量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條檢測(cè)谷物中T-2毒素

張瀅　彭濤　苗茜　劉笑笑　丁輝

摘 要：利用量子點(diǎn)（QDs）標(biāo)記T-2抗體（QDs-Ab）作為信號(hào)探針，建立了一種量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)方法（QDICA），用于快速檢測(cè)谷物中的T-2毒素。結(jié)果表明，QDICA的檢測(cè)限為5 μg·L-1。整體檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)10 min，方法特異性良好且具有一定的有效性。T-2-QDICA操作簡(jiǎn)便快速，成本低，滿(mǎn)足谷物中T-2殘留量的快速檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：T-2毒素；量子點(diǎn)；免疫層析試紙條；谷物；快速檢測(cè)

Detection of T-2 Toxin in Cereals with Quantum Dot Labeled Immunochromatographic Test Strip

ZHANG Ying， PENG Tao， MIAO Qian， LIU Xiaoxiao， DING Hui

（Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730050， China）

Abstract： A quantum dot immunochromatographic assays （QDICA） using quantum dot labeled T-2 antibody （QDs-Ab） as signal probe were developed for the determination of T-2 in cereals. The limit of detection for T-2 was 5 μg·L-1. The detection time was 10 min. The assays have good specificity and effectiveness. The QDICA is simple， fast， and low cost， it is suit for rapid detection of T-2 in cereals.

Keywords： T-2 toxin; quantum dot; immunochromatography test strip; cereal; rapid detection

單端孢霉烯族毒素是一大類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)的真菌毒素，根據(jù)其特征官能團(tuán)的不同可分為A、B、C、D 4種類(lèi)型。T-2是A類(lèi)型中毒性最強(qiáng)的，廣泛分布在谷物及動(dòng)物飼料中，性質(zhì)穩(wěn)定，不易滅活。T-2會(huì)引起急性和慢性毒性，對(duì)人和動(dòng)物的多種組織和器官產(chǎn)生毒害作用，能夠引起的毒性效應(yīng)包括消化系統(tǒng)和肝臟毒性、骨系統(tǒng)損傷、基因與細(xì)胞毒性、血液系統(tǒng)毒性、免疫系統(tǒng)毒性、神經(jīng)毒性和生殖發(fā)育毒性等[1]。

隨著檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)T-2的測(cè)定方法主要有液相色譜（Liquid Chromatography，LC）、液質(zhì)聯(lián)用（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS）、氣相色譜（Gas Chromatography，GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）及免疫法[2]。其中LC-MS不需要在檢測(cè)過(guò)程中對(duì)T-2進(jìn)行復(fù)雜的衍生，故成為T(mén)-2最常用的分析檢測(cè)方法，但其費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高。最便捷、靈敏度高的檢測(cè)方法是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法，可用于廣泛的糧食樣品T-2的篩查?；贓LISA衍生出的免疫層析法，成本低且適用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速分析[3]，對(duì)減少T-2的污染和降低暴露風(fēng)險(xiǎn)有積極作用。

QDs是一種新型納米材料，制備簡(jiǎn)單，發(fā)光效率高，化學(xué)穩(wěn)定性好。QDs憑借其諸多優(yōu)點(diǎn)及獨(dú)特的熒光效應(yīng)，在食品中有毒有害小分子物質(zhì)的快速檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[4-5]。本研究以量子點(diǎn)和T-2抗體為基礎(chǔ)，制備QDs-Ab熒光探針，建立一種T-2-QDICA新方法，以期能夠縮短谷物中T-2的檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙墊、PVC板、Milipore HF 140s硝酸纖維素膜，上海金標(biāo)公司；羧基化水溶性量子點(diǎn)，武漢珈源公司；T-2單克隆抗體（T-2-Ab）、T-2包被原（T-2-BSA）、T-2 ELISA試劑盒，山東綠都生物科技有限公司；T-2毒素（T-2）、黃曲霉毒素B₁（AFB₁）、黃曲霉毒素M₁（AFM₁）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏馬毒素B₁（FB₁）、嘔吐毒素（DON）、赭曲霉毒素A（OTA），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；羊抗鼠二抗（IgG）、乙基碳二亞胺（EDC），美國(guó)Sigma公司；玉米，當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 設(shè)備與儀器

HM3035噴金儀、ZQ2000自動(dòng)斬切機(jī)，上海金標(biāo)生物有限公司；ZF1-Ⅱ紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 QDs-Ab復(fù)合物的制備

取25 μL QDs（8 μmol·L^-1）于2.0 mL離心管中，加入93 μg EDC，再分別加入12 μg、24 μg、30 μg T-2-Ab，混合均勻，210 r·min^-1室溫下避光充分反應(yīng)4 h。然后將溶液在4 ℃條件下12 000 r·min^-1離心3 min除團(tuán)聚。然后用規(guī)格為100 kDa的超濾離心管將離心后的上清液濃縮，使用尺寸排阻柱對(duì)濃縮液純化，最終得到QDs-Ab復(fù)合物。

1.3.2 QDICA的組裝

將140s硝酸纖維素膜、吸水紙墊、結(jié)合墊和樣品墊依次粘貼在PVC板上，將羊抗鼠IgG、T-2-BSA分別包被在NC膜上，作為QDICA的質(zhì)控線(xiàn)（C線(xiàn)）、檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)），于37 ℃烘箱中放置4～6 h，用自動(dòng)斬切機(jī)斬?cái)喑蓪挒?.7 mm的試紙條，儲(chǔ)存在常溫、干燥、避光的條件下。

1.3.3 QDICA實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

樣品的上樣緩沖液、QDs-Ab復(fù)合物的添加量、工作液的加入量、二抗和T-2-BSA的稀釋倍數(shù)等都直接影響試紙條的準(zhǔn)確性以及靈敏度。分別選擇QDs-Ab的添加量為0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL，工作液添加量為3 μL、5 μL、8 μL、10 μL以及4種不同的上樣緩沖液進(jìn)行試紙條檢測(cè)，當(dāng)試紙條C、T線(xiàn)熒光強(qiáng)度一致且適中、熒光條帶清晰以及背景干擾程度小時(shí)，確定為QDICA最佳工作條件。

1.3.4 QDICA方法檢測(cè)限確定

將T-2用上樣稀釋液依次稀釋為0 μg·L^-1、1.0 μg·L^-1、2.5 μg·L^-1、5.0 μg·L^-1、8.0 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1、25.0 μg·L^-1，分別和一定量的QDs-Ab復(fù)合物、工作液在試紙條最優(yōu)工作條件下上樣，10 min后通過(guò)紫外分析儀觀察檢測(cè)結(jié)果。T線(xiàn)熒光條帶恰好完全消失時(shí)所對(duì)應(yīng)的T-2最小濃度確定為T(mén)-2-QDICA的可視化檢測(cè)限。

1.3.5 QDICA方法特異性評(píng)價(jià)

在試紙條最佳工作條件下，分別檢測(cè)T-2、AFB1、FB1、ZEN、OTA、DON和AFM1，通過(guò)觀察C、T線(xiàn)顯色情況，進(jìn)行方法特異性評(píng)價(jià)。

1.3.6 QDICA實(shí)際樣品的檢測(cè)及有效性驗(yàn)證

選擇陰性谷物樣品作為實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g粉碎均勻的谷物樣品，精密加入5 mL 75%的甲醇溶液作為樣品提取液充分提取，渦旋20 min后，離心機(jī)3 900 r·min^-1下離心10 min，留下上清液待用。將陰性樣品上清液用上樣緩沖液稀釋4倍來(lái)消除基質(zhì)影響，最后進(jìn)行試紙條上樣檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)利用商品化ELISA試劑盒驗(yàn)證QDICA方法的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備QDs-Ab時(shí)QDs和T-2-Ab添加比例的優(yōu)化

QDs和T-2-Ab的添加比例會(huì)影響QDs-Ab復(fù)合物的偶聯(lián)效率，最終影響QDICA方法的靈敏度。本研究選擇摩爾比為1∶4、1∶8、1∶10的QDs和T-2-Ab制備QDs-Ab。由圖1可知，QDs和T-2-Ab摩爾比為1∶8時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，所以選擇QDs和T-2-Ab摩爾添加比例為1∶8。

2.2 上樣緩沖液的優(yōu)化

試紙條的上樣緩沖液會(huì)影響免疫反應(yīng)活性，緩沖液的pH值、溶液中不同離子的濃度均會(huì)影響C、T線(xiàn)的熒光強(qiáng)度。本研究選擇pH值為5.7和7.4的PB、pH值為7.4的PBS、pH值為8.3的BBS作為上樣緩沖液進(jìn)行試紙條檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，緩沖液為pH=5.7的PB時(shí)，C、T線(xiàn)處熒光亮度差；緩沖液為pH=7.4的PB時(shí)，C、T線(xiàn)處熒光條帶均勻清晰，QDICA靈敏度較好；緩沖液為pH=7.4的PBS時(shí)，QDICA靈敏度稍差；緩沖液為pH=8.3的BBS時(shí)，C線(xiàn)處熒光條帶亮度稍弱，可能引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效的誤判。綜上，最終選擇pH=7.4的PB作為試紙條上樣緩沖液和樣品稀釋液。

2.3 QDs-Ab復(fù)合物和工作液添加量的確定

QDs-Ab復(fù)合物的加入量決定著QDICA C、T線(xiàn)處熒光強(qiáng)度，直接影響QDICA方法的靈敏度。工作液的加入主要影響樣品溶液在QDICA上的層析速度，進(jìn)而影響QDs-Ab與T-2-BSA結(jié)合效率，間接影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文研究QDs-Ab的添加量為0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL，工作液添加量為3 μL、5 μL、8 μL、10 μL時(shí)，QDICA C、T線(xiàn)處的熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入QDs-Ab復(fù)合物量較少（0.1 μL）時(shí)，C、T線(xiàn)熒光強(qiáng)度較弱，說(shuō)明沒(méi)有足夠的QDs-Ab復(fù)合物與C、T線(xiàn)上二抗和T-2-BSA結(jié)合；當(dāng)加入QDs-Ab復(fù)合物量太多（0.5 μL）時(shí)，導(dǎo)致C、T線(xiàn)熒光亮度太強(qiáng)而靈敏度降低。隨著工作液添加量的增加，變化梯度由一般到明顯再到一般。因此，本文最終確定QDs-Ab和工作液的加入量分別為0.3 μL和8.0 μL。

2.4 QDICA檢測(cè)限的確定

將配制成不同濃度的T-2混合樣品溶液滴加在樣品墊上，10 min后通過(guò)紫外分析儀觀察檢測(cè)結(jié)果。

如圖2所示，當(dāng)樣品中不含T-2時(shí)，C、T線(xiàn)上熒光條帶清晰，亮度均勻一致。隨著T-2濃度逐漸升高，C線(xiàn)不變，T線(xiàn)的熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)踔敝料Р灰?jiàn)。T-2濃度為5 μg·L^-1時(shí)，T線(xiàn)上熒光條帶恰好完全消失。經(jīng)過(guò)幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定T-2-QDICA方法的可視化檢測(cè)限為5 μg·L^-1。

2.5 T-2-QDICA特異性的評(píng)價(jià)

如圖3所示，5 μg·L^-1的T-2就能夠使QDICA T線(xiàn)處的熒光條帶消失，而其余6種高濃度真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度均為1 mg·L-1）都不能與T線(xiàn)處包被物結(jié)合，從而使T線(xiàn)熒光條帶消失。說(shuō)明QDs-Ab復(fù)合物只能和其對(duì)應(yīng)的T-2抗原結(jié)合，與其他6種常見(jiàn)的真菌毒素均無(wú)交叉，特異性好。

2.6 T-2-QDICA有效性的驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中QDICA方法與ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致，證明QDICA方法高效、有效，可簡(jiǎn)單、快速實(shí)現(xiàn)T-2在谷物中的半定量檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究利用QDs作為熒光標(biāo)記物，基于免疫特異性識(shí)別，建立了一種靈敏、快速的熒光免疫層析方法用于檢測(cè)谷物中T-2的殘留量。本方法相較于大型儀器檢驗(yàn)方法，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，實(shí)際樣品中測(cè)定結(jié)果與ELISA試劑盒測(cè)定結(jié)果一致，證明本方法有效且具有一定實(shí)用性。

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