摘葉和噴施外源過(guò)氧化氫對(duì)庫(kù)爾勒香梨粗皮果形成的影響

史智勇,艾沙江·買(mǎi)買(mǎi)提,仙米斯婭·塔依甫,曹藝潔,玉蘇甫·阿不力提甫

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所,烏魯木齊 830091;3.新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)藥檢定所,烏魯木齊 830049 )

0 引 言

【研究意義】庫(kù)爾勒香梨(PyrussinkiangensisYü)是新疆梨和西洋梨的自然雜交后代,食用品質(zhì)優(yōu)良[1]。庫(kù)爾勒香梨粗皮果的形成降低了其食用品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。研究庫(kù)爾勒香梨粗皮果形成的規(guī)律,為庫(kù)爾勒香梨粗皮病的防治提供相關(guān)理論基礎(chǔ),對(duì)提高果實(shí)品質(zhì)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前有關(guān)庫(kù)爾勒香梨粗皮果形成的研究主要集中在砧木、礦質(zhì)元素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)狀況、結(jié)果部位等的影響[2-4];環(huán)境因子對(duì)于香梨粗皮果的形成也有較大的影響,如干旱[5]、光照條件[6]等。庫(kù)爾勒香梨粗皮果的形成不僅是樹(shù)體的內(nèi)部作用,也是樹(shù)體對(duì)外界環(huán)境信號(hào)響應(yīng),是復(fù)雜的信號(hào)傳遞過(guò)程。逆境脅迫是非生物脅迫的一種,也是植物在正常生長(zhǎng)中經(jīng)常會(huì)面臨的一種脅迫類(lèi)型。李英麗[7]發(fā)現(xiàn)高溫處理能夠顯著增加鴨梨果實(shí)內(nèi)活性氧含量的積累,且高溫和強(qiáng)光具有脅迫增效作用,能夠加重氧化脅迫的發(fā)生。石細(xì)胞含量的增多是庫(kù)爾勒香梨粗皮果形成的主要原因,而在石細(xì)胞快速形成的時(shí)期,其質(zhì)外體活性氧產(chǎn)生基因也在高水平表達(dá)[8]。且活性氧對(duì)于石細(xì)胞的主要成分木質(zhì)素[9]的合成有一定的促進(jìn)作用[10-11],活性氧脅迫和高溫強(qiáng)光脅迫會(huì)促使香梨的粗皮果的產(chǎn)生?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】庫(kù)爾勒香梨粗皮病是一種生理病害。發(fā)病果實(shí)的果面凸凹不平,并且萼端由綠變黃的速度減慢,對(duì)果實(shí)品質(zhì)影響較大。需研究庫(kù)爾勒香梨上可能誘導(dǎo)粗皮果形成的脅迫因子?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】設(shè)置不同的脅迫類(lèi)型,測(cè)定果實(shí)染色切片的相關(guān)生理指標(biāo),研究脅迫作用對(duì)庫(kù)爾勒香梨粗皮果形成的影響,分析庫(kù)爾勒香梨粗皮果形成相關(guān)的脅迫類(lèi)型,為解決庫(kù)爾勒香梨粗皮果的產(chǎn)生提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以新疆巴音郭楞蒙古自治州輪臺(tái)縣輪臺(tái)果樹(shù)資源圃的長(zhǎng)勢(shì)相同的多年生庫(kù)爾勒香梨樹(shù)為試驗(yàn)材料,隨機(jī)選取每棵樹(shù)上相同方向的枝條為1個(gè)試驗(yàn)組,3棵樹(shù)為1個(gè)平行組,共9棵樹(shù)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

空白(CK)組:不處理。

摘葉(Y)組:在2021年7月5日,摘除遮擋結(jié)果枝光照50%的葉子(高溫光照復(fù)合脅迫);外源噴施H2O2(H)組:在2021年5月5日,任意選取3個(gè)結(jié)果枝用250、400和500 mmol/L H2O2噴施預(yù)處理,觀察果子的生長(zhǎng)發(fā)育情況。以果實(shí)表型不發(fā)生改變的最大臨界濃度作為試驗(yàn)處理濃度(活性氧脅迫)。

400和500 mmol/L H2O2噴施組果實(shí)表型均產(chǎn)生明顯病變,而250 mmol/L H2O2噴施組表型未產(chǎn)生明顯病變,于2021年7月5日對(duì)整個(gè)H組的結(jié)果枝用250 mmol/L的外源H2O2噴施。圖1

圖1 外源噴施H2O2預(yù)試驗(yàn)組

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.2.1 環(huán)境因素

分別在CK組和Y組結(jié)果枝上各選取5個(gè)果子,選取7月連續(xù)晴朗的3 d,每隔2 h測(cè)定果面的光照度和溫度。

光照強(qiáng)度采用TES 1332A數(shù)位式照度計(jì)測(cè)定;采用FLUKE MT4 MAX輻射溫度計(jì)測(cè)定溫度。

1.2.2.2 生理指標(biāo)

分別選取不同處理組枝條上的果實(shí)(花后100 d)若干,用蒸餾水清洗干凈后分別削取果皮以及果皮下2 mm左右的果肉,果皮果肉分別用液氮速凍后用 IKA A11 磨樣機(jī)磨成粉末狀混樣,做好采樣標(biāo)簽,存于-80℃ 冰箱中備用。

采用硫酸蒽酮比色法測(cè)定植物纖維素含量[12];采用鹽酸水解法測(cè)定植物半纖維素含量,采用濃硫酸法測(cè)定植物木質(zhì)素含量[13];可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定;可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮試劑法測(cè)定[14];丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[15];脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測(cè)定[16];過(guò)氧化氫含量和超氧陰離子含量分別用索萊寶公司(Solarbio)的過(guò)氧化氫含量試劑盒(BC3590)和超氧陰離子含量試劑盒(BC1290)進(jìn)行測(cè)定;酶活性測(cè)定利用賽默飛世爾(Thermo Fisher)酶標(biāo)儀(1510)測(cè)定。

1.2.3 田間比例

在香梨果實(shí)成熟期,即2021年8月20日該對(duì)空白組以及2個(gè)處理組枝條上的所有果實(shí)的粗皮果和正常果數(shù)量并匯總。

1.2.4 果實(shí)石細(xì)胞染色

隨機(jī)選取不同處理組的香梨果實(shí)(花后100 d)若干,用蒸餾水清洗后分別對(duì)果實(shí)進(jìn)行橫切與縱切。橫切與縱切的果實(shí)切片寬度約2 cm,厚度約5 mm,長(zhǎng)度需要從果皮切到果核附近,用50% FAA固定液進(jìn)行固定保存;香梨果實(shí)用番紅固綠染色液進(jìn)行染色。

香梨果實(shí)的脫水和浸蠟通過(guò)徠卡組織樣品自動(dòng)脫水機(jī)(Leica ASP200S)完成;香梨果實(shí)的包埋通過(guò)徠卡包埋機(jī)(Leica Arcadia H+C)完成;香梨果實(shí)的切片通過(guò)徠卡切片機(jī)(Leica RM2265)完成;香梨果實(shí)切片的染色通過(guò)徠卡攤片機(jī)(Leica HI 1210)、徠卡烘片機(jī)(Leica HI 1220)、徠卡自動(dòng)染色機(jī)(Leica ST5020)完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用 Excel 2010 軟件進(jìn)行匯總和處理,利用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,利用 GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脅迫相關(guān)因子變化

2.1.1 摘葉組環(huán)境因子

研究表明,摘葉導(dǎo)致果實(shí)表面的光照強(qiáng)度以及溫度顯著增加。Y組果實(shí)表面的光照度明顯大于CK組,Y組的日平均光照度約為CK組的日平均光照度的18倍;Y組日平均溫度比CK組的日平均溫度高3.6℃。摘葉能使果實(shí)表面的光照和溫度明顯增加,對(duì)果實(shí)造成溫度和光照的復(fù)合脅迫。圖2

注:A圖為日光照變化;B圖為日溫度變化

2.1.2 不同脅迫因子對(duì)香梨果皮活性氧含量的影響

研究表明,噴施外源H2O2能導(dǎo)致庫(kù)爾勒香梨果皮中的H2O2含量明顯升高。H組H2O2含量約為CK組的2.0倍,并且也顯著高于其他2個(gè)處理組。外源噴施250 mmol/L H2O2能對(duì)庫(kù)爾勒香梨果皮造成一定的活性氧脅迫,而摘葉處理則沒(méi)有對(duì)庫(kù)爾勒香梨果皮造成明顯氧化脅迫或脅迫程度較小。圖3

注:數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)后用不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05 差異顯著;無(wú)標(biāo)注即代表沒(méi)有顯著性差異,下同

2.1.3 不同脅迫處理對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)MDA含量的影響

研究表明,H組果肉中的MDA含量明顯高于CK組,為CK組的1.8倍。噴施250 mmol/L H2O2對(duì)果實(shí)的脅迫作用更加明顯,而摘葉處理對(duì)香梨果實(shí)MDA含量幾乎沒(méi)有影響。圖4

注:數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)后用不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05 差異顯著

2.2 不同脅迫因子對(duì)內(nèi)源滲透物質(zhì)的影響

研究表明,摘葉處理后,果皮和果肉中的可溶性糖含量和果肉中的淀粉含量均顯著性升高,分別為對(duì)照組的1.4、1.2倍和2.0倍;果肉中的可溶性蛋白顯著下降,相比對(duì)照組下降了49%。外源H2O2處理后,果皮中的可溶性糖和淀粉含量均顯著升高,分別為對(duì)照組的1.4倍和1.4倍;果皮中的脯氨酸含量顯著下降,相比對(duì)照組下降了14%。圖5

圖5 庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同處理組內(nèi)源滲透物質(zhì)含量變化

2.3 脅迫處理對(duì)庫(kù)爾勒香梨粗皮果形成的影響

2.3.1 脅迫處理對(duì)庫(kù)爾勒香梨粗皮果率的影響

研究表明,3種脅迫處理均能導(dǎo)致香梨的粗皮果率顯著升高。H組果實(shí)的粗皮果率為CK組的2.9倍,Y組果實(shí)的粗皮果率是CK組的1.6倍。且H組相對(duì)Y組均導(dǎo)致了其結(jié)果枝的粗皮果率的顯著升高。表1

2.3.2 脅迫處理對(duì)庫(kù)爾勒香梨組織染色切片的影響

研究表明,2種不同的脅迫處理后切片單位視野中石細(xì)胞的數(shù)量均體現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。其中, H組染色圖中單位視野內(nèi)的石細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于Y組色圖中單位視野內(nèi)石細(xì)胞數(shù)量增多趨勢(shì)更加明顯。與田間調(diào)查中的3個(gè)處理組對(duì)粗皮果率的結(jié)果相一致,活性氧脅迫對(duì)于果實(shí)內(nèi)部石細(xì)胞含量的增多以及粗皮果的形成有較大的影響,高溫光照復(fù)合脅迫對(duì)于果實(shí)內(nèi)部石細(xì)胞含量的增多以及粗皮果的形成影響較小亦或光照強(qiáng)度沒(méi)有達(dá)到對(duì)果實(shí)產(chǎn)生逆境脅迫的程度。圖6

表1 庫(kù)爾勒香梨結(jié)果枝不同處理組的粗皮果率變化

2.3.3 脅迫處理對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)含量的影響

研究表明,2種處理,果皮、果肉的木質(zhì)素含量都有所增加。H組果皮和Y組果肉的木質(zhì)素含量與CK組相比有顯著升高,H組果皮果肉和Y組果肉中的纖維素含量與CK組相比有顯著升高,H組果皮果肉和Y組果肉的半纖維素含量與CK組相比有顯著提高。H2O2噴施處理對(duì)果皮的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量以及果肉中的纖維素、半纖維素含量有顯著影響;摘葉處理對(duì)果肉中木質(zhì)素含量、纖維素含量、半纖維素含量以及果皮中的半纖維素含量有顯著影響。圖7

注:A～C. CK,H,Y組的果實(shí)果皮附近染色圖,1、2、3分別為外果皮部位同一切片上的全景掃描圖的3個(gè)連續(xù)片段3段不同部位;a～c.處理組CK,H,Y組的果實(shí)果肉部分染色圖

注:A、B、C分別為果皮、果肉中木質(zhì)素含量、纖維素含量、半纖維素含量;數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)后用不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05 差異顯著

3 討 論

庫(kù)爾勒香梨的粗皮果的形成原因較為復(fù)雜。徐慶岫等[5]認(rèn)為7月的高溫干旱是導(dǎo)致粗皮果形成的主要原因;李疆等[3]通過(guò)對(duì)庫(kù)爾勒香梨進(jìn)行田間調(diào)查,發(fā)現(xiàn)內(nèi)膛枝、樹(shù)勢(shì)旺盛以及凸頂果和凹頂果的比率升高都會(huì)導(dǎo)致粗皮果率升高;此外,也有報(bào)道噴施鈣溶液可以影響南果梨粗皮果率[17]。香梨粗皮果的形成,不僅是樹(shù)體內(nèi)部自身作用的結(jié)果,更是樹(shù)體對(duì)逆境環(huán)境的響應(yīng)的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)摘葉處理和噴施H2O2后果實(shí)果皮中的活性氧含量顯著增加,處理對(duì)香梨果實(shí)產(chǎn)生一定程度的氧化脅迫,其中H2O2處理的作用更明顯,所有影響細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的脅迫因子都有潛力誘導(dǎo)粗皮果的產(chǎn)生。逆境脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧含量的升高[18],植物細(xì)胞在自身承受范圍之內(nèi)通過(guò)保護(hù)酶系統(tǒng)或滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)清除多余的活性氧來(lái)防御逆境脅迫[19-20]。脅迫處理后香梨果實(shí)內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)不同程度的提高,果實(shí)細(xì)胞確實(shí)感受到逆境脅迫,并對(duì)其做出響應(yīng)。當(dāng)逆境脅迫程度超過(guò)細(xì)胞的承受范圍后,植物組織為了整張發(fā)育主動(dòng)犧牲部分細(xì)胞來(lái)適應(yīng)逆境環(huán)境,即通過(guò)細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)來(lái)促進(jìn)部分細(xì)胞的分化[21]。其結(jié)果一是為剩余細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)提供能量;二是將部分細(xì)胞分化為厚壁組織或輸導(dǎo)組織的一部分來(lái)提高組織對(duì)逆境的適應(yīng)性[22-23]。庫(kù)爾勒香梨粗皮果的形成是其果實(shí)中石細(xì)胞增多的結(jié)果,石細(xì)胞是由于木質(zhì)素沉積而導(dǎo)致次生壁加厚的細(xì)胞分化過(guò)程[11,24]。

前期的研究中發(fā)現(xiàn)在石細(xì)胞形成的關(guān)鍵時(shí)期與質(zhì)外體活性氧產(chǎn)生相關(guān)的酶基因顯著上調(diào)表達(dá),且表達(dá)趨勢(shì)與石細(xì)胞的變化趨勢(shì)大致相同,石細(xì)胞分化和質(zhì)外體活性氧積累之間存在協(xié)同關(guān)系。在果實(shí)發(fā)育的早期石細(xì)胞主要分布在維管束周?chē)?而維管束周?chē)募?xì)胞一般處于一種“半分化”的狀態(tài),后期不利的環(huán)境因素會(huì)優(yōu)先導(dǎo)致維管束周?chē)谋”诩?xì)胞進(jìn)行分化[8,25]。庫(kù)爾勒香梨果實(shí)在受到一定的環(huán)境脅迫條件下,如外源的活性氧脅迫和高溫光照復(fù)合脅迫,會(huì)導(dǎo)致庫(kù)爾勒香梨的石細(xì)胞增多,相對(duì)應(yīng)的處理組枝條的粗皮果率也會(huì)顯著增加。逆境脅迫、活性氧爆發(fā)、PCD、次生壁沉積這四者相結(jié)合,共同促進(jìn)了庫(kù)爾勒香梨果實(shí)中石細(xì)胞的增多,進(jìn)而導(dǎo)致粗皮果的產(chǎn)生。

4 結(jié) 論

4.12種處理均能顯著提高庫(kù)爾勒香梨果實(shí)內(nèi)的木質(zhì)素含量和處理枝條上的粗皮果率。2種處理后果皮的木質(zhì)素含量以及粗皮果率分別為對(duì)照組的1.4、2.9倍和1.1、1.6倍。

4.2其中摘葉處理后,果肉中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相對(duì)變化較為明顯,主要影響果肉中的石細(xì)胞積累;噴施H2O2后果皮中的ROS代謝相關(guān)物質(zhì)、MDA含量以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化都較為明顯,主要影響果皮中的石細(xì)胞積累。