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    miR-185/YWHAZ軸通過(guò)糖酵解調(diào)控NSCLC A549細(xì)胞凋亡

    2023-06-06 01:45:20馬建剛王冬譚維周鳳張莉媛
    關(guān)鍵詞:肺癌水平

    馬建剛, 王冬, 譚維, 周鳳, 張莉媛

    陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,陜西咸陽(yáng) 712000

    肺癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤,盡管靶向治療、化療和新型免疫治療技術(shù)已廣泛應(yīng)用,但其5年生存率仍然很低[1]。代謝重編程是癌癥的標(biāo)志之一[2],腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出不同代謝表型,其特征是糖酵解增加和氧化磷酸化減少。有研究發(fā)現(xiàn),隨肺癌進(jìn)展,葡萄糖和脂肪酸的完全氧化顯著減少,且與晚期癌細(xì)胞的乳酸排泄和3H-脫氧葡萄糖攝取增加同時(shí)發(fā)生,使細(xì)胞向糖酵解表型轉(zhuǎn)變[3]。miRNAs在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。臨床研究顯示,miR-185在NSCLC中低表達(dá),可抑制肺癌進(jìn)展[5]。YWHAZ沉默的卵巢癌細(xì)胞明顯抑制了糖酵解[6]。然而,miR-185和YWHAZ之間的關(guān)系及其對(duì)NSCLC細(xì)胞糖酵解的影響尚不明確,基于此,本研究探討miR-185/YWHAZ軸通過(guò)糖酵解對(duì)NSCLC細(xì)胞凋亡的影響,為治療肺癌提供新的靶點(diǎn)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。所有miRNA mimics、miRNA inhibitor、siRNA和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(合成NCBI號(hào)為NM_001135699.2的YWHAZ序列后插入PCDNA3.1載體)均由南京金斯瑞公司設(shè)計(jì)和合成,YWHAZ siRNA序列:5′-AAAGUUCUUGAUCCCCAAUGC-3′,GFP siRNA序列:5′-AAAGUUCUUGAUCCCCAAUGC-3′。PrimeScript RT-PCR試劑盒購(gòu)自廣州艾基生物技術(shù)有限公司。SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自北京斐樂(lè)生物科技有限公司。YWHAZ抗體購(gòu)自深圳市益百順科技有限公司。ECL試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。乳酸和NADH試劑盒購(gòu)自北京盒子生工科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

    人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549在1640培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至60%~80%融合。miR-185相關(guān)分組如下:①敲低對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列);②miR-185敲低組(轉(zhuǎn)染miR-185 inhibitor);③過(guò)表達(dá)對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列);④miR-185過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-185 mimics)。YWHAZ相關(guān)分組如下:①敲低對(duì)照組(轉(zhuǎn)染siGFP);②YWHAZ敲低組(轉(zhuǎn)染siYWHAZ);③過(guò)表達(dá)對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體);④YWHAZ過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染YWHAZ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)。使用Lipofectamine3000將上述處理因素轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。糖酵解抑制劑90 μmol/L Phloretin、10 mmol/L Quercetin、2.3 μmol/L STF31、1.3 μmol/L WZB117、5 μmol/L Bromopyruvate、61 μmol/L 3PO、1.5 μmol/L Dichloroacetate、3 μmol/L Oxamic acid、13 mmol/L NHI-1處理A549細(xì)胞[7]。

    1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

    TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,合成cDNA,采用SYBR Premix Ex Taq在7500 real-time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。將cDNA稀釋至1∶20,95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共45循環(huán);40 ℃ 30 s。使用ΔΔCq法計(jì)算YWHAZ mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列YWHAZ正向5′-CCTGCATGAAGTCTGTAACTGAG-3′,反向5′-GACCTACGGGCTCCTACAACA-3′;GAPDH正向5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′,反向5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

    1.4 免疫印跡法檢測(cè)YWHAZ

    提取細(xì)胞總蛋白,每個(gè)樣品孔添加50 μg總蛋白。用12%SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,5%脫脂奶粉封閉膜1 h,TBS洗滌緩沖液清洗2次,與YWHAZ(1∶10 000)、actin(1∶10 000)抗體4 ℃孵育過(guò)夜。TBS洗滌緩沖液洗滌后,添加二抗室溫孵育1 h。用ECL試劑盒測(cè)定actin和YWHAZ蛋白條帶。

    1.5 乳酸、NADH水平的測(cè)定

    根據(jù)文獻(xiàn)[8]方法,使用乳酸和NADH檢測(cè)試劑盒,酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)量乳酸和NADH光密度(optical density,OD)。

    1.6 細(xì)胞凋亡水平的測(cè)定

    A549細(xì)胞接種于6孔板上,采用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)雙重標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后,收集所需細(xì)胞,PBS洗滌,用膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞。每100 μL細(xì)胞懸液中加入Annexin V 5 μL,室溫孵育15 min。5 min后加入PI,流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V和PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

    1.7 miRNA高通量測(cè)序

    提取來(lái)自不同糖酵解抑制劑處理后A549細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA以構(gòu)建miRNA文庫(kù),并由RioBio測(cè)序。通過(guò)15%Tris-硼酸鹽-EDTA聚丙烯酰胺凝膠獲得18~40個(gè)核苷酸的小RNA。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后,使用Illumina Hi-Seq2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。采用RioBio將干凈的數(shù)據(jù)與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)。

    1.8 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

    通過(guò)miRDB(http://mirdb.org/)與HumanTargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)在線預(yù)測(cè)miR-185底物。A549細(xì)胞在24孔板上培養(yǎng),每孔轉(zhuǎn)染0.5 μg螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、0.5 μg β-半乳酸苷酶表達(dá)載體和等量對(duì)照質(zhì)粒或miR-185 mimics。轉(zhuǎn)染24 h后,檢測(cè)A549細(xì)胞中的熒光素酶活性。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析和事后q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 YWHAZ敲低或過(guò)表達(dá)效果及溶解曲線

    A549細(xì)胞YWHAZ蛋白水平敲低YWHAZ后下降,過(guò)表達(dá)YWHAZ后上升(圖1A)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)YWHAZ的溶解曲線為單峰,說(shuō)明用于檢測(cè)的引物特異性高(圖1B)。

    圖1 YWHAZ敲低或過(guò)表達(dá)效果(A)及溶解曲線(B)

    2.2 糖酵解抑制劑對(duì)糖酵解酶、乳酸、NADH、細(xì)胞凋亡水平的影響

    糖酵解抑制劑處理后,乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)、人血小板磷酸果糖激酶(phosphofructokinase platelet,PFKP)和甘油醛-3-脫氫酶(phosphogluconate dehydrogenase,PGD)等糖酵解酶、乳酸和NADH水平均下降,細(xì)胞凋亡水平上升(P<0.05;圖2)。

    圖2 糖酵解抑制劑對(duì)糖酵解酶、乳酸、NADH、細(xì)胞凋亡水平的影響a為P<0.05,與對(duì)照組比較。

    2.3 miR-185對(duì)糖酵解酶、乳酸、NADH、細(xì)胞凋亡水平的影響

    糖酵解抑制劑處理后,miRNA高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)有45種miRNA表達(dá)上調(diào)(圖3A)。過(guò)表達(dá)miR-185時(shí)細(xì)胞乳酸、NADH水平下降,細(xì)胞凋亡水平上升;敲低miR-185時(shí)上述變化逆轉(zhuǎn)(P<0.05;圖3B、C、D、E)。

    圖3 miR-185對(duì)糖酵解酶、乳酸、NADH、細(xì)胞凋亡水平的影響A為miRNA高通量測(cè)序結(jié)果;B為miRNA過(guò)表達(dá)篩選影響乳酸的miRNA;C為敲低miR-185后乳酸柱狀圖;D、E為敲低或過(guò)表達(dá)miR-185后NADH和細(xì)胞凋亡柱狀圖。a為P<0.05,與對(duì)照組比較。

    2.4 miR-185靶向YWHAZ促進(jìn)細(xì)胞凋亡

    miRDB和HumanTargetScan在線分析發(fā)現(xiàn),有60個(gè)基因可能被預(yù)測(cè)為miR-185底物,但使用siRNA敲低上述60個(gè)基因后,僅敲低YWHAZ時(shí)A549細(xì)胞乳酸水平下降(P<0.05;圖4)。過(guò)表達(dá)YWHAZ時(shí)細(xì)胞乳酸、NADH水平上升,細(xì)胞凋亡水平下降;敲低YWHAZ時(shí)上述變化逆轉(zhuǎn)(P<0.05;圖4)。過(guò)表達(dá)miR-185時(shí),YWHAZ的mRNA和蛋白水平下降,敲低miR-185時(shí)上述變化逆轉(zhuǎn)(P<0.05;圖4)。此外,miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端非翻譯區(qū)(UTR)(P<0.05;圖4)。

    圖4 miR-185靶向YWHAZ促進(jìn)細(xì)胞凋亡A為siRNA敲低篩選影響乳酸的關(guān)鍵基因;B為過(guò)表達(dá)YWHAZ后乳酸柱狀圖;C和D為過(guò)表達(dá)或敲低YWHAZ后NADH和細(xì)胞凋亡柱狀圖;E和F為敲低或過(guò)表達(dá)miR-185后YWHAZ的mRNA和蛋白水平;G為熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。a為P<0.05,與對(duì)照組比較。

    3 討 論

    肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤,肺癌患者的5年生存率僅為17.7%,主要是由于腫瘤的快速轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)導(dǎo)致[9-10]。因此,有必要深入研究肺癌發(fā)生和發(fā)展的潛在機(jī)制。本研究通過(guò)使用糖酵解抑制劑、miRNA高通量測(cè)序、遺傳學(xué)方法鑒定了miR-185/YWHAZ軸在NSCLC細(xì)胞凋亡和糖酵解中的重要作用。

    本研究發(fā)現(xiàn),糖酵解抑制劑處理后,糖酵解酶、乳酸、NADH水平下降,細(xì)胞凋亡水平上升。代謝重編程是癌癥的標(biāo)志[2],能量代謝分為糖代謝、蛋白質(zhì)代謝和脂肪代謝[11-12]。在正常情況下,細(xì)胞主要通過(guò)有氧呼吸產(chǎn)生能量。當(dāng)氧含量不足時(shí),細(xì)胞進(jìn)行糖酵解產(chǎn)生能量[13],這個(gè)過(guò)程稱為無(wú)氧呼吸。與正常細(xì)胞不同,腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下也主要通過(guò)糖酵解產(chǎn)生能量,這種現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)[14]。糖酵解的特點(diǎn)是生產(chǎn)能量快,效率低。腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要快速能量消耗,同時(shí),糖酵解產(chǎn)生的乳酸為腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)酸性環(huán)境,有利于腫瘤細(xì)胞的快速增殖和生長(zhǎng)。因此,糖酵解抑制劑處理后,細(xì)胞乳酸水平下降并伴隨了細(xì)胞凋亡水平上升。

    本研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-185時(shí),YWHAZ的mRNA和蛋白水平下降,miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端UTR。miRNA是非編碼的小RNA,長(zhǎng)度為18~23個(gè)核苷酸,通過(guò)與mRNA的3′端UTR結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[15]。因此,在NSCLC細(xì)胞中,miR-185通過(guò)靶向降解YWHAZ的mRNA來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能。

    本研究發(fā)現(xiàn),敲低YWHAZ時(shí)A549細(xì)胞的乳酸、NADH、細(xì)胞凋亡水平上升。YWHAZ影響多種重要的細(xì)胞過(guò)程,例如代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[16]。臨床研究證實(shí),YWHAZ的過(guò)表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[17]。研究表明,YWHAZ調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過(guò)程[18]。例如,YWHAZ與6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶的心肌同工酶結(jié)合,表明YWHAZ參與調(diào)節(jié)糖酵解和代謝[19]。此外,人乳腺上皮細(xì)胞中YWHAZ的增加上調(diào)了LDHA表達(dá),提高糖酵解活性并促進(jìn)早期轉(zhuǎn)化[20]。在YWHAZ過(guò)表達(dá)的人乳腺上皮細(xì)胞中敲除LDHA可顯著降低糖酵解活性并抑制轉(zhuǎn)化。因此,YWHAZ可能成為多種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

    然而,本研究仍然有不足之處。首先,本研究只使用了一種細(xì)胞株A549,miR-185/YWHAZ軸是否在其他NSCLC細(xì)胞株發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能需要進(jìn)一步驗(yàn)證。其次,本研究是細(xì)胞水平的研究,miR-185在體內(nèi)是否抑制NSCLC糖酵解值得進(jìn)一步探討。糖酵解產(chǎn)生的乳酸為所有種類的腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)酸性環(huán)境,并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖,因此miR-185/YWHAZ軸是否在所有腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮功能是下一步的研究方向。

    綜上所述,YWHAZ是促進(jìn)糖酵解的關(guān)鍵分子,miR-185是抑制糖酵解的關(guān)鍵分子。糖酵解抑制后,NSCLC細(xì)胞凋亡水平上升。miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端非翻譯區(qū),減少了YWHAZ的表達(dá),促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。以上提示,針對(duì)miR-185/YWHAZ軸NSCLC藥物的篩選和開(kāi)發(fā)具有一定的應(yīng)用前景。

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