鴨坦布蘇病毒的分離、鑒定及致病性研究

李群 丁國(guó)偉 竇莉莎 姜曉芳 范娟

摘 要：2022年5月，江蘇揚(yáng)州某鴨場(chǎng)25日齡左右櫻桃谷鴨發(fā)生了以癱瘓為主要表現(xiàn)的神經(jīng)癥狀疾病，病死鴨剖檢無特征性病變。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示為鴨坦布蘇病毒（Tembusuvirus，TMUV）感染。為了分離該病毒，將處理后的發(fā)病鴨組織樣品經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡鴨胚，將分離到的病毒命名為YZ01株。遺傳演化分析結(jié)果顯示，該病毒與我國(guó)其它水禽源分離株具有相近的遺傳演化關(guān)系，屬于2.2分支。為評(píng)估該分離株的致病性，經(jīng)腦內(nèi)途徑接種7日齡櫻桃谷鴨，在接種后3d，雛鴨出現(xiàn)行動(dòng)困難、震顫等癥狀，在感染后7d雛鴨死亡率達(dá)70%；結(jié)果顯示，分離株YZ01株對(duì)雛鴨具有高致病性。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，HB疫苗株對(duì)YZ01的攻毒保護(hù)率為80%。本研究為TMUV感染提供了流行病學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒；分離；遺傳進(jìn)化分析；

中圖分類號(hào)：S858.323文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2023）03-0006-06

鴨坦布蘇病毒（tembusu virus， TMUV）病，主要危害產(chǎn)蛋期種鴨和蛋鴨，導(dǎo)致采食量和產(chǎn)蛋量大幅度下降[1-3]。2014年以來，我國(guó)研究者在櫻桃谷商品肉鴨群和青年蛋鴨群陸續(xù)分離到鴨坦布蘇病毒 [4-7]。TMUV不僅能在不同品種蛋鴨、肉種鴨和肉鴨群中傳播流行，還可以感染其它禽類，如鵝、雞、麻雀等[8-9]，且具有水平傳播的特點(diǎn)，給該病防控帶來巨大阻力。

TMUV是黃病毒科（Flavivirus）黃病毒屬（Flavivir）的病毒，基因組為單鏈正鏈RNA，長(zhǎng)10 990 kb，僅含一個(gè)開放閱讀框（Open reading frame， ORF），編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，囊膜蛋白（envelope， E）是主要的表面糖蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在決定病毒嗜性、毒力和致病性方面亦發(fā)揮主要作用，同時(shí)也是 RT-PCR方法檢測(cè)的重點(diǎn)[10-11]。

本試驗(yàn)從江蘇省揚(yáng)州某種鴨場(chǎng)送檢的櫻桃谷鴨樣品中分離到1株TMUV（命名為YZ01株），對(duì)分離毒株的E基因進(jìn)行了序列測(cè)定和致病性研究，為TMUV感染提供了流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2022年5月，從江蘇省揚(yáng)州某鴨場(chǎng)25日齡左右的發(fā)病櫻桃谷鴨群中，采集病鴨的心臟、肝臟、脾臟、腎臟和腦臟組織共計(jì)5份。

1.1.2 鴨胚和試驗(yàn)動(dòng)物 無TMUV母源抗體的10日齡鴨胚和7日齡櫻桃谷鴨，由揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3 主要試劑盒 Easy Pure? Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTaq? PCR SuperMix、DL2000 DNA Marker以及TA載體均購(gòu)自北京全式金公司；E.Z.N.A. Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega公司，M-MLV Recerse Transcriptase購(gòu)自Promega公司。

1.1.4 引物 根據(jù)GenBank中TMUV PS株序列（GenBank登錄號(hào)：KT876991）設(shè)計(jì)擴(kuò)增E基因的全長(zhǎng)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：

E-f：5'-TTCAGCTGTCTGGGGATGCA-3'

E-r：5'- CAGGGTTTGAAGCTGAAAG-3'

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理 將發(fā)病鴨脾臟組織用剪刀剪碎后與無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline， PBS）按照1：5（w/v）比例研磨，制成20%勻漿，隨后5 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 濾器除菌，置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒的分離與鑒定 取上述濾液經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡鴨胚10個(gè)，每胚接種0.2 mL，37 ℃培養(yǎng)，棄去24 h內(nèi)死亡的鴨胚。每天觀察死胚情況，并及時(shí)收獲死胚尿囊液。將未死鴨胚孵育至120 h收獲尿囊液，置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) 利用Easy Pure? Viral DNA/RNA Kit對(duì)上述樣品進(jìn)行總RNA提取，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。具體方法：取 RNA 5 μL與2 μL E-r引物混勻，70 ℃作用 10 min，冰浴2 min，加入5×MLV Buffer 5 ?L、M-MLV 1 ?L、dNTP（10 mM each）5 ?L、RRI 0.5 ?L，用超純水補(bǔ)足至25 ?L，在42 ℃作用1 h，94 ℃作用5 min。

利用2×EasyTaq? PCR SuperMix進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系如下：cDNA 5 ?L，上下游引物各2 ?L，2×EasyTaq? PCR SuperMix 25 ?L，用超純水補(bǔ)足至50 ?L，隨后進(jìn)行如下程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖核酸凝膠觀察PCR產(chǎn)物。

1.2.4 目的片段的回收、連接與轉(zhuǎn)化 切取目的片段，利用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit對(duì)目的片段進(jìn)行回收和純化。取膠回收產(chǎn)物4 ?L與1 ?L TA載體混合，在25 ℃作用30 min，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞。次日，挑取單個(gè)菌落，將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 序列及遺傳進(jìn)化分析 從GenBank下載所用TMUV參考毒株序列（表1），使用MEGA 5.0繪制遺傳進(jìn)化樹。

1.2.6 病毒的致病性試驗(yàn) 為評(píng)估分離株的致病性，用鴨胚擴(kuò)繁F2代病毒。用鴨胚測(cè)定F2代尿囊液中的病毒含量。具體方法：將F2代尿囊液用無菌PBS進(jìn)行10倍系列稀釋（10-1～10-6），經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡鴨胚，按照0.1 mL/胚的劑量（同一稀釋度接種5個(gè)胚）用石蠟密封接種孔，并置37 ℃孵化箱孵化。每日照胚2次，棄掉24 h死亡的鴨胚。連續(xù)觀察5 d，記錄每個(gè)稀釋度死亡鴨胚數(shù)量，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量（egg infectious dose， EID50）。以104.0 ELD50經(jīng)腦內(nèi)感染7日齡櫻桃谷鴨，對(duì)照組注射0.2 mL PBS。連續(xù)觀察14 d，觀察攻毒組鴨的臨床表現(xiàn)，記錄死亡率。TMUV參考毒株信息見表1。

1.2.7 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 為評(píng)估當(dāng)前TMUV疫苗株HB對(duì)分離株YZ01的免疫保護(hù)效果，取7日齡櫻桃谷鴨20只，隨機(jī)分為2組，每組10只。經(jīng)頸部皮下接種0.5 mL TMUV滅活疫苗HB株，對(duì)照組接種等劑量的PBS。免疫后28 d，用YZ01株攻毒。攻毒后3 d，采集血液并分離血清。將血清無菌處理后，每個(gè)樣品以0.2 mL的劑量接種3個(gè)10日齡的鴨胚，放置37 ℃孵化箱繼續(xù)孵化7 d。每日照胚2次，棄掉24 h死亡的鴨胚，并記錄死亡鴨胚數(shù)量。7 d后，收取尿囊液。提取RNA后，利用上述引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以評(píng)估疫苗株HB對(duì)分離株YZ01的攻毒保護(hù)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離鑒定

經(jīng)尿囊腔途徑接種脾臟組織過濾液，鴨胚在感染后4～5 d內(nèi)全部死亡，死亡鴨胚胚體嚴(yán)重出血（圖1）。收取死亡鴨胚的尿囊液，用RT-PCR進(jìn)行TMUV E基因的檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性（圖2）。因此，成功分離到TMUV毒株，命名為YZ01株。用鴨胚擴(kuò)繁病毒至F2代，測(cè)定病毒滴度為104.4 ELD50/0.2 mL。對(duì)F2代病毒外源病毒的檢測(cè)，未擴(kuò)增出禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、鴨星狀病毒（DAstV）、鴨肝炎病毒（DHAV-1和3型）等外源病毒的特異性條帶（圖2）。

2.2 序列和遺傳進(jìn)化分析

從GenBank下載2010～2021年我國(guó)分離到的TMUV毒株共16株，根據(jù)YZ01株E基因序列，進(jìn)行進(jìn)化分析。如圖3所示，所有17株TMUV聚類形成2大分支。除2021年分離株NTUC225/20單獨(dú)形成一個(gè)分支外，包括YZ01分離株在內(nèi)的16株TMUV分為1個(gè)分支，包含2個(gè)亞類。其中，分離株YZ01屬于2.2分支。

2.3 攻毒試驗(yàn)

為評(píng)估TMUV分離株的致病性，以7日齡櫻桃谷鴨為動(dòng)物模型進(jìn)行了感染試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在感染后3～6 d， YZ01感染組的櫻桃谷鴨出現(xiàn)以精神沉郁、采食量下降、站立不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)以及行動(dòng)困難為主的臨床癥狀。感染后4～6 d為死亡高峰期，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)YZ01株感染組櫻桃谷鴨的死亡率為70%（圖4）。在試驗(yàn)期內(nèi)，PBS對(duì)照組櫻桃谷鴨未見異常，由此可見，YZ01株對(duì)櫻桃谷鴨表現(xiàn)為高毒力。

2.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

免疫組和對(duì)照組在觀察期內(nèi)均存活。TMUV滅活疫苗HB株對(duì)分離株YZ01的攻毒保護(hù)結(jié)果如圖5所示，HB疫苗免疫組的鴨胚尿囊液RT-PCR陽(yáng)性比例為2/10，感染率僅為20%，保護(hù)率高達(dá)80%；而PBS組陽(yáng)性比例為9/10，感染率為90%。由此可見，疫苗株HB對(duì)分離株YZ01具有很好的保護(hù)效果。

3 討論

TMUV最早于1955年從馬來西亞的三帶喙庫(kù)蚊分離到，自首次分離到TMUV至2000年長(zhǎng)達(dá)45年時(shí)間內(nèi)，一直未見由該病毒所引起的某種疾病的報(bào)道。2000年，在馬來西亞一個(gè)肉雞場(chǎng)發(fā)現(xiàn)TMUV的感染[12]。直至2010年，TMUV傳入我國(guó)南方養(yǎng)鴨地區(qū)，并迅速擴(kuò)散。隨著對(duì)TMUV研究的不斷深入以及疫苗的上市，目前對(duì)TMUV的防控較好，多呈地方或者養(yǎng)殖場(chǎng)散發(fā)流行。但TMUV已在鴨群中流行十多年，最初感染產(chǎn)蛋期種鴨和蛋鴨，導(dǎo)致采食量和產(chǎn)蛋量大幅度下降、引起卵巢病變，目前已發(fā)現(xiàn)TMUV亦感染7周齡內(nèi)小鴨，臨床表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、跛行和癱瘓等神經(jīng)癥狀，且內(nèi)臟組織無一致性病理變化[3]，因繼發(fā)感染其它病原菌導(dǎo)致死亡和淘汰升高。

根據(jù)E基因演化分析，目前，可將TMUV分為3個(gè)基因群：1群為從馬來西亞櫻桃谷商品肉鴨病例分離的D1977/1/MY株和D1921/1/3/MY株；2群又分為2.1和2.2兩個(gè)亞群，主要是泰國(guó)和中國(guó)TMUV分離株；3群有2個(gè)毒株（DK/TH/CU-56/2016和DK/CH/SD14/2014）[13]。2020年，F(xiàn)eng等用我國(guó)2015年分離到Y(jié)株（2.2分支）和2020年分離到的H株（2.1分支）分別經(jīng)肌肉途徑感染3周齡櫻桃谷鴨，引起的死亡率分別為10%和60%[7]，提示TMUV可能存在變異株，導(dǎo)致TMUV的致病機(jī)制發(fā)生了改變。本研究主要選擇2.1和2.2分支的不同時(shí)間分離株進(jìn)行遺傳演化分析，發(fā)現(xiàn)分離株YZ01屬于2.2分支，與TMUV疫苗株HB株同屬1個(gè)分支，表明揚(yáng)州地區(qū)流行毒株未發(fā)生變異，且HB株對(duì)YZ01的攻毒保護(hù)率高達(dá)80%，說明疫苗免疫仍起到很好的效果。同時(shí)也提示我們，分離株YZ01株可以作為TMUV疫苗候選株。

研究者們已證實(shí)TMUV感染的嚴(yán)重程度與感染日齡密切相關(guān)[4-8， 14-16]，試驗(yàn)用鴨日齡越小，感染越嚴(yán)重。用TMUV空斑純化毒株ZJ-6株經(jīng)腦內(nèi)、皮下和鼻內(nèi)途徑接種1日齡櫻桃谷鴨，感染率分別為100%、60%和40%，僅腦內(nèi)感染途徑可導(dǎo)致20%雛鴨死亡[2]。由此可見，TMUV感染所致疾病的嚴(yán)重程度亦與感染途徑有關(guān)，并以腦內(nèi)途徑感染最嚴(yán)重。因此，為評(píng)估分離株的致病性，本研究采用腦內(nèi)途徑感染7日齡櫻桃谷鴨。

4 結(jié)論

本研究從感染鴨脾臟樣品中成功分離到一株TMUV，命名為YZ01株，屬于基因2.2型，是目前流行毒株，且當(dāng)前疫苗對(duì)分離株有很好的保護(hù)效果。本研究為TMUV感染提供了流行病學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] CAO Z， ZHANG C， LIU Y， et al. Tembusu virus in ducks， China [J]. Emerg Infect Dis， 2011，17：1873-1875.

[2] SU J， LI S， HU X， et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus， a new Tembusu-related flavivirus [J]. PloS one， 2011， 6： e18106.

[3] YAN P， DOLA Y， ZHANG X， et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China [J]. Virol， 2011， 417（1）：1-8.

[4] SUN X， DIAO Y， WANG J， et al. Tembusu virus infection in Cherry Valley ducks： the effect of age at infection [J]. Vet Microbiol， 2014， 168：16-24.

[5] 劉曉曉.坦布蘇病毒強(qiáng)毒株的分離與鑒定及細(xì)胞適應(yīng)株的培育[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[6] LIANG T， LIU X， QU S， et al. Pathogenicity of egg-type duck-origin isolate of Tembusu virus in Pekin ducklings [J]. BMC Vet Res， 2019， 15：362.

[7] FENG C， JIN M， YANG L， et al. Pathogenicity of a Jinding duck-origin cluster 2.1 isolate of Tembusu virus in 3-week-old Pekin ducklings [J]. Vet Microbiol， 2020， 251：108870.

[8] LIU M， CHEN S， CHEN Y， et al. Adapted Tembusu-like virus in chickens and geese in China [J]. J Clin Microbiol， 2012， 50：2807-2809.

[9] TANG Y， GAO X， DIAO Y， et al. Tembusu Virus in Human， China [J]. Transbound. Emerg. Dis.， 2013， 60 （3）： 193-196.

[10] 王建昌，王金鳳，袁萬哲，等. 鴨坦布蘇病毒一步法RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38 （08）： 629-633.

[11] 顏丕熙，李國(guó)新，吳曉剛，等. 應(yīng)用套式RT-PCR快速檢測(cè)鴨坦布蘇病毒[J]. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2011，48 （03）：34-37.

[12] KONO Y， TSUKAMOTO K， ABD HM， et al. Encephalitis and retarded growth of chicks caused by Sitiawan virus， a new isolate belonging to the genus flavivirus [J]. Am J Trop Med Hyg， 2000， 63：94-101.

[13] Ninvilai P， Tunterak W， Oraveerakul K， Amonsin A， Thontiravong A. Genetic characterization of duck Tembusu virus in Thailand， 2015–2017： Identification of a novel cluster [J]. Transbound Emerg Dis， 2019， 66：1982-1992.

[14] YUN T， YE W， NI Z， et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from Pekin ducklings in China [J]. Vet Microbiol， 2012， 157：311-319.

[15] HOMONNAY ZG， KOVACS EW， BANYAI K， et al. Tembusu-like flavivirus （Perak virus） as the cause of neurological disease outbreaks in young Pekin ducks [J]. Avian Pathol， 2014， 43：552-560.

[16] LI N， LV C， YUE R， et al. Effect of age on the pathogenesis of duck Tembusu virus in Cherry Valley ducks [J]. Front Microbiol， 2015， 6：581.

Isolation， Identification and Pathogenicity of Duck Tembusu Virus

LI Qun，DING Guowei，DOU Lisha，JIANG Xiaofang，F(xiàn)AN Juan

（Yangzhou UNI-BIO Pharmaceutical CO.，Ltd.，Yangzhou? 225008，Jiangsu，China）

Abstract：? ?In January 2022， the 25-day-old Cherry Valley ducks from aYangzhou farm were characterized by leg paralysis and had no characteristic pathological changes after autopsy. RT-PCR results showed that ducks were infected by Tembusu virus （TMUV）. In order to isolate the virus， the treated tissue samples were inoculated to 10-day-old duck embryos through the allantoic cavity and the duck embryo isolate virus was named YZ01. The results of phylogenetic analysis showed that the virus has a similar genetic evolution relationship with other waterfowl isolates in China， belonging to the clade of 2.2. To assess the pathogenicity of the isolate， 7-day-old Cherry Valley ducks were inoculated with intracerebral route. Three days post inoculation （dpi）， the ducklings showed difficulty in movement， tremor and other symptoms， and the mortality rate of ducklings reached 70% after 7dpi. The results showed that YZ01 strain was highly pathogenic to ducklings. The results of challenge protection experiment showed that the protection TMUV HB vaccine against challenge with YZ01 was 80%. This study provides epidemiological basis for TMUV infection.

Keywords：? Tembusu virus; Isolation; Phylogenetic analysis