納米盤——膜蛋白研究新平臺

張澤鈺 黃儲涵 魏鵬

膜蛋白，是能夠結(jié)合或整合到細胞膜或細胞器膜上的蛋白質(zhì)的總稱，是生物膜功能的主要承擔者，是體內(nèi)細胞增殖分化、能量轉(zhuǎn)換、信號傳導(dǎo)和物質(zhì)運輸?shù)闹饕休d者。膜蛋白主要包括外周膜蛋白、整合蛋白、脂錨定蛋白三類，其中整合蛋白中的通道蛋白、受體蛋白、載體蛋白，以及各種酶等，是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的研究內(nèi)容。然而，由于膜蛋白不溶于水，且在體外難以保持天然形態(tài)，因此極大地限制了天然膜蛋白的相關(guān)研究。

納米盤的原理

1959年，物理學(xué)家費恩曼提出了一個關(guān)于創(chuàng)造物品的設(shè)想：“為什么我們不能從單個的分子、甚至原子出發(fā)，按我們的要求進行組裝以得到我們所需要的物品呢？”這就是有關(guān)納米技術(shù)最早的靈感起源。此后，許多科學(xué)家在小分子層面進行了構(gòu)想和努力，并于20世紀80年代發(fā)明了研究納米技術(shù)的重要工具——掃描隧道顯微鏡，讓科學(xué)家能夠真實地看到一個個可見的原子或分子世界。最廣為人知的納米技術(shù)當屬IBM公司的科學(xué)家將單個原子重排，組成了“I”“B”“M”3個字母，而這3個字母的長度加起來還不足3納米，相當于人體頭發(fā)絲直徑的1/45 000。

納米盤技術(shù)，最早由斯蒂芬·斯利加（Stephen Sligar）提出。納米盤是一種由磷脂和膜支架蛋白（membrane scaffold proteins， MSP）顆粒自組裝而成的盤狀磷脂雙分子層，其中的MSP顆粒是一種類似ApoA-1蛋白的人工膜支架蛋白。ApoA-1是人體中高密度脂蛋白的重要組成部分，由243個氨基酸殘基組成，將其N端的部分氨基酸殘基切掉后可形成柔軟而具有韌性的MSP顆粒。有研究者通過改變蛋白骨架兩端螺旋部分的長短或延長、截斷的方法得到了長短不一的MSP顆粒，并發(fā)現(xiàn)其均可用于納米盤的組裝[3]，因而進一步證實了納米盤的可塑性。

納米盤的應(yīng)用

膜蛋白純化利器

現(xiàn)有純化膜蛋白的方法主要是使用去污劑，利用雙極性分子（同時具有疏水性與親水性）來破壞磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，從而將膜蛋白從生物膜中釋放出來。純化過程中關(guān)鍵的一步，是使得目標膜蛋白在去污劑中自組裝為膠束（表面活性劑濃度達到一定值后，開始大量形成的分子有序聚集體），而這一過程由不同去污劑的臨界膠束濃度決定。但即便對于同一種去污劑來說，它的臨界膠束濃度也不是恒定的，會受到溶液pH、離子強度和環(huán)境溫度的影響。因此，去污劑在膜蛋白的溶解和提純過程中面臨著不確定性等多種問題。

當納米盤技術(shù)與膜蛋白的純化過程結(jié)合時，主要有兩種方式[2]：一是將膜支架蛋白直接加入純化好的目標膜蛋白中，使其自動整合嵌入；二是將膜支架蛋白顆粒加入膜蛋白的混合物之中，得到多種含不同膜蛋白的納米盤混合物，再將這種兩親性的物質(zhì)進行純化。納米盤依據(jù)其自身對于生物膜的高度模仿性，大大降低了以往使用去污劑純化造成的膜蛋白錯誤折疊、表面聚集等問題發(fā)生的概率，保證純化后的膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能同其天然構(gòu)象更為接近；同時，簡化了膜蛋白的純化步驟、降低了純化難度。

探究膜蛋白的結(jié)構(gòu)

目前，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要手段有X射線衍射技術(shù)、電鏡技術(shù)和核磁共振技術(shù)。獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體，是進一步探究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的前提。然而在既往有關(guān)膜蛋白的研究中，由于膜蛋白自身兩親性的特殊性質(zhì)，使其在純化過程中構(gòu)象不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚合，因此很難獲得高質(zhì)量的膜蛋白晶體。

近年來，研究者們試圖將納米盤與現(xiàn)有的成像基礎(chǔ)結(jié)合來解決這一問題，例如在X射線晶體衍射法中，將納米盤的膜支架蛋白顆粒設(shè)計成一個二維的結(jié)晶格，或通過使用特定的抗體為脂質(zhì)雙分子層提供更大的空間，以避免結(jié)晶困難的問題[4]；而在冷凍電鏡技術(shù)中，研究者用納米盤分離膜蛋白及其復(fù)合物，使得膜蛋白具有較高的均一性，目標蛋白中少有異常聚集，且蛋白能夠在納米盤上較好地保持其天然形態(tài)下的功能與構(gòu)象，便于獲取膜蛋白的結(jié)構(gòu)[5，6]。

心血管疾病防治器

動脈粥樣硬化是心血管疾病的高危致病因素，也是冠心病的主要發(fā)病和死亡原因。血脂升高是動脈粥樣硬化的前提，而評估血脂的指標主要包括四項：血液中膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的水平。經(jīng)脂質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血液中的高密度脂蛋白水平與心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險呈負相關(guān)[7]。

ApoA-1是人體中高密度脂蛋白的重要組成部分，納米盤骨架MSP與體內(nèi)ApoA-1結(jié)構(gòu)十分相似。研究者將納米盤注射進入動脈粥樣硬化的動物模型后，能夠一定程度地模擬盤狀高密度脂蛋白的功能，起到抗動脈粥樣硬化的作用。此外，也有學(xué)者深入地探究了藥物與納米盤的結(jié)合效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與納米盤結(jié)合后的他汀類藥物能夠大幅降低巨噬細胞的存活率，并抑制已形成斑塊的炎癥反應(yīng)。

疏水性藥物的良好載體

目前新發(fā)現(xiàn)的藥物中，約40%都是脂溶性的，因此在常用的靜脈注射給藥過程中，常需使用增溶劑來提高藥物的利用率，而這種方式又常常會產(chǎn)生“注射量大”“毒副作用多”等副作用。

納米盤憑借其對生物膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的高度模擬性，成為疏水性藥物的一種高效載體，納米盤的骨架將磷脂包圍在其中，親水端向外，疏水端向內(nèi)，藥物可通過人為手段搭載在磷脂內(nèi)部的長鏈中。通過該種方法，能夠?qū)⒅苄运幬餃蚀_遞送，過程中未出現(xiàn)明顯的脫靶毒副作用，而含有ApoE3蛋白質(zhì)的納米盤還能夠減少模型動物體內(nèi)的淀粉樣蛋白沉積，從而改善其神經(jīng)功能變化引起的記憶缺陷[9]。