miR-27a低表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞增殖的影響

彭依琳, 陳文欣, 胡華, 周建斌

南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科,2.病理科,湖南衡陽(yáng) 421001

子宮內(nèi)膜癌具有侵襲性轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn),嚴(yán)重影響著患者預(yù)后[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)能夠調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因之間的相互作用,進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[2]。研究發(fā)現(xiàn),miR-27a在胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)[3-6],提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著一定的致癌作用。本研究探討miR-27a低表達(dá)對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

胰蛋白酶、FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;McCoy’s 5A培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技公司;miRcute miRNA提取分離試劑盒、cDNA合成試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒、miR-27a-3p引物、U6引物、組織細(xì)胞裂解液均購(gòu)自美國(guó)Tiangen公司;riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑及miR-27a抑制劑及陰性對(duì)照(NC-miR)購(gòu)自RIBOBIO廣州銳博生物技術(shù)有限公司;MTT購(gòu)自上海炎熙生物有限公司;DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;0.1%結(jié)晶紫溶液購(gòu)自上海如吉生物有限公司;細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Binder公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;熒光定量qRT-PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床試驗(yàn)中心)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱,用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)。

將細(xì)胞分為miR-27a inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-27a inhibitor)、NC-miR組(轉(zhuǎn)染NC-miR)、空白對(duì)照組(HEC-1-A不做任何處理)。根據(jù)riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組HEC-1-A細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染結(jié)束后更換新培養(yǎng)基并開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-27a表達(dá)

采用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取總miRNA,根據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-27a的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參選擇U6。miR-27a上游引物為5′-AGGGCTTAGCTGCTTGTGAG-3′,下游引物為5′-CGGAACTTAGCCACTGTGAA-3′;U6上游引物為5′-CATGGCTCCTCCTCCTCTTC-3′,下游引物為5′-GACTTGGGGTTATGGGTCAC-3′。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

從六孔板中提取miR-27a inhibitor組細(xì)胞,并將其分離出單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞懸液為1×104個(gè)/mL后接種于96孔板上,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后取出,PBS清洗1次,每孔加入90 μL McCoy’s 5A基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液;4 h后移去混合液后加入150 μL DMSO溶液,震蕩后放入酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)并記錄各孔光密度(optical density,OD)值。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞接種于六孔板中,每孔500個(gè)細(xì)胞,并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,處理后繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3天換液,當(dāng)每孔出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆團(tuán)即終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液,PBS清洗2～3遍,然后每孔細(xì)胞中添加2 mL 4%多聚甲醛,常溫固定1 h,PBS洗滌1次,自然風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色,15 min后清水沖洗,晾干后使用網(wǎng)格膠帶肉眼克隆計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖。組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建miR-27a低表達(dá)細(xì)胞株

miR-27a inhibitor組miR-27a表達(dá)量(0.204±0.046)低于NC-miR組(0.917±0.091)和空白對(duì)照組(1.006±0.134)(P<0.05),提示成功構(gòu)建miR-27a低表達(dá)細(xì)胞株。

2.2 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖的比較

在48 h和72 h miR-27a inhibitor組細(xì)胞增殖OD值較NC-miR組和空白對(duì)照組下降(P<0.05;表1)。

表1 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖(OD值)中的比較

2.3 miR-27a低表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞克隆的影響

與NC-miR組和空白對(duì)照組比較,miR-27a inhibitor組克隆形成數(shù)明顯降低(P<0.05;圖1)。

圖1 miR-27a低表達(dá)對(duì)HEC-1-A細(xì)胞增殖的影響A為細(xì)胞克隆鏡下圖(結(jié)晶紫染色);B為細(xì)胞克隆數(shù)柱狀圖。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)[7]。在子宮內(nèi)膜癌中,miR-576-5p過(guò)表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[8-9],而miR-100-3p過(guò)表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌惡性行為[10];提示miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中既可作為抑癌基因也可作為原癌基因。

研究發(fā)現(xiàn),miR-27b既可以通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力、侵襲能力及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程,還可以通過(guò)抑制TGF-β超家族內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲[11-12]。miR-27a與結(jié)直腸癌患者預(yù)后、腫瘤分期及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也有著密切的關(guān)聯(lián)[13-14]。低表達(dá)miR-27a抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[15]。Li等[16]報(bào)道,miR-27a通過(guò)靶向和下調(diào)腫瘤標(biāo)志物TMEM170B蛋白來(lái)抑制Wnt/β-catenin通路,從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和增殖。miR-27a作為生物標(biāo)志物,已被用于胃癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌等多種實(shí)體瘤的診斷和預(yù)后判定[17]。

雌二醇通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途徑影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[18]。高表達(dá)STAT1和低表達(dá)STAT6可能是復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的有害因素[19-20]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí),STAT3在子宮內(nèi)膜癌組織中呈明顯高表達(dá)狀態(tài)[21]。本研究成功構(gòu)建miR-27a低表達(dá)HEC-1-A細(xì)胞珠,且miR-27a低表達(dá)可降低HEC-1-A細(xì)胞增殖能力,因此,miR-27a可能是治療子宮內(nèi)膜癌的潛在分子靶點(diǎn)。