乳酸菌聯(lián)合小球藻對褶皺臂尾輪蟲種群增長的影響

馬青彬 劉芳 梁芳 邢冬飛 孫娜

摘要：為研究乳酸菌聯(lián)合小球藻（Chlorella vulgaris）對褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）種群增長的影響，以盤錦光合蟹業(yè)有限公司輪蟲池冬卵孵化的輪蟲為試驗對象，以小球藻為輪蟲基礎餌料并添加不同濃度的微生態(tài)制劑乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB），設置乳酸菌的濃度梯度為0（對照組）、1×10⁸cells/mL、2×10⁸cells/mL、5×10⁸cells/mL、10×10⁸cells/mL，連續(xù)觀察4d，對輪蟲種群密度、抱卵率和平均增長率等進行統(tǒng)計。結果表明，在輪蟲種群密度起始相同的情況下，添加適宜濃度的乳酸菌處理組輪蟲最大種群密度、抱卵率和平均增長率是同時期對照組的3倍、3倍和5倍（P＜0.05），且能有效降低培養(yǎng)水體pH使其在輪蟲生長適宜范圍內。結果表明以小球藻為輪蟲基礎餌料，添加一定濃度的乳酸菌有利于褶皺臂尾輪蟲的生長繁殖，可以提高輪蟲的種群數(shù)量，促進種群增長。

關鍵詞：乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）；褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）；小球藻（Chlorella vulgaris）；種群密度；種群增長

中圖分類號：S917文獻標志碼：A

褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）屬輪蟲門，單卵巢綱，單巢目，游泳臂尾輪蟲科，臂尾輪蟲屬^[1-2]。其多數(shù)分布在鹽度較高的河口和近海區(qū)域，具有適應能力強、生長快、營養(yǎng)豐富、大小適中、適口性好、游動緩慢等特點，可以大規(guī)模人工培養(yǎng)，適合作為水產(chǎn)動物的開口生物餌料^[3]。目前，輪蟲可以作為60多種海水魚類和近20種甲殼動物的育苗活餌料。隨著種苗培育密度不斷提高，作為優(yōu)質活餌料的海水輪蟲的需求量也不斷增大，能否持續(xù)高效生產(chǎn)輪蟲，已成為種苗培育成敗的關鍵因素。

近些年，微生態(tài)制劑也被應用于褶皺臂尾輪蟲的培育工作中。有研究表明，采用小球藻液、面包酵母和光合細菌混合培育出的褶皺臂尾輪蟲效果較好^[4]；楊質楠等^[5]證實在餌料中添加光合細菌對輪蟲有促生長作用；甘松永^[6]和肖佳華等^[7]也發(fā)現(xiàn)了利用芽孢桿菌作為餌料培養(yǎng)輪蟲是可行的，且有利于輪蟲的生長并提高輪蟲的種群數(shù)量。以往研究多是光合細菌和芽孢桿菌等在輪蟲培育中的應用，而乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）用于輪蟲培育的研究很少。該實驗通過利用乳酸菌聯(lián)合小球藻混合投喂輪蟲，觀察其種群增長變化，探究乳酸菌投喂輪蟲的適宜濃度，為輪蟲高效生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

褶皺臂尾輪蟲由盤錦光合蟹業(yè)有限公司輪蟲池冬卵提供；培育海水為天然海水，鹽度20‰；微生態(tài)制劑乳酸菌由運城市鹽湖區(qū)鴻翔水處理制藥廠生產(chǎn)；小球藻由盤錦光合蟹業(yè)有限公司小球藻池提供。

1.2 方法

1.2.1 輪蟲孵化

用輪蟲冬卵進行孵化，將輪蟲卵放入裝有500mL、鹽度20‰的天然海水的燒瓶中，放置在生化培養(yǎng)箱中孵化，孵化溫度25℃，時間1d。孵化完成后，選取活力較好且不帶卵的輪蟲按照2ind./mL的接種密度放入500mL燒杯中進行實驗。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵

實驗前，先將乳酸菌進行培養(yǎng)。乳酸菌培養(yǎng)方法：稱取1.25g菌粉、15g紅糖充分溶解到500mL蒸餾水中，培養(yǎng)溫度25℃，發(fā)酵1d后，測量pH在3～4之間可用，顯微鏡下血球計數(shù)板定量乳酸菌濃度為5×10⁷ cells/mL。

1.2.3 試驗設計

將15個500mL燒杯分成5個實驗組，每組3個平行。每個燒杯均添加定量的小球藻，不同的乳酸菌添加量，混合均勻，在不充氣、不換水、水溫控制在25℃、光照正常條件下進行培養(yǎng)。每24hrs對燒杯中輪蟲種群進行取樣計數(shù)，計算輪蟲抱卵率P和平均增長率R，并檢測其培養(yǎng)水體的水化指標。分組情況見表1。

1.2.4 種群增長相關的測定

每24hrs從每一個燒杯中隨機吸取1.0mL輪蟲培養(yǎng)液，加碘液固定后計數(shù)每毫升培養(yǎng)液輪蟲數(shù)量、輪蟲卵數(shù)，重復3次。

1.2.5 培養(yǎng)水體水化指標的測定

用pH計測定培養(yǎng)水體pH，每一個燒杯測3次，取平均值。用便攜溶氧儀測定水體溶解氧。

1.2.6 試驗計算

平均增長率R：

N0表示實驗初始輪蟲種群密度；Nt表示實驗結束時輪蟲種群密度；t表示試驗天數(shù)。

輪蟲抱卵率P＝（輪蟲卵的總數(shù)/輪蟲總數(shù)）×100％

1.3 統(tǒng)計分析

應用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較各試驗組的種群密度、抱卵率、平均增長率及水化指標值的差異顯著性；用Duncan多重比較檢驗對比各處理間的均值，差異顯著性水平（P）值設為0.05，結果采用“均值±標準誤”表示。采用IBM SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。

2 結果

2.1 乳酸菌聯(lián)合小球藻對輪蟲種群密度的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻投喂輪蟲對其種群密度的影響變化見圖1。結果顯示，在輪蟲種群起始密度相同的情況下，從開始到培養(yǎng)結束，各個實驗組均有不同程度的種群密度增加，其中處理組D在培養(yǎng)時期種群密度都高于其他實驗組，而處理組E在培養(yǎng)后期階段種群密度明顯小于其他實驗組。培養(yǎng)1d時，處理組D與其他組之間差異顯著（P＜0.05），種群密度明顯高于其他實驗組，處理組B、C、E與對照組A之間差異不顯著（P＞0.05），種群密度相當；培養(yǎng)2d時，處理組B、C、D、E與對照組A之間差異顯著（P＜0.05），處理組較對照組都有明顯的種群密度增多，其中處理組D與其他實驗組有明顯的差異顯著（P＜0.05），其種群密度是同時期對照組A的3倍左右；培養(yǎng)3d時，處理組D與其他實驗組之間差異顯著（P＜0.05），是同時期對照組A種群密度的2.5倍左右，而處理組E的種群密度已經(jīng)低于其他實驗組；培養(yǎng)4d時，處理組B、C、D、E之間差異顯著（P＜0.05），對照組A和處理組E之間也差異顯著（P＜0.05），且處理組E種群密度遠低于對照組A，照組A和處理組B之間差異不顯著（P＞0.05），且種群密度接近。

2.2 乳酸菌聯(lián)合小球藻對輪蟲種群抱卵率的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻投喂輪蟲對其種群抱卵率的影響變化見圖2。結果顯示，在種群起始密度均等的情況下，對照組和處理組的種群抱卵率整體都是呈上升然后下降趨勢，其中處理組D的種群抱卵率在培養(yǎng)期間明顯高于其他實驗組。培養(yǎng)1d時，處理組C、D、E與對照組A之間差異顯著（P＜0.05），處理組D的種群抱卵率是對照組A的2.5倍，且在同時期的實驗組中抱卵率最高達到60%，處理組B和對照組A種群抱卵率相當；培養(yǎng)2d時，處理組D與其他實驗組之間差異顯著（P＜0.05），其種群抱卵率達到80%，是同時期其他實驗組的2倍；培養(yǎng)3d時，處理組D抱卵率達到最高值，在130%左右，是對照組A的3倍左右，其余處理組種群抱卵率也比對照組要高；培養(yǎng)4d時，實驗組出都現(xiàn)了不同程度的種群抱卵率下降，但處理組D的抱卵率還是最高的。

2.3 乳酸菌聯(lián)合小球藻對輪蟲種群平均增長率的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻投喂輪蟲對其種群平均增長率的影響變化見圖3。結果顯示，在種群起始密度均等的情況下，不同乳酸菌接入量的實驗組其種群平均增長率也不同，但整體呈上升趨勢。處理組D相比較其他實驗組有明顯的增長趨勢，而處理組E隨著培養(yǎng)進行到后期，其種群平均增長率明顯低于其他實驗組。培養(yǎng)1d時，處理組D與其他實驗組之間差異顯著（P＜0.05），且平均增長率明顯高于其他組太多，接近60%，是處理組B、C、E平均的2.5倍，是對照組平均正常率的5倍；培養(yǎng)2d時，處理組與對照組之間差異顯著（P＜0.05），且處理組D與其他組之間也差異顯著（P＜0.05），平均增長率達到80%，是對照組的2.5倍左右；培養(yǎng)3d時，處理組D平均增長率趨近平緩，處理組E增長出現(xiàn)緩慢，其平均增長率小于其他對照組、遠小于其他處理組；培養(yǎng)4d時，處理組平均增長率無明顯增長，趨近平緩。處理組D與其他實驗組之間相互都差異顯著（P＜0.05），平均增長率處于最高值在80%以上。

2.4 乳酸菌聯(lián)合小球藻對輪蟲培養(yǎng)水體pH值的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻對輪蟲培養(yǎng)水體pH的影響變化見圖4。結果顯示，由于乳酸菌為酸性物質，其實添加量決定其起始pH，乳酸菌加入量多對應其實驗組pH更低，按pH從大到小依次是對照組A、處理組B、處理組C、處理組D、處理組E。培養(yǎng)4d后，所有實驗組整體pH都出現(xiàn)了不同程度的升高。在1d培養(yǎng)后，對照組A出現(xiàn)小幅度的升高，其他實驗組都出現(xiàn)不同程度的升高，其中處理組E升高最多到8.0左右，處理組E從5.8升高到7.8。在之后的3d培養(yǎng)中，對照組A升高程度趨近平緩數(shù)值在10.0以上；處理組B和C升高程度相似均達到9.5以上；處理組D升高到9左右；處理組E一直在8.5以下。

2.5 乳酸菌聯(lián)合小球藻對輪蟲培養(yǎng)水體溶解氧的影響

乳酸菌聯(lián)合小球藻對輪蟲培養(yǎng)水體溶解氧的影響變化見圖5。結果顯示，隨著培養(yǎng)的進行，實驗組溶解氧均出現(xiàn)了下降，其中處理組E下降最快，最低值已經(jīng)低于5.0mg/L。在第1d培養(yǎng)后，除實驗組E下降其他實驗組均升高，溶解氧均在18mg/L以上。培養(yǎng)2d時，處理組B、C、D與對照組A和處理組E之間差異顯著（P＜0.05），處理組E已下降10mg/L以下。培養(yǎng)第3d和第4d，各實驗組溶解氧均出現(xiàn)降低，處理組E下降最多，到第4d時下降到5.0mg/L以下，其他實驗組均在10mg/L左右。

3 討論

目前在輪蟲的高密度培養(yǎng)中，微藻類作為主要生物餌料，其中小球藻是適合輪蟲大規(guī)模培育的優(yōu)質餌料，它雖含有輪蟲生長所需的某些非必需氨基酸和脂肪酸^[8]，但因單一藻類的營養(yǎng)價值有限，不能更高效地生產(chǎn)輪蟲，隨之微生態(tài)制劑與藻類的搭配的研究也逐漸增多。該試驗對微生態(tài)制劑乳酸菌聯(lián)合小球藻投喂輪蟲進行研究。試驗結果表明，在小球藻作為主體餌料濃度一定的情況下，添加適量的乳酸菌可促進褶皺臂尾輪蟲種群增長，而且效果顯著。

在輪蟲種群培育階段，有充足的營養(yǎng)物質會對其種群增長起到至關重要的作用^[9]。該實驗通過添加不同接入量的乳酸菌和小球藻混合進行投喂輪蟲，發(fā)現(xiàn)處理組D在種群密度、抱卵率、平均增長率上都優(yōu)于其他實驗組。由于處理組E添加了過量的乳酸菌，對種群培養(yǎng)產(chǎn)生了很大的不利影響，導致其從第2d培育時就比其他處理組和對照組在種群密度、抱卵率、平均增長率明顯的下降，因此過量的乳酸菌量添加，不僅沒有幫助改善水體環(huán)境和輪蟲生長，反而抑制了輪蟲種群增長；而處理組B、C、D較對照組A都出現(xiàn)了明顯的種群密度增長，隨著乳酸菌添加量的升高，其對輪蟲種群增長起到的助力更多，其中處理組D是在同一培育時期對照組A的種群密度的3倍。分析其原因，乳酸菌本身通過繁殖可產(chǎn)生大量的蛋白質、氨基酸和各類維生素等營養(yǎng)元素^[10]，而且部分代謝營養(yǎng)元素已經(jīng)被證實可對輪蟲生長繁殖產(chǎn)生有益影響^[11]，王金秋等也證實了在酵母中添加了維生素C用其培養(yǎng)輪蟲可顯著提高輪蟲種群增長率^[12]。

輪蟲培育不僅需要充足的營養(yǎng)，還同樣也需要一個好的水體環(huán)境，才能更好地生長。有研究證實褶皺臂尾輪蟲培養(yǎng)的適宜pH值為5～9，但pH在8～9范圍內增長快^[13]。該次實驗處理組D在培育期間pH變化范圍為8.0～9.5之間，pH都在一個適宜輪蟲培育的區(qū)間，其抱卵量是同時期對照組的3倍，而其余實驗組的pH都或高或低，對輪蟲的種群增長效果都不如處理組D，可見適量的乳酸菌會提高輪蟲的產(chǎn)量，利于其種群增長。分析其原因，在正常的輪蟲培育中，由于海水小球藻大量繁殖，通過光合作用吸收CO2，釋放O2氣，使得培育水體的pH偏高，顯堿性，有時pH都在10.2以上，這種情況很不利于輪蟲種群增長和抱卵，抑制其種群發(fā)展，而發(fā)酵好的乳酸菌制劑pH在3.0～4.0之間，顯酸性，通過酸堿中和，在小球藻中加入適量的乳酸菌制劑，使得輪蟲培育水體pH在一個較適合輪蟲培育的一個區(qū)間，故能使其種群增長。同樣乳酸菌自身產(chǎn)生物質可以降低水體中的亞硝酸鹽、氨氮和硫化氫濃度，還可以對水體生物殘留物、池底沉積的排泄物、殘餌等有機廢物進行分解^[14]，為輪蟲培育生長提供一個良好的水環(huán)境。蓋建軍等也研究證實在亞硝酸鹽濃度較高的水產(chǎn)培育水體中使用芽孢桿菌制劑和乳酸菌制劑，能夠有效地降低亞硝酸鹽對水生動物的危害^[15]。

對輪蟲培育水體中溶解氧來說，只要水體中不缺氧，對輪蟲的培育不會影響。該實驗中，處理組B、C、D在培育期間，水體溶解氧沒有明顯的下降，對其輪蟲種群增長影響較小，而處理組E加入了過量的乳酸菌，導致水體溶解氧直線下降，進而導致其輪蟲種群增長受到抑制。說明只有適量的乳酸菌濃度才能對輪蟲種群增長起到關鍵作用。故在輪蟲培育中在小球藻培養(yǎng)水體中添加適量的乳酸菌可以改善培養(yǎng)水體環(huán)境，促進褶皺臂尾輪蟲的種群增長。

4 問題與展望

輪蟲種群生長受餌料種類和環(huán)境因子影響，其培育條件和餌料供應已有大量研究，但利用微生態(tài)制劑乳酸菌加快輪蟲種群增長的報道較少。該試驗證實了添加適量的乳酸菌能明顯增強輪蟲種群增長，但是最適的添加比例以及乳酸菌促進輪蟲種群增長的協(xié)同作用機理等還需要進一步研究。

該試驗在實驗室理想狀態(tài)下進行，乳酸菌受到其他菌株影響很小，如果在室外大面積水體高密度培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)水體易受周圍環(huán)境影響，導致水體中菌落生態(tài)較復雜，如何在大水體環(huán)境下確保濃度與活菌數(shù)是生產(chǎn)中的關鍵，這也是以后的研究方向。

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Effect of lactic acid bacteria in combination with Chlorella vulgaris on the population growth of Brachionus plicatilis

MA Qingbin， LIU Fang， LIANG Fang， XING Dongfei， SUN Na

（Panjin Photosynthetic Crab Industry Co.， Ltd.， Panjin 124200， Liaoning China）

Abstract：In order to study the effect of Lactic acid bacteria in combination with Chlorella vulgaris on the population growth of Brachionus plicatilis， the rotifers hatched from the rotifer pond of Panjin Guanghe Crab Industry Co.， Ltd.were used as the test object， and and C. vulgaris was used as the rotifer base bait with different concentrations of probiotics Lactic acid bacteria. The concentration gradients of Lactic acid bacteria were 0 cells/mL， 1×10⁸cells/mL， 2×10⁸cells/mL， 5×10⁸cells/mL and 10×10⁸cells/mL， the rotifer population density， egg-holding rate， average growth rate and so on were observed for 4 days and the data were counted. The results showed that when the population density of rotifers was the same， the maximum population density， egg-holding rate and average growth rate of rotifers in the group treated with appropriate concentrations of lactic acid bacteria were three times， three times and five times higher than those in the control group at the same period （P<0.05）， and the pH of the culture water was effectively reduced to a suitable range for rotifer growth. And with C. vulgaris as the rotifer base bait， the addition of certain concentration of lactic acid bacteria is beneficial to the growth and reproduction of B. plicatilis， which can increase the population size of rotifers and promote the population growth.

Keywords：lactic acid bacteria; Brachionus plicatilis; Chlorella vulgaris; population density; population growth