黃芩苷通過(guò)激活JNK/p38 MAPK通路誘導(dǎo)ALL Reh細(xì)胞凋亡

肖李, 王廣, 練高建, 李程悅, 龔慧芳, 王俊涵, 蘇澤紅

南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部,湖南衡陽(yáng) 421001

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是導(dǎo)致兒童死亡的常見惡性腫瘤之一,其治療主要采用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡也稱為細(xì)胞程序性死亡,凋亡時(shí)其信號(hào)匯集在細(xì)胞線粒體膜上,使膜表面促凋亡蛋白Bax發(fā)生構(gòu)象改變而被激活,活化的Bax促使線粒體膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變,線粒體內(nèi)可溶性血紅素蛋白細(xì)胞色素C、核酸內(nèi)切酶G、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及其他線粒體膜間隙蛋白被釋放至胞質(zhì),激活下游Caspase-3、Caspase-7,從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[1]。因此維持線粒體膜功能(mitochondrial membrane function,MMP)是抑制細(xì)胞凋亡的重要途徑。c-Jun氨基蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號(hào)家族通路中兩條至關(guān)重要的通路。MAPK通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、應(yīng)激、遷移和死亡[2]。黃芩苷是中草藥黃芩根部的多酚提取物,具有抗氧化、抗增殖及抗腫瘤等多種生物活性[3],但其對(duì)于ALL Reh細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制尚未可知,基于此,本文對(duì)此進(jìn)行了研究,旨在為黃芩苷應(yīng)用于ALL臨床治療提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、儀器和細(xì)胞

黃芩苷購(gòu)自索萊寶公司(Solarbio);AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒和線粒體膜定位檢測(cè)試劑盒(JC-1)購(gòu)自江蘇凱基生物公司;ROS檢測(cè)試劑盒、一步法TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞核DAPI染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;多功能細(xì)胞成像儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司;高速冷凍離心機(jī)和EVOSTMM5000成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

ALL細(xì)胞株Reh購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù),Reh細(xì)胞株在RPMI1640培養(yǎng)基(含10%及1%青-鏈霉素雙抗)37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2 MTS法測(cè)定Reh細(xì)胞增殖

將Reh細(xì)胞以3×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h,用10、20、40、60、80、100 mg/L黃芩苷處理細(xì)胞,將細(xì)胞與20 μL MTS溶液共孵育4 h,490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔光密度(optical density,OD),計(jì)算細(xì)胞存活率。設(shè)立對(duì)照組(Reh細(xì)胞)和DMSO組(0.1%DMSO+Reh細(xì)胞)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將Reh細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,用20、40 mg/L黃芩苷處理細(xì)胞,收集細(xì)胞。重懸浮細(xì)胞沉淀后,依次加入Annexin V-FITC和PI染色液,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。免疫染色固定液固定后,TUNEL染色液染色1.5～2.0 h;DAPI染色液染色5 min后,成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞凋亡情況。設(shè)立對(duì)照組(Reh細(xì)胞)。

1.4 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS

將Reh細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,用20、40 mg/L黃芩苷、20 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC、40 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC處理細(xì)胞,收獲細(xì)胞。按照碧云天活性氧ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書稀釋DCFH-DA探針,染色,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。設(shè)立對(duì)照組(Reh細(xì)胞)。

1.5 JC-1熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP

同1.4分組,收獲細(xì)胞,加入JC-1染色工作液孵育染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP。

1.6 Western blotting檢測(cè)蛋白水平

將Reh細(xì)胞以1×106/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,用20、40 mg/L黃芩苷、5 mmol/L NAC、40 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC處理細(xì)胞,RIPA buffer裂解細(xì)胞,提取總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶后轉(zhuǎn)膜,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育1 h,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色。設(shè)立對(duì)照組(Reh細(xì)胞)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷對(duì)Reh細(xì)胞增殖的影響

黃芩苷處理Reh細(xì)胞后能顯著抑制細(xì)胞增殖,IC50為20 mg/L(P<0.01;圖1)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇20、40 mg/L作為黃芩苷干預(yù)質(zhì)量濃度。

圖1 黃芩苷對(duì)Reh細(xì)胞增殖的影響a為P<0.05,b為P<0.01,c為P<0.001,與對(duì)照組比較。

2.2 黃芩苷誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡

黃芩苷處理Reh細(xì)胞24 h后,20 mg/L和40 mg/L黃芩苷組細(xì)胞凋亡率分別為32.1%和85.53%。鏡下觀察經(jīng)黃芩苷處理后,凋亡的Reh細(xì)胞數(shù)量明顯增多,細(xì)胞膜皺縮變形,核內(nèi)染色質(zhì)凝聚,細(xì)胞核碎裂(圖2A);細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)顯著降低,而促凋亡蛋白Bax、Cleaved-Caspase-3/7及Cleaved-多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01;圖2B)。以上提示,黃芩苷誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡。

圖2 黃芩苷誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡A為TUNEL染色結(jié)果; B為Western blotting結(jié)果。a為P<0.05,b為P<0.01,與對(duì)照組比較。

2.3 黃芩苷通過(guò)損傷MMP升高胞內(nèi)ROS水平,從而誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡

黃芩苷誘導(dǎo)細(xì)胞MMP受損,ROS水平顯著升高;黃芩苷聯(lián)合NAC處理Reh細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡率顯著降低,細(xì)胞增殖明顯恢復(fù)(P<0.01,P<0.05;圖3)。以上結(jié)果表明,黃芩苷可通過(guò)損傷MMP提高胞質(zhì)內(nèi)ROS水平,從而誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡。

圖3 黃芩苷損傷MMP從而升高胞內(nèi)線粒體ROS,誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡1為對(duì)照組;2為20 mg/L黃芩苷;3為40 mg/L黃芩苷;4為20 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC;5為40 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC。a為P<0.05,與對(duì)照組比較;b為P<0.01,與同質(zhì)量濃度黃芩苷組比較。

2.4 黃芩苷上調(diào)JNK/p38 MAPK通路誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡

JNK/p38 MAPK作為ROS下游靶蛋白[4-5],黃芩苷升高Reh細(xì)胞內(nèi)ROS水平后明顯激活了JNK/p38 MAPK通路;而清除ROS則顯著抑制了JNK/p38 MAPK、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的活化,而Survivin表達(dá)水平得以恢復(fù)(P<0.01,P<0.05;圖4)。以上提示,黃芩苷通過(guò)升高胞內(nèi)ROS水平激活JNK/p38 MAPK通路,從而誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡。

圖4 黃芩苷激活JNK/p38 MAPK通路誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡a為P<0.05,與對(duì)照組比較;b為P<0.01,與40 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC組比較。

3 討 論

ALL是一種異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤,其主要致病機(jī)理是未發(fā)育成熟的淋巴母細(xì)胞在患者骨髓、外周血及其他外周器官異常增殖,導(dǎo)致血液中淋巴母細(xì)胞數(shù)量異常增多,外周器官病變。關(guān)于ALL治療主要以化療為主,常用的ALL化療藥物包括強(qiáng)的松龍、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、柔紅霉素和I-天冬酰胺酶等[6]。然而,化療常給患者帶來(lái)較大不良反應(yīng),且在化療治療ALL進(jìn)程中易產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性,亟需發(fā)掘新的不良反應(yīng)較小的化療藥物。細(xì)胞凋亡主要是由機(jī)體內(nèi)部或受到外部刺激引發(fā),參與介導(dǎo)凋亡的途徑有3類,一類是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)途徑;一類是細(xì)胞表面信號(hào)介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;另一類是線粒體介導(dǎo)途徑[7]。細(xì)胞凋亡歸屬于細(xì)胞正常性死亡,有助于清除體內(nèi)衰老、損傷和多余的細(xì)胞,且對(duì)生物體內(nèi)生理機(jī)能、免疫穩(wěn)態(tài)維持和癌癥防治至關(guān)重要。

黃芩苷是中草藥黃芩根部多酚提取物,其親脂性比較高,有助于提高穿透細(xì)胞的能力和有利于機(jī)體快速吸收;黃芩苷能夠通過(guò)不同機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),比如可通過(guò)升高乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平在體內(nèi)外抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移;可通過(guò)促進(jìn)ROS產(chǎn)生、損傷MMP來(lái)抑制骨肉瘤和骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng);也可通過(guò)增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞以及結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[8-12]。

本研究發(fā)現(xiàn),首先MTS結(jié)果表明黃芩苷抑制Reh細(xì)胞生長(zhǎng),隨后流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光和Western blotting的結(jié)果均表明黃芩苷處理后Reh細(xì)胞發(fā)生凋亡、ROS水平上調(diào)以及MMP受到抑制。以上提示,黃芩苷可有效抑制Reh細(xì)胞增殖,并呈一定劑量依賴性;且黃芩苷是通過(guò)促使Reh細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

JNK/p38 MAPK屬于MAPK家族,參與細(xì)胞增殖、分化和死亡等過(guò)程。例如,JNK/p38 MAPK也分別參與促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞增殖;JNK/p38 MAPK能參與誘導(dǎo)肺上皮-間質(zhì)細(xì)胞的分化[13-14]。此外,在惡性間皮瘤細(xì)胞中,沒(méi)食子酸通過(guò)激活p38通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效果。蟲草素通過(guò)活化JNK/p38 MAPK來(lái)抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。瑞非尼通過(guò)活化JNK/p38 MAPK通路抑制肺癌的生長(zhǎng)[15]。因此,靶向激活JNK/p38 MAPK可能為研發(fā)新的ALL化療藥物提供參考。本研究Western blotting結(jié)果表明,黃芩苷上調(diào)了磷酸化JNK和磷酸化p38蛋白表達(dá),而NAC和黃芩苷合用后則下調(diào)了磷酸化JNK和磷酸化p38蛋白表達(dá),且抗凋亡蛋白Survivin表達(dá)水平恢復(fù)。以上提示,黃芩苷經(jīng)激活Reh細(xì)胞內(nèi)JNK/p38 MAPK通路,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡;而清除ROS后則可抑制JNK/p38 MAPK蛋白磷酸化,細(xì)胞凋亡得以抑制,表明黃芩苷升高胞內(nèi)ROS水平來(lái)激活Reh細(xì)胞內(nèi)JNK/p38 MAPK通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述,黃芩苷經(jīng)損傷Reh細(xì)胞MMP來(lái)升高胞內(nèi)ROS水平,并靶向激活JNK/p38 MAPK通路,誘導(dǎo)Reh細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為進(jìn)一步深入研究ALL發(fā)病機(jī)制及防治提供了一定的理論依據(jù)。