腺苷A2a受體/Krüppel樣因子5對缺血再灌注損傷大鼠心肌的影響

杜鵬輝 周琦 張貽鳳

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是一個復雜的病理生理過程，涉及氧化應激、炎性反應和細胞凋亡等過程[1]。既往研究表明，激活腺苷A2a 受體可減輕MIRI，其機制可能與激活受損心肌細胞自噬有關[2]。Krüppel 樣因子（KLF）5 是KLFs 家族中的重要一員，作為一種鋅指蛋白類轉錄因子，KLF5通過對靶基因轉錄水平的調控，在細胞凋亡、細胞自噬、炎性反應、心肌肥大及心肌纖維化中發(fā)揮重要作用[3-5]。MIRI 促進心肌細胞的凋亡、自噬和炎性反應，與心肌肥大、心肌纖維化等密切相關[6-8]，因此KLF5 可能在MIRI 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究擬通過觀察在MIRI 中激活腺苷A2a受體時KLF5 的變化趨勢，探究大鼠心肌缺血再灌注時腺苷A2a 與KLF5 的關系，為臨床治療或減輕MIRI 提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

腺苷A2a 受體特異性激動劑CGS21680（HY-13201A）和腺苷A2a 受體特異性拮抗劑ZM241385（HY-19532）購于美國MedChemExpress 公司；心肌肌鈣蛋白I（cTnI）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（HA1818L5S1）和重組人成纖維細胞生長因子21（FGF21）ELISA 試劑盒（ab223589）購于武漢華美生物工程有限公司；TTC 染液、抗KLF5抗體購于美國Sigma公司；抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體、抗白細胞介素（IL）-1β 抗體、抗GAPDH 抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司；山羊抗兔IgG 二抗購于武漢普美克生物技術有限公司。小動物呼吸機（ZS-MV-HX）購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司。

1.2 實驗動物及分組

42 只SPF 級健康雄性Sprague-Dawley 大鼠購自湖北省疾控中心。實驗動物生產許可證號：SYXK(鄂)2015-0025，體質量250～300 g，飼養(yǎng)于通風良好的SPF 級屏障環(huán)境下，相對濕度50%～60%、溫度（22±2）℃，日光燈照明，每天保持12 h 照明和12 h 黑暗，自由飲食。適應性飼養(yǎng)2 d 后，將大鼠隨機分為4 組：假手術組（Sham 組，n＝6）、缺血再灌注組（I/R 組，n＝12）、缺血再灌注＋CGS21680 組（I/R＋CGS 組，n＝12）、缺血再灌注＋ZM241385 組（I/R＋ZM 組，n＝12）。

1.3 心肌缺血再灌注模型的制備

根據(jù)文獻[9-11]的方法制備心肌缺血再灌注模型。大鼠術前禁食禁水12 h 后，稱量體質量；腹腔注射1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉。行氣管切開術后行機械通氣：潮氣量為2.5 mL/100 g，通氣頻率70～80 次/min，吸呼比為1∶1。Ⅱ導聯(lián)連續(xù)監(jiān)測心電圖（ECG），經(jīng)右側頸總動脈連續(xù)測量動脈血壓，于左側第4 肋間開胸暴露心臟，用6-0 無損傷縫線將左冠狀動脈前降支套扎做成活結，當出現(xiàn)心尖部及左心室前壁變白，Ⅱ導聯(lián) ECG 出現(xiàn)ST 段抬高，動脈血壓下降時為結扎冠狀動脈成功。結扎成功后缺血30 min，隨后松開結扎線，可見左心室恢復紅潤，抬高的ST 段相對降低，則表明再灌注模型成功，進行120 min 再灌注處理。

各組處理：Sham 組只穿線不結扎；I/R 組結扎左冠狀動脈前降支30 min 再灌注120 min；I/R＋CGS 組結扎左冠狀動脈前降支30 min 再灌注120 min，并于再灌注前5 min 靜脈注射CGS21680 30 μg/kg 后以3 μg/(kg·min)持續(xù)泵注60 min；I/R＋ZM 組結扎左冠狀動脈前降支30 min再灌注120 min，并于再灌注前5 min 靜脈注射ZM241385 1.5 mg/kg。

1.4 血流動力學指標的監(jiān)測

在實驗過程中，連續(xù)監(jiān)測心率（HR）、收縮壓（SBP）及平均動脈壓（MAP），并計算HR 與SBP的乘積（RPP）作為心肌氧耗指數(shù)[12]。分別于造模前、缺血5 min、再灌注10 min、再灌注45 min及再灌注120 min 時記錄HR、MAP 及RPP。

1.5 血清cTnI、FGF21水平的測定

再灌注結束時，各組隨機取6 只大鼠，經(jīng)股靜脈取血液標本2 mL，于4 ℃下2 000 轉/min 離心15 min，離心半徑12 cm，取上清液，參照ELISA 試劑盒說明書，檢測血清cTnI、FGF21 水平。

1.6 心肌梗死面積的測定

再灌注結束后，各組隨機取6 只大鼠，結扎左冠狀動脈前降支，并經(jīng)股靜脈注射2 mL 1%伊文思藍行心肌染色，待大鼠遠端肢體和口唇被染成藍色后，迅速取下心臟用4℃ PBS 清洗，此時可見正常心肌被染成藍色，梗死邊緣區(qū)和梗死區(qū)心肌則未被染成藍色，將心臟置于－20 ℃凍存60 min 后沿心臟縱軸線切5 片，每片厚1 mm，切片放于1%TTC溶液中，37 ℃水浴鍋中避光孵育15 min，隨后用10%中性福爾馬林液常溫固定過夜，梗死邊緣區(qū)心肌呈磚紅色，梗死區(qū)心肌呈灰白色，采用ImageJ 圖像分析軟件計算各個截面的梗死面積，心肌梗死百分比為心肌梗死區(qū)占心肌梗死區(qū)與梗死邊緣區(qū)之和的比例。

1.7 缺血區(qū)心肌組織KLF5、TNF-α和IL-1β蛋白表達的測定

各組隨機取6 只大鼠，股靜脈取血結束后，過量麻醉處死大鼠，取缺血區(qū)心肌組織標本于－80 ℃冰箱保存。充分裂解心肌組織制備勻漿，煮沸離心后，取上清檢測KLF5 的蛋白表達水平。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白后，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入KLF5 一抗（1∶1 000）、TNF-α 一抗（1∶1 000）、IL-1β 一抗（1∶1 000）和GAPDH 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，加入ECL 混合溶液，曝光、顯影、定影。使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片進行拍照，用ImageJ軟件分析目標條帶的光密度值。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進統(tǒng)計學行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 激活腺苷A2a受體改善缺血再灌注心肌的缺氧狀態(tài)

各組缺血前HR、MAP 及RPP 的差異無統(tǒng)計學意義。Sham 組造模前、缺血5 min、再灌注10 min、再灌注45 min 及再灌注120 min 各時間點HR、MAP 及RPP 的差異無統(tǒng)計學意義。與Sham組比較，I/R 組缺血5min 時HR、MAP 及RPP 降低（P均＜0.05）。與I/R 組比較，I/R＋CGS 組再灌注10 min、再灌注45 min 時HR、MAP 及RPP降低，I/R＋ZM 組再灌注10 min、再灌注45 min時HR、MAP 及RPP 升高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠各時間點血流動力學指標比較

2.2 激活腺苷A2a受體減小缺血再灌注心肌梗死面積

TTC 染色結果顯示，與I/R 組相比，I/R＋CGS組大鼠缺血再灌注損傷心肌的梗死面積百分比明顯降低[（32.6±2.0）%對（53.5±1.3）%，P＜0.05]；I/R＋ZM 組大鼠缺血再灌注損傷心肌的梗死面積百分比為（60.1±1.8）%，較I/R＋CGS 組明顯升高（P＜0.05）。I/R＋ZM 組與I/R 組相比差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 各組缺血再灌注損傷大鼠心臟橫切面的TTC染色

2.3 激活腺苷A2a受體減輕MRI

與Sham 組相比，I/R 組大鼠靜脈血cTnI 水平明顯升高（P＜0.05）。與I/R 組相比，I/R＋CGS 組大鼠靜脈血cTnI 水平明顯降低（P＜0.05），I/R＋ZM 組大鼠靜脈血cTnI 水平明顯升高（P＜0.05）。與Sham 組比較，I/R 組缺血區(qū)心肌組織TNF-α 和IL-1β 表達明顯上調（P均＜0.05）。與I/R 組比較，I/R＋CGS 組缺血區(qū)心肌組織TNF-α 和IL-1β 表達明顯下調，I/R＋ZM 組缺血區(qū)心肌組織TNF-α 和IL-1β 表達明顯上調（P均＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β蛋白表達情況

表2 各組大鼠血cTnI水平及心臟缺血區(qū)心肌組織中TNF-α和IL-1β蛋白表達水平比較

2.4 激活腺苷A2a受體促進心肌細胞損傷后修復

與Sham 組相比，I/R 組和I/R＋ZM 組大鼠的血FGF21 水平均明顯降低[（93±8）pg/mL 和（76±9）pg/mL 對（140±4）pg/mL，P均＜0.05]；與I/R 組相比，I/R＋CGS 組大鼠的血FGF21 水平[（374±13）pg/mL]明顯升高（P＜0.05）。I/R＋ZM 組與I/R組大鼠血FGF21 水平差異無統(tǒng)計學意義。

2.5 激活腺苷A2a受體使KLF5表達下調

與Sham 組相比，I/R 組缺血區(qū)心肌組織KLF5 表達水平明顯升高（0.43±0.02 對0.31±0.01，P＜0.05）。與I/R 組相比，I/R＋CGS 組缺血區(qū)心肌組織KLF5 表達水平（0.20±0.01）明顯降低，I/R＋ZM 組缺血區(qū)心肌組織KLF5 表達水平（0.64±0.02）明顯升高（P均＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠缺血區(qū)心肌組織KLF5蛋白表達情況

3 討論

急性心肌梗死最有效的治療是通過血運重建快速恢復冠狀動脈血流，但同時也可能會導致MIRI，降低血運重建的臨床獲益[13]。目前，MIRI尚無有效的治療方法。既往研究表明腺苷可通過激活心肌細胞表面的腺苷受體（A1、A2a、A2b 和A3），下調Beclin-1 介導的心肌細胞自噬，從而保護心肌細胞，減少MIRI；前期研究表明，激活磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶（PI3K/Akt）信號通路，介導受損心肌細胞自噬，也能起到保護心肌的作用[14-15]。KLF5 通過調控基因轉錄水平調節(jié)細胞自噬、炎性反應及心肌纖維化等重要生理過程，由此可推測激活腺苷A2a 受體可能通過調節(jié)KLF5 的表達而起到抑制MIRI 的作用。

本項研究結果顯示，在大鼠缺血再灌注模型中激活腺苷A2a 受體減少了心肌梗死面積百分比和缺血再灌注部位的炎性因子生成，減輕了缺血再灌注引起的心肌損傷程度，改善了心肌細胞的缺氧狀態(tài)，增強了其修復能力。抑制腺苷A2a 受體可起到相反的效果，由此說明腺苷A2a 受體在MIRI 中有重要意義。FGF21 是一種存在于人體中的成纖維細胞因子，具有調節(jié)新陳代謝、促進血管細胞生長和發(fā)育以及損傷后修復的功能，與炎性反應密切相關。正常情況下，F(xiàn)GF21 在機體中維持一定水平，當MIRI 出現(xiàn)時，血清FGF21 水平減少，予以腺苷A2a 受體激動劑后，F(xiàn)GF21 水平明顯上升，說明激活腺苷A2a 受體可增強心肌細胞的修復能力。同時，激活腺苷A2a 受體后可以觀察到KLF5 的表達明顯下調，已有研究證明心肌細胞中的KLF5 可通過抑制FGF21 表達，改善機體對胰島素的敏感性，調節(jié)白色脂肪的生成，減輕高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的體質量[16]。此外，F(xiàn)GF21 被證實可通過抑制核因子κB（NF-κB）和炎性因子，激活星形膠質細胞中PI3K/Akt 信號通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[17]。由此可見，激活的腺苷A2a 受體可能通過下調缺血再灌注損傷的心肌細胞的KLF5 表達，增加FGF21 表達水平，抑制心肌細胞炎性反應，從而減輕MIRI。

MIRI 主要發(fā)生在再灌注之后，恢復的血流通過紅細胞為缺血心肌組織提供氧氣，導致活性氧（ROS）產生增加[18]。ROS 導致心肌細胞氧化應激，引起DNA 損傷并產生局部炎性反應，炎性級聯(lián)反應和氧化應激隨后引起各種細胞因子大量釋放，導致細胞結構受損而造成再灌注心肌細胞凋亡、死亡等不良結局[19-22]。在脂多糖誘導的急性肺損傷模型中，KLF5 通過上調NF-κBp65 位點的磷酸化，介導ROS 產生，增加促炎性細胞因子的表達[23]。激活腺苷A2a 受體也可能通過下調KLF5 減少ROS 的生成，抑制炎性反應。值得注意的是，再灌注階段的心肌損傷是動態(tài)的，可能會持續(xù)數(shù)天之久，其對心肌的損害逐漸累積[24-25]。因此，了解心肌細胞內激活的腺苷A2a 受體下調KLF5、保護心肌細胞的機制，盡早治療MIRI，能增加患者冠狀動脈血運重建的臨床獲益。

綜上所述，激活腺苷A2a 受體可抑制缺血心肌細胞中KLF5 表達，降低MIRI 程度，減輕心肌細胞缺氧，促進心肌細胞損傷后修復，在大鼠心肌缺血再灌注時發(fā)揮保護作用。