蘿卜硫素干擾微管與線粒體動力學抗腫瘤機制

周 妍 吳 巍,2*

(1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系,北京 100069;2. 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機制研究北京市重點實驗室,北京 100069)

腫瘤的異質(zhì)性給腫瘤化學藥物治療(以下簡稱化療)帶來了障礙,沒有一種抗癌藥是萬能的,針對不同的腫瘤和不同的患者用不同的藥物或采取聯(lián)合用藥策略是必要的[1]。因此,研發(fā)和篩選更多高效低毒的化療藥物,便于精準地進行個體化療法,提高治療效果?，F(xiàn)在很多的化療藥物都是針對性地打靶一些關(guān)鍵分子,破壞腫瘤細胞內(nèi)蛋白網(wǎng)絡系統(tǒng)和蛋白穩(wěn)態(tài),因此發(fā)現(xiàn)必要的腫瘤形成機制,探索抗癌藥物的抑癌機制,找到對藥物敏感的靶蛋白是首要任務。蘿卜硫素及其代謝物(sulforaphanes, SFNs)是低毒、高效的癌細胞凋亡誘導劑。筆者課題組多年來在亞細胞水平對SFNs的抑癌機制進行了一系列研究[2-8]。筆者發(fā)現(xiàn)這些食物來源的活性成分有獨特的分子結(jié)構(gòu),能夠破壞微管,促發(fā)抑癌信號,諸如誘導自噬體形成,抑制自噬溶酶體形成,導致線粒體受損蛋白累積、細胞代謝障礙等,最終引起凋亡[2,5-6]。找到了打靶癌細胞的關(guān)鍵靶點,反過來也能設計更多新的抗癌物質(zhì),便于使用類癌芯片優(yōu)中選優(yōu),提高治療精準度。探索SFNs的亞細胞機制也有潛在的應用價值和經(jīng)濟價值。近年筆者團隊已經(jīng)取得了一些有意義的進展,研究結(jié)果發(fā)表在CancerLetters、CellDeathDisease及CellDeathDiscovery等期刊上。憑一孔之見,現(xiàn)將一些重要的發(fā)現(xiàn)綜述如下。

1 SFNs解聚微管觸發(fā)微管動力學異常

用SFNs處理前列腺癌、人腦膠質(zhì)母細胞瘤、人非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)等在熒光顯微鏡下可見微管蛋白呈“鳥巢狀”分布[4,6,8]。通過透射電子顯微鏡能看到細胞內(nèi)空泡化、核包膜消失、核凝集、核碎裂和凋亡小體等。分子生物學分析顯示,SFNs介導ERK1/2持續(xù)磷酸化,進一步活化26S蛋白酶體和caspase3,最終導致多種蛋白質(zhì)的表達下調(diào)、剪切和降解[3,8]。用SFNs處理人NSCLC細胞,分離細胞總蛋白和線粒體蛋白進行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)分析,結(jié)果顯示在全細胞中有200個蛋白表達下調(diào);在線粒體中有31個蛋白表達下調(diào)。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫通過生物信息學聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白中細胞骨架蛋白、線粒體跨膜轉(zhuǎn)位蛋白及線粒體蛋白水解酶等與NSCLC的惡性程度及轉(zhuǎn)歸等有關(guān)[9]。免疫共沉淀和免疫熒光染色均證明SFNs介導ERK1/2磷酸化,下調(diào)α-微管蛋白(α-tubulin)。這種下調(diào)源于26S蛋白酶體的活化;caspase3體外剪切試驗證明,α-tubulin也能被caspase3剪切[7-8]。SFNs介導的α-tubulin下調(diào)加劇了微管的解聚。微管是由α-tubulin和β-tubulin聚合構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)。在正常生理條件下,微管的聚合和解聚處于動態(tài)平衡[10]。一些微管抑制劑可打破微管動力學平衡,誘導細胞凋亡[11]。有報道[12-13]顯示,紫杉醇可與微管內(nèi)表面βⅢ-tubulin結(jié)合,促進微管動力學失衡,抑制細胞生長,誘發(fā)凋亡。SFNs分子中異硫氰酸基團也可與α-tubulin中的半胱氨酸殘基共價結(jié)合,引起α-tubulin結(jié)構(gòu)改變,誘發(fā)NSCLC細胞凋亡[14]。組織芯片[6]結(jié)果顯示:正常肺組織和癌旁組織中α-tubulin表達較低,肺癌組織中α-tubulin表達顯著升高,且這種升高與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。α-tubulin被認為是癌癥分級和預后的生物標志物?？傊?SFNs介導α-tubulin降解,導致微管斷裂,癌細胞凋亡。作為微管的主要成分,α-tubulin在細胞運動、有絲分裂、細胞內(nèi)運輸、細胞骨架重塑和細胞周期中發(fā)揮重要作用。SFNs還能降低膠質(zhì)母細胞瘤G0/G1期CDK4/CDK6的表達,降低G2/M期α-tubulin的表達[3]。通過分析TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫,膠質(zhì)瘤中CDK4/CDK6和α-tubulin的mRNA表達顯著高于正常組織,并與病理分級和臨床預后顯著相關(guān)[3]。蛋白印跡分析顯示,在U87MG和U373MG人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞中,SFNs下調(diào)α-tubulin,導致微管破壞和聚集,同時CDK4/CDK6與G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1)的共定位顯著降低[3]。此外,SFNs下調(diào)CDK4/CDK6和p-Rb,這種下調(diào)被ERK1/2阻斷劑PD98059逆轉(zhuǎn),表明這種下調(diào)由活化的ERK1/2介導。蛋白酶體抑制劑MG132逆轉(zhuǎn)CDK4/CDK6和p-Rb的減少;類似地,SFNs對26S蛋白酶體的上調(diào)被PD98059逆轉(zhuǎn)[3]。這些研究表明,SFNs通過磷酸化ERK1/2增加了蛋白酶體降解功能,降低了CDK4/CDK6和p-Rb表達,導致細胞周期停滯。筆者還發(fā)現(xiàn)PD98059逆轉(zhuǎn)了SFNs誘導的細胞凋亡,表明SFNs通過活化ERK1/2調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達誘導細胞凋亡。

微管解聚加劇微管動力學不穩(wěn)定性,抑制微管聚合。與α-tubulin類似,微管不穩(wěn)定蛋白stathmin1(oncoprotein18)N末端有多個磷酸化位點,C末端能與α-tubulin/β-tubulin二聚體結(jié)合形成三聚體復合物,抑制微管聚合,是另一個潛在的抗癌靶點[15]。stathmin1表達也與惡性腫瘤分級和不良預后相關(guān),磷酸化ERK1/2促使stathmin1磷酸化增加,細胞總stathmin1降低, 加劇微管解聚,促進細胞凋亡[16]。

許多細胞質(zhì)蛋白都能和α-tubulin相互作用,這可能是因為微管擔負運輸?shù)鞍踪|(zhì)的使命。熱休克蛋白70(heat shock protein 70, Hsp70)也能和α-tubulin發(fā)生作用,調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能[6]。經(jīng)蛋白酶剪切受損的蛋白質(zhì)能被分子伴侶蛋白Hsp70重新折疊、運輸、加工以維持細胞的活性。Hsp70在惡性腫瘤中高度表達與腫瘤發(fā)生和演進有關(guān)。過度表達Hsp70可維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài),防止化學藥物引起的細胞死亡[17]。通過siRNA敲減Hsp70可增加細胞對藥物的敏感性。免疫熒光染色顯示,SFNs磷酸化ERK1/2上調(diào)Hsp70[6,18]。共聚焦顯微鏡和免疫沉淀分析[6]表明,SFNs促進Hsp70與α-tubulin共定位和相互作用;敲減Hsp70可增強SFNs誘導的微管斷裂,降低LC3 Ⅱ/Ⅰ,促進細胞凋亡。組織芯片[6]分析也顯示,α-tubulin或Hsp70表達增加與NSCLC惡性分級相關(guān),表明α-tubulin和Hsp70同為SFNs識別的兩個關(guān)鍵靶點,Hsp70可能與α-tubulin協(xié)作調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)。LC3Ⅱ是另一種微管相關(guān)蛋白,是公認的自噬標志物。微管聚合促進細胞器或蛋白質(zhì)沿著微管軌道運輸,微管相關(guān)蛋白LC3Ⅱ結(jié)合自噬體沿著微管軌道移動,與溶酶體融合形成自噬溶酶體[19]。自噬有利于清除細胞內(nèi)受損蛋白質(zhì),維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。筆者用SFNs處理細胞,α-tubulin、β-tubulin、LC3Ⅱ和Hsp70都能易位到線粒體上。蛋白前體可與線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,TOM)和內(nèi)膜(inner mitochondrial membrane,TIM)上的跨膜轉(zhuǎn)位蛋白形成復合體,即TOM復合物和TIM復合物,將蛋白前體轉(zhuǎn)位到線粒體基質(zhì)內(nèi)進行折疊[20]。TOM復合物家族成員之一——外膜轉(zhuǎn)位蛋白TOMM20將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運給內(nèi)膜TIM復合物。TIM復合物的核心亞基TIMM23和TIMM17A可與線粒體內(nèi)源Hsp70(mitochondrial Hsp70,mtHsp70)結(jié)合,使被轉(zhuǎn)位的蛋白質(zhì)進入線粒體基質(zhì)[21]。在酵母細胞中,TIMM23通過其C端結(jié)構(gòu)域錨著在內(nèi)膜上,而其N端則延伸至外膜表面,發(fā)揮蛋白受體作用[22]。因此,TIMM23和TIMM17A接受TOMM20轉(zhuǎn)位來的蛋白,將被轉(zhuǎn)位的蛋白交給線粒體基質(zhì)受體mtHsp70, 完成了從微管到線粒體的蛋白質(zhì)運輸過程[22]。因此,細胞凋亡與線粒體蛋白輸入有著必然聯(lián)系。

2 SFNs破壞線粒體動力學導致線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)失衡

線粒體大約提供細胞能量的80%,維持線粒體蛋白穩(wěn)定才能保證細胞正常代謝。細胞質(zhì)蛋白前體和受損蛋白被微管運輸?shù)骄€粒體加工成成熟的蛋白質(zhì)或被降解清除[23]。除了經(jīng)泛素蛋白酶體降解,線粒體蛋白酶水解和線粒體自噬溶酶體清除不能折疊的蛋白是維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)的重要途徑[24]。線粒體離子肽酶 1(lon peptidase 1,LONP1)是線粒體基質(zhì)中的主要蛋白酶之一,是線粒體看門蛋白(gatekeeper)[25]。在正常細胞中LONP1能夠與線粒體跨膜轉(zhuǎn)位蛋白及被輸入的細胞質(zhì)蛋白形成轉(zhuǎn)位復合體,負責將未折疊或受損的蛋白質(zhì)導入線粒體基質(zhì), 并且還能利用自身的蛋白水解酶活性降解不能折疊的蛋白,保證線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)[25]。線粒體基質(zhì)中含有近500種多肽,幾乎都是從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體。三種保守的蛋白酶LONP1、ClpXP和m-AAA負責折疊或降解這些輸入的線粒體基質(zhì)蛋白[25]。LONP1可結(jié)合從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入的線粒體蛋白,增加其可溶性,抑制基質(zhì)蛋白集聚[26]。在腫瘤細胞中,LONP1也可以降解異常或損傷的蛋白,維持細胞線粒體蛋白的穩(wěn)定。LONP1在多種腫瘤細胞,例如在NSCLC細胞中高表達[27]。LONP1 過度表達有利于線粒體代謝,促進NSCLC細胞增殖。使用LONP1抑制劑或通過敲減LONP1可導致線粒體基質(zhì)蛋白集聚,細胞氧化磷酸化活性降低,促進凋亡[28]。筆者發(fā)現(xiàn)SFNs介導了LONP1下調(diào)以及線粒體蛋白水解酶caspase3活化。報道[29]顯示,LONP1降低可導致caspase3活化,結(jié)果產(chǎn)生大量受損的蛋白質(zhì)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)導致細胞凋亡。這說明SFNs可以通過調(diào)節(jié)線粒體蛋白酶,破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài),導致細胞凋亡。

再次，在民間，成立于2015年的Copykiller公司作為“韓國研究財團”指定的學術(shù)研究倫理道德教育機構(gòu)，也是開展高校教師學術(shù)道德教育的一支重要力量，每年承擔著大量學術(shù)道德教育課程，發(fā)揮著不可代替的作用。此外，韓國的“學術(shù)道德信息中心”“國家生命倫理政策研究院生命科學研究倫理書齋”以及“高等院校教育協(xié)議會”等政府外圍機構(gòu)也承擔著部分高校教師學術(shù)道德教育工作。

經(jīng)由我院倫理委員會批準從本院2010年1月至2017年12月接受的終末期糖尿病腎病血液透析患者中,抽取52名,隨機將其分為對照組與觀察組,均26例。對照組中,男14例,女12例,年齡48~75歲,平均年齡(61.5±13.5)歲,病程2~5年,平均病程(3.5±1.5)年。觀察組中,男14例,女12例,年齡47~75歲,平均年齡(61±14)歲,病程2.5~4.5年,平均病程(3.5±1.5)年;兩組一般資料比較結(jié)果p>0.05,可作比較。

3 SFNs誘導自噬體累積導致線粒體代謝障礙和線粒體損傷

進一步研究[35]顯示,線粒體上LC3Ⅱ 可能通過結(jié)合溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)形成線粒體自噬溶酶體。SFNs與溶酶體抑制劑巴佛洛霉素A1聯(lián)合降低LAMP1與LC3Ⅱ的共定位,阻斷自噬體和線粒體溶酶體融合,導致線粒體自噬體積累。最終,SFNs引發(fā)微管功能障礙,誘導自噬體累積,線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡,細胞凋亡。此外,免疫共沉淀顯示,α-tubulin可能與Hsp70、FASN、ACACA、ACLY和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4(6-phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 4,PFKFB4)等蛋白相互作用。在線粒體中未檢測到26S蛋白酶體,但caspase3被證實能切割線粒體結(jié)合的α-tubulin。SFNs激活線粒體caspase3,剪切α-tubulin,降解α-tubulin/β-tubulin二聚體。組織芯片分析[6]顯示,α-tubulin可增加促進癌癥惡性表型。因此,α-tubulin的降解或剪切可能導致細胞骨架解體、增加凋亡小體的形成,抑制細胞周期的進展和細胞運動。在亞細胞水平,SFNs誘導線粒體蛋白質(zhì)損傷和抑制線粒體自噬溶酶體形成可能導致線粒體腫脹。因此,微管動力學的不平衡可能干擾從細胞質(zhì)到線粒體的信號傳遞。胞質(zhì)Hsp70可對SFNs刺激作出快速反應,以保持蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定或運輸錯誤折疊的蛋白質(zhì)進入線粒體進行降解。筆者還發(fā)現(xiàn),SFNs促進α-tubulin與LC3Ⅱ的結(jié)合,同時降低α-tubulin與TOMM20、TIMM23和TIMM17A線粒體膜轉(zhuǎn)運蛋白的相互作用。因此,SFNs抑制自噬體溶酶體的形成可以降低錯誤折疊的蛋白在線粒體的降解,從而導致自噬體中受損的蛋白累積。線粒體膜中的磷脂主要是心磷脂,位于線粒體內(nèi)膜上,當線粒體受損時轉(zhuǎn)移到外膜,觸發(fā)線粒體自噬。筆者發(fā)現(xiàn),用線粒體自噬誘導劑羰基氰化物間氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)處理后,總游離脂肪酸(fatty acid,FA)和線粒體磷脂反向增加[2]。這提示SFNs可降低線粒體中的磷脂水平,從而破壞線粒體膜。NIX和BNIP3都位于線粒體外膜上,這兩種蛋白質(zhì)直接與自噬體膜蛋白LC3Ⅱ相互作用。NIX招募LC3Ⅱ至受損線粒體。SFNs下調(diào)NIX和BNIP3,上調(diào)線粒體相關(guān)的LC3Ⅱ、并抑制NIX與LC3Ⅱ的相互作用,表明SFNs可能抑制自噬溶酶體的形成[2]。因此,SFNs可能通過抑制FA生產(chǎn)和微管介導的線粒體自噬體形成導致線粒體損傷,細胞凋亡(圖1)。

微管對形成成熟自噬體至關(guān)重要。α-tubulin和β-tubulin被證明是線粒體膜的固有成分,是自噬體與溶酶體融合的必需通道[30]。阻斷自噬體與溶酶體融合可導致自噬體降解能力減弱、LC3Ⅱ累積和細胞凋亡。筆者的研究[5]證明,SFNs上調(diào)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達,引起自噬體累積,導致NSCLC細胞凋亡[5]。作為細胞骨架成分,微管負責線粒體的運動、運輸和線粒體自噬。微管動力蛋白dynein/dynactin可以調(diào)節(jié)線粒體裂解蛋白Drp1在線粒體上募集[31];微管抑制劑紫杉醇可以誘導線粒體通透轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開放,促進凋亡[32]。在H9c2心肌細胞,微管結(jié)構(gòu)異?？梢詫е戮€粒體片段化[32]。同為微管抑制劑,SFNs導致線粒體膜電位降低。用SFNs(15 μmol/L)處理細胞24 h后,線粒體出現(xiàn)腫脹和片段化。LC3Ⅱ能與微管相關(guān)蛋白相互作用,并沿著微管運動與溶酶體膜蛋白結(jié)合,有利于形成自噬溶酶體[19];微管的損傷阻礙自噬溶酶體的形成,導致線粒體代謝異常、細胞凋亡[33]。線粒體自噬有助于清除受損的線粒體或蛋白以維持線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。抑制線粒體自噬可以持續(xù)產(chǎn)生ROS,導致線粒體損傷[34]。線粒體膜電位的降低是線粒體自噬的信號,去極化的線粒體可穩(wěn)定線粒體外膜上的PINK1,隨后募集Parkin到線粒體,介導蛋白質(zhì)泛素化降解受損線粒體[34]。反之,PINK1和Parkin蛋白的基因突變可導致多種疾病。損傷蛋白過度累積可導致線粒體膜電位的降低以及線粒體的腫脹和破裂。

SFNs介導自噬體形成,阻斷自噬體與溶酶體的融合,導致自噬體累積。這些變化可能涉及多種信號通路。HPLC-MS/MS[2]表明,SFNs調(diào)節(jié)脂蛋白的表達;高表達脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)與癌癥惡性程度和不良預后相關(guān)。SFNs通過激活26S蛋白酶體下調(diào)FASN、乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl coenzyme A carboxylase alpha,ACACA)和ATP檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACLY)表達;SFN抑制α-tubulin與FASN、ACACA或ACLY的相互作用;SFNs還降低細胞內(nèi)脂肪酸的產(chǎn)生;敲減FASN可增加線粒體異常和細胞凋亡[2]。此外,SFNs降低線粒體自噬相關(guān)蛋白NIX和BNIP3及其相互作用,以及NIX和LC3Ⅱ之間的相互作用。因此,SFNs通過抑制微管介導的脂蛋白活性以及抑制溶酶體與自噬體的融合而導致細胞凋亡[2]。

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圖1 SFNs 干擾微管與線粒體動力學抗腫瘤機制信號轉(zhuǎn)導示意圖Fig.1 Signaling map that SFNs cause apoptosis by interfering with microtubules and mitochondrial dynamics in cancer cells

4 SFNs的應用前景和展望

細胞培養(yǎng)對腫瘤細胞的抑制濃度(15 μmol/L)限制了SFNs用于臨床試驗。然而,筆者的研究[7]證明,SFNs與其他抗癌藥物,如紫杉醇聯(lián)合會將SFNs的有效抑制濃度降低到2 μmol/L,便于臨床研究。此外,通過修飾該分子的化學基團或建立新的SFN納米分子可能會提高工作效率并降低有效濃度。事實上,筆者近期的研究(待發(fā)表)顯示SFNs在NSCLC和腦膠質(zhì)瘤細胞中誘導糖酵解酶PFKFB4下調(diào)。PFKFB4在許多腫瘤中高度表達,其水平與腫瘤惡性程度有關(guān),因此,SFNs不僅是潛在的候選抗癌藥物,而且可能是葡萄糖控制器[36]。SFNs抑制癌細胞信號轉(zhuǎn)導的研究,將幫助我們了解癌細胞運動、生長、自噬及亞細胞代謝等,以便設計更有效的藥物來治療癌癥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明周妍:整理資料,撰寫修改論文;吳巍:提出文章整體思路,撰寫論文,總體把關(guān)和修訂論文。