等疾病的理想藥物,雖然ApoE模擬肽常表現(xiàn)出肌肉毒性,ApoE模擬肽在體內(nèi)減少As等疾病發(fā)生的確切機(jī)制尚不明確,但新型ApoE模擬肽已經(jīng)成功解決肌肉毒性問題并且具有天然ApoE不具備的作用。種種趨勢表明,ApoE模擬肽具有非常好的發(fā)展前景。