下調miR-409-5p對口腔癌細胞SCC-9增殖、遷移的影響

張學武, 鄭茜玲, 劉繼華

1.北京大學第三醫(yī)院延安分院 延安市中醫(yī)醫(yī)院口腔科,陜西延安 716000;2.西安大興醫(yī)院耳鼻喉科,陜西西安 710016

口腔癌是發(fā)生在口腔部位的癌癥,也是較常見的腫瘤之一[1],最常見的病理類型為鱗狀細胞癌,約占口腔癌總體的90%[2]。因其發(fā)病部位較為隱蔽,發(fā)現(xiàn)時大多處于中晚期,故死亡率高,預后差[3]。研究表明,口腔癌的發(fā)生與長期嚼檳榔、吸煙等不良習慣有關[4]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)可對基因的表達產生正向或負向的影響,進一步改變腫瘤的進展[5]。研究表明,miR-409-5p在癌癥中高表達[6]。本文探討下調miR-409-5p對口腔癌細胞增殖、遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器

收集本院確診并手術的8例口腔癌患者的口腔癌組織及癌旁正常組織。所有患者術前均未接受放療、化療、靶向或內分泌等輔助治療?；颊呔炇鹬橥鈺?。qRT-PCR檢測癌組織與癌旁正常組織中miR-409-5p水平。人口腔鱗癌頸淋巴結轉移癌細胞系GNM、人口腔癌細胞SCC25、SCC-9、HN6購自上海細胞庫,RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Hyclone公司,脂質體Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司,miRNA inhibitor、陰性對照購自上海吉瑪基因有限責任公司,vimentin、β-actin一抗購于江蘇親科生物研究中心有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人口腔癌癌細胞GNM、SCC25、SCC-9、HN6均于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長密度達到培養(yǎng)皿80%選取對數(shù)期生長狀態(tài)較好的細胞傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染分組

取對數(shù)生長期生長狀態(tài)較好的SCC-9細胞株種于六孔板,待密度達到60%根據(jù)轉染說明書進行轉染。篩選出確定細胞株后,按照對細胞的不同處理,將細胞分為3組:空白對照組(Lip2000處理的SCC-9細胞)、陰性對照組(Lip2000+陰性對照序列處理SCC-9細胞)、miR-409-5p組(Lip2000和inhibitor-miR-409-5p共同處理SCC-9細胞)。

1.4 qRT-PCR檢測GNM、SCC25、SCC-9、HN6細胞中miR-409-5p的表達

以人口腔鱗癌頸淋巴結轉移癌細胞系GNM作為對照,使用qRT-PCR篩選人口腔鱗癌細胞(SCC25、SCC-9、HN6)中miR-409-5p相對表達量最高的細胞株作為后續(xù)實驗細胞。取接種于6孔板的4組細胞,在5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達80%～90%時,棄培養(yǎng)基,每孔加入1 mL TRIzol,轉移至無RNA酶的離心管中,加入氯仿200 μL,震蕩15 min,室溫靜置15 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上層液體加入等體積異丙醇,12 000 r/min離心5 min。去上清液,加入75%乙醇1 mL,12 000 r/min離心5 min。去上清液,管內沉淀靜置干燥5 min,加入焦碳酸二乙酯水溶解,分光光度計檢測提取的RNA溶液水平,重復檢測3次。各組細胞提取RNA后,按照試劑盒說明書合成cDNA,反轉錄條件37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作,反應條件95 ℃10 min 1個循環(huán);95 ℃5 s,60 ℃1 min 40個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min 1個循環(huán)。miR-409-5p正向引物:5′-AUGCAAAGUUGCUCGG GUAACCU-3′,反向引物:5′-CCAUCAGUCCCAAAU CCA-3′;GAPDH正向引物:5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,反向引物:5′-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3′。以GNM細胞為對照,比較各細胞miR-409-5p的相對表達量,選取miR-409-5p表達最高的作為實驗細胞。

1.5 MTT法檢測SCC-9細胞增殖情況

取空白對照組、陰性對照組、miR-409-5p組細胞以每孔1×104的細胞數(shù)種植于96孔板,每組設置5個副孔,放入細胞恒溫箱培養(yǎng)24 h后,以每孔15 μL加入四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)溶液,放入37 ℃溫箱孵育4 h,加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),30 min后測定490 nm波長光密度(optical density,OD)。細胞存活率(%)=(實驗組OD/對照組OD)×100%,實驗重復3次。

1.6 Transwell檢測細胞遷移及侵襲能力

遷移實驗:取空白對照組、陰性對照組、miR-409-5p組細胞以每孔數(shù)為2×105個加入小室中,每組細胞3個復孔。使用無血清培養(yǎng)基重懸于上室中,下室加入600 μL含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,于細胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后取出,觀察細胞狀態(tài),棉簽擦除未穿小室膜細胞后,PBS清洗2次,置于4%多聚甲醛溶液中固定15 min后,取出風干后置入結晶紫溶液中,浸泡10 min后再次清洗,再次風干后顯微鏡下拍照。侵襲實驗:將基質膠原液用無血清培養(yǎng)基稀釋后以50 μL/孔加入小室上層中,注意不要產生氣泡。放置恒溫培養(yǎng)箱2 h,待基質膠凝固后重復遷移實驗步驟。

1.7 Western blotting法檢測vimentin蛋白相對表達量

各組細胞消化離心,在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min,棄上清液,PBS清洗后細胞裂解液冰上裂解30 min后4 ℃過夜,次日離心30 min,取上清液。BCA試劑盒檢測各組蛋白水平。3組蛋白取等量樣品進行凝膠電泳,轉膜后,快速封閉液封閉30 min,加入一抗稀釋液進行孵育,4 ℃條件下?lián)u床搖晃過夜。次日四聚丙烯(烷基)苯磺酸鹽溶液清洗后加入二抗(山羊抗兔1∶5 000)稀釋液孵育2 h,ECL試劑盒曝光顯影。

1.8 qRT-PCR檢測vimentin mRNA

各組細胞消化離心,PBS洗滌,離心5 min(1 500 g/min,4 ℃),取下層沉淀,依次加入1 mL TRIzol試劑、0.2 mL氯仿試劑,混勻后冰浴10 min,離心(12 000 r/min,4 ℃)15 min后取上清,加入1 mL異丙醇,冰浴半小時后離心取下層沉淀。檢測沉淀的RNA水平后定量。vimentin正向序列:5′-GCTGCAGGCCCAGATTCA-3′,反向序列:5′-TTCATACTGCTGGCGCACAT-3′;GAPDH正向序列:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,反向序列:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。95 ℃ 65 s,58 ℃ 20 s,40個循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 口腔癌癌組織和癌旁正常組織中miR-409-5p的相對表達量

口腔癌癌組織中miR-409-5p相對表達量(1.35±0.05)較癌旁正常組織(1.01±0.04)明顯增加(P<0.05)。

2.2 SCC-9細胞株的確定

SCC-9細胞中miR-409-5p mRNA相對表達量(1.39±0.02)明顯高于GNM細胞(1.00±0.04)、SCC-25細胞(0.52±0.02)、HN6細胞(0.90±0.02),差異均有顯著性(P<0.05)。故選取口腔鱗狀細胞癌細胞株中miR-409-5p mRNA相對表達量最高的SCC-9細胞為后續(xù)實驗細胞。

2.3 下調miR-409-5p對人口腔癌細胞SCC-9侵襲和遷移能力的影響

與空白對照組和陰性對照組比較,miR-409-5p組細胞增殖、侵襲和遷移能力均下降(P<0.05;表1、圖1)。

圖1 下調miR-409-5p對人口腔癌細胞SCC-9侵襲和遷移能力的影響(結晶紫染色,200×)

表1 3組SCC-9細胞增殖、侵襲和遷移能力比較 %

2.4 miR-409-5p對人口腔癌細胞SCC-9 vimentin mRNA及蛋白的影響

與空白對照組和陰性對照組比較,miR-409-5p組vimentin mRNA和蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05;圖2、表2)。

圖2 Western blotting法檢測3組細胞vimentin蛋白相對表達量

表2 3組SCC-9細胞vimentin mRNA及蛋白相對表達量比較

3 討 論

miRNA是一種進化保守的非編碼、堿基對較少的單鏈RNA,抑制基因轉錄或者使下游基因失活來調節(jié)蛋白質生成。研究表明,miRNA可靶向腫瘤基因組上脆性位點,使基因發(fā)生缺失、擴增或轉位,進而調控相關基因轉錄以及翻譯、控制癌細胞發(fā)生、發(fā)展[7-8]。miR-146a可調節(jié)鼻咽癌細胞對順鉑的敏感性[9];miR-365-3p可通過抑制CDK-10的表達對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡和周期產生影響[10]。

miR-409-5p在不同癌癥中其作用不同。王睿等[11]發(fā)現(xiàn),過表達miR-409-5p可下調肝癌細胞系HepG2增殖及遷移能力。miR-409-5p在乳腺癌組織和細胞中表達均上調,下調后可通過調節(jié)Ras抑制蛋白1來抑制細胞增殖及遷移能力[12]。本文結果顯示,miR-409-5p在口腔癌組織及口腔癌細胞中表達上調,可抑制口腔癌細胞增殖、侵襲、遷移。

細胞從上皮狀態(tài)轉變?yōu)殚g充質狀態(tài)被稱為上皮間充質轉化[13]。上皮間充質轉化在改變細胞間質表型過程中發(fā)揮了重要作用,其主要作用為改變腫瘤細胞極性、切斷腫瘤細胞與基底膜之間的粘連,同時使腫瘤細胞具備抵抗凋亡、降解細胞外基質的特性,從而使腫瘤細胞獲得較強的侵襲和遷移能力[14]。而vimentin蛋白為中間絲蛋白,作為上皮間充質轉化發(fā)展過程中的關鍵蛋白,對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,其上調可加速癌癥的發(fā)展,在腫瘤細胞侵襲遷移和維持細胞正常形態(tài)方面具有重要作用,包括加速其轉移、生長等[15-16]。本研究結果顯示,下調SCC-9中miR-409-5p后vimentin表達下降,進而抑制上皮間充質轉化。

綜上所述,下調miR-409-5p能夠抑制細胞增殖、侵襲和遷移,其機制可能與下調vimentin進而抑制上皮間充質轉化有關,從而為口腔癌的診斷和治療提供新的思路。