鐵死亡在1型糖尿病心肌病小鼠心功能障礙中的作用

盧清 和鳳 王文秋 王焱林 柯劍娟

糖尿病心肌?。―CM）是指無法用冠狀動脈疾病、高血壓和瓣膜病解釋的糖尿病心肌損傷，是糖尿病患者晚期死亡的主要原因[1-3]。DCM 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與許多因素，包括高血糖、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷、微血管病變、心肌細(xì)胞肥大和纖維化等有關(guān)，最終引起心功能障礙甚至心力衰竭[4]。DCM 的治療主要采用常規(guī)抗心力衰竭療法，強(qiáng)化降糖治療并沒有改善糖尿病患者心功能。鐵死亡是指鐵依賴的脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞死亡[5]。研究證實(shí)，糖尿病腎病、糖尿病性骨質(zhì)疏松、糖尿病視網(wǎng)膜病變等與鐵死亡關(guān)系密切，抑制鐵死亡可以減輕糖尿病相關(guān)并發(fā)癥[6-9]。研究表明，高糖培養(yǎng)后的心肌細(xì)胞損傷和2 型糖尿病的DCM 均有鐵死亡參與[10-11]。然而，目前尚不清楚鐵死亡是否參與1 型糖尿病DCM 所致的心功能障礙。本研究探討鐵死亡在1 型糖尿病DCM 小鼠心功能障礙中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

清潔級健康雄性C57BL/6 小鼠36 只，8 周齡，體質(zhì)量22～26 g，由湖北省疾控中心提供。純度99.59%的鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）購于MedChemExpress 公司；鏈脲佐菌素（STZ）購于北京索萊寶科技有限公司；穩(wěn)豪倍易血糖儀購買于強(qiáng)生（中國）醫(yī)療器械有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；電鏡固定液、ECL超敏發(fā)光液購于武漢普美克生物技術(shù)有限公司；兔抗谷胱甘肽還原酶4（GPX4）、酯酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）、GAPDH 抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗購于武漢愛博泰克（ABclonal）生物科技有限公司；Hitachi HT7700 透射電鏡由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部結(jié)構(gòu)中心平臺提供；小鼠心臟超聲機(jī)由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 分組及處理方法

采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對照組、DCM組和Fer-1 組，每組各12 只。DCM 組和Fer-1 組采用連續(xù)5 d 腹腔注射新鮮制備的STZ 40 mg/（kg·d）后繼續(xù)飼養(yǎng)12 周的方法建立1 型糖尿病DCM 小鼠模型。注射STZ 1 周后測量血糖高于16.7 mmol/L，小鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降的臨床癥狀，第12 周末超聲心動圖檢測示心功能障礙，則模型構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)初期及飼養(yǎng)期間，每2 周對所有小鼠稱量體質(zhì)量和測量血糖，自建模起第2 周末Fer-1 組小鼠開始連續(xù)腹腔注射鐵死亡抑制劑Fer-1 2.5 μmol/（kg·d），對照組和DCM 組腹腔注射等量DMSO，3 組小鼠的腹腔注射均持續(xù)到第12 周末。

1.3 超聲心動圖檢查

自建模起第12 周末，將小鼠胸部脫毛，置于恒溫檢測臺上，使用1%戊巴比妥鈉麻醉，心率波動在400～500 次/min 時(shí)，使用小鼠專用高頻超聲探頭，經(jīng)胸骨旁左室長軸切面檢測小鼠心臟結(jié)構(gòu)及心功能情況，檢測期間采集3 個(gè)及以上連續(xù)穩(wěn)定的心動周期圖像，測量并記錄左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVDs），計(jì)算左室短軸縮短率（LVFS）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.4 心肌組織蘇木精-伊紅染色

心臟超聲檢查結(jié)束后處死小鼠，取小鼠心肌組織，放入4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后切片，利用二甲苯和梯度酒精對石蠟切片進(jìn)行脫蠟處理，按照試劑盒所示步驟進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，使用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 透射電鏡觀察小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)

將小鼠心肌組織切成1 mm3組織塊，以2.5%戊二醛溶液固定24 h，放入1%鋨酸固定1.5 h 后梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成厚約70 nm 的超薄切片，行枸櫞酸鉛-醋酸鈾雙重染色，Hitachi HT7700 透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。

1.6 Western blot法檢測小鼠心肌組織中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)

RIPA 裂解液提取心肌組織蛋白，BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量并調(diào)整樣品濃度至1 g/L。取蛋白進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），100 V 穩(wěn)壓電泳1.5 h，100 V 穩(wěn)壓轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入GPX4、ACSL4、GAPDH 一抗（1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000 稀釋），室溫孵育1 h，ECL 超敏發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像，使用ImageJ 軟件分析測定條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)水平＝目的蛋白條帶值/內(nèi)參條帶值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在體1型糖尿病DCM小鼠模型評估

自建模起第2 周末，DCM 組小鼠血糖均高于16.7 mmol/L，并出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降的癥狀，第12 周末，超聲心動圖檢測示LVDd、LVDs 均明顯升高，LVFS、LVEF 均明顯降低（P均＜0.05），提示在體1 型糖尿病DCM 小鼠模型建立成功。與DCM 組比較，F(xiàn)er-1 組小鼠心功能受損得到緩解，表現(xiàn)為LVDd、LVDs 均明顯降低，LVFS、LVEF 均明顯升高（P均＜0.05）。見圖1、圖2、表1。

表1 3組小鼠血流動力學(xué)變化情況比較

圖1 3組小鼠血糖變化情況比較

圖2 3組小鼠體質(zhì)量變化情況比較

2.2 Fer-1改善1型糖尿病DCM小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化

對照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維呈束狀排列，結(jié)構(gòu)均勻，細(xì)胞間質(zhì)無明顯水腫和結(jié)締組織增生；DCM 組小鼠心肌細(xì)胞肥大且排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤；Fer-1 組心肌細(xì)胞排列較為規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤程度較輕。見圖3。

圖3 3組小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化情況（HE染色,×400）

2.3 Fer-1改善1型糖尿病DCM小鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)

對照組小鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯線粒體嵴斷裂，未見線粒體內(nèi)外膜消失；DCM 組小鼠心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，包括線粒體變小，膜密度增高，線粒體皺縮，線粒體嵴減少或消失；Fer-1 組線粒體結(jié)構(gòu)改變較輕。見圖4。

圖4 3組小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化情況（枸櫞酸鉛-醋酸鈾雙重染色,×6 000）

2.4 Fer-1調(diào)控1型糖尿病DCM小鼠心肌組織中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)

與對照組比較，DCM 組小鼠心肌組織中GPX4 的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，ACSL4 的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P均＜0.05）；與DCM 組比較，F(xiàn)er-1 組小鼠心肌組織中GPX4 的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，ACSL4 的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P均＜0.05）。見圖5、表2。

表2 3組DCM小鼠心肌組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

圖5 3組小鼠心肌組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

DCM 是不同于高血壓和冠狀動脈疾病的一類特異性心肌病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與糖代謝及脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)紊亂、細(xì)胞凋亡等有關(guān)，這些因素相互作用導(dǎo)致心肌出現(xiàn)病理改變，形成病理性惡性循環(huán)，最終發(fā)展為心功能障礙甚至心力衰竭[4]。本研究結(jié)果顯示，DCM 組小鼠心肌細(xì)胞肥大且排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，左心功能明顯受損，表現(xiàn)為LVDd、LVDs 均明顯升高，LVFS、LVEF 均明顯降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[12-13]。

DCM 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激被認(rèn)為在DCM 發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[14-15]。鐵死亡主要機(jī)制是細(xì)胞膜高表達(dá)的不飽和脂肪酸在二價(jià)鐵或脂氧化酶的作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)活性氧增加，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。鐵死亡時(shí)線粒體發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，包括線粒體變小，膜密度增高，線粒體皺縮，線粒體嵴減少或消失[8]。有研究表明，GPX4是維持還原型和氧化型谷胱甘肽平衡的關(guān)鍵酶，它在誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生中扮演著至關(guān)重要的作用。GPX4 表達(dá)減少時(shí)，抗氧化能力降低，細(xì)胞膜磷脂易受到活性氧攻擊，發(fā)生脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物為丙二醛和4-羥基壬烯醛，易與蛋白和DNA 形成加合物，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，誘發(fā)鐵死亡[16-17]。ACSL4 是重要的參與多不飽和脂肪酸代謝的同工酶，ACSL4 酯化游離脂肪酸中的CoA，形成的?；疌oA，進(jìn)一步激活參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的相應(yīng)脂肪酸。有研究表明，ACSL4 可以作為在不同細(xì)胞環(huán)境中鐵死亡敏感性的預(yù)測指標(biāo)[18]。綜上所述，ACSL4 和GPX4 分別是鐵死亡的正性和負(fù)性調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果顯示，1 型糖尿病DCM小鼠左心功能明顯受損，心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，心肌組織中GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯下降，ACSL4 蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示1 型糖尿病DCM 小鼠心功能障礙與鐵死亡有關(guān)。

本研究參照文獻(xiàn)[8]，選擇鐵死亡抑制劑Fer-1的給藥途徑、劑量和時(shí)機(jī)。已有研究表明，F(xiàn)er-1在糖尿病腎病、糖尿病性骨質(zhì)疏松和糖尿病視網(wǎng)膜病變中具有保護(hù)作用[6-9]。在本研究中，F(xiàn)er-1 可以有效改善DCM 左心功能，還能夠減輕DCM 小鼠心肌組織的病理損傷，這對改善DCM 小鼠不良預(yù)后具有重要意義。Fer-1 能夠顯著上調(diào)GPX4 蛋白表達(dá)水平，顯著下調(diào)ACSL4 蛋白表達(dá)水平，提示鐵死亡參與了1 型糖尿病小鼠心功能障礙的發(fā)病過程。

綜上所述，本研究證實(shí)鐵死亡參與了1 型糖尿病DCM 小鼠心功能障礙的發(fā)病過程，抑制鐵死亡可以改善1 型糖尿病DCM 小鼠的心功能障礙。