玉米鈣依賴蛋白激酶全基因組鑒定及抗旱表達分析

陳 果,郝曉燕,高升旗,胡文冉,趙 準(zhǔn),黃全生

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所/新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】春玉米抽雄、開花期遇干旱是導(dǎo)致玉米減產(chǎn)的主要原因之一。干旱往往伴隨著高溫天氣,新疆南、北疆平原地區(qū)春玉米的抽雄、開花期通常處于7 月,極易碰到高溫天氣,最高氣溫通常高于35℃,空氣干燥,易造成花粉失水干枯,花絲枯萎,受精不全,缺粒禿尖增多,最終影響產(chǎn)量。通過常規(guī)育種手段進行玉米耐旱育種,育成了一些能夠在新疆以及我國干旱和半干旱地區(qū)種 植的優(yōu)良雜交種。但由于玉米耐旱性狀的復(fù)雜性,其耐旱機制研究遠遠不夠深入,限制了玉米耐旱種質(zhì)創(chuàng)新與耐旱新品種培育[1]。因此,在新疆開展玉米耐旱機制研究與耐旱新種質(zhì)創(chuàng)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來在分子水平上了解植物耐旱的調(diào)控機制[2]。為了應(yīng)對這些壓力,植物發(fā)展了一系列的生存機制。其中,鈣離子(Ca2+)是細胞內(nèi)的第二信使,在各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要作用[3]。瞬態(tài)變化的Ca2+濃度是由幾個Ca2+傳感器或Ca2+結(jié)合蛋白。迄今為止,在高等植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種主要的Ca2+結(jié)合蛋白,包括鈣依賴蛋白激酶(CDPK)、鈣調(diào)蛋白(CaM)和CaM類似蛋白(CaML)和鈣調(diào)磷酸酶B蛋白(CBL)[4]。 CDPK是一種眾所周知的Ca2+傳感器蛋白激酶并參與環(huán)境脅迫抗性,這些激酶在植物和一些原生動物[5],但在動物中沒有。CDPK蛋白有四個特征結(jié)構(gòu)域:N端可變區(qū)、Ser/Thr激酶催化結(jié)構(gòu)域、自調(diào)節(jié)/自抑制結(jié)構(gòu)域和calmodulin類似結(jié)構(gòu)域[6]。鈣調(diào)素類似結(jié)構(gòu)域包含EF-hands用于Ca2+結(jié)合。CDPKs不僅在多種非生物和生物脅迫(如干旱、寒冷、鹽度、損傷和病原體感染)中發(fā)揮重要的作用,而且也在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[7-9]。擬南芥AtCDPK4和AtCDPK11是2個正調(diào)控因子,通過2個ABA響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ABF1和ABF4磷酸化參與CDPK/Ca2+介導(dǎo)的ABA信號[10]。擬南芥AtCDPK3和AtCDPK6可調(diào)節(jié)保衛(wèi)細胞離子通道的活性,并參與ABA調(diào)控的氣孔信號[11]。此外,過表達AtCDPK6和AtCDPK3的植株對鹽/干旱脅迫的耐受性增強,而AtCDPK6突變體的植株沒有明顯的表型表現(xiàn)[12]。AtCDPK6也正向調(diào)控保衛(wèi)細胞中茉莉酸甲酯(MeJA)信號[13]。AtCDPK21和AtCDPK23突變體對高滲脅迫、干旱和鹽脅迫的耐受性增強[14-15]。擬南芥AtCDPK32過表達通過ABF4磷酸化增強了種子萌發(fā)過程中的ABA和鹽敏感性[16]。擬南芥cpk5/cpk6、cpk5/cpk6/cpk11和cpk5/cpk6/cpk11/cpk4突變體破壞了flg22誘導(dǎo)的反應(yīng),包括ROS產(chǎn)生和防御相關(guān)基因表達[17]。在水稻中,過表達OsCDPK7的基因被證明可以增強水稻對寒、旱、鹽脅迫的抗性[18]。OsCDPK21正向調(diào)控ABA信號和鹽脅迫[19]。OsCDPK12過表達增加了對鹽脅迫的耐受性,并增加了對兼容和不兼容稻瘟病真菌的敏感性[20]。CDPKs是由一個大家族編碼的,擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組中有34個CDPK基因[21],水稻(OryzasativaL.)中有31個基因[22],小麥(TriticumaestivumL.)中有20個CDPK基因[23]。煙草(Nicotianatabacum)、大豆(Glycinemax)和番茄(Lycopersiconesculentum)也有多個CDPK基因[24-26]。然而,目前對玉米的CDPK家族知之甚少。只有6個ZmCDPKs(ZmCDPK1,ZmCDPK2,ZmCDPK7,ZmCDPK9,ZmCDPK10和ZmCDPK11)在玉米上被鑒定。低溫誘導(dǎo)玉米葉片表達ZmCDPK1[27]。ZmCDPK7和ZmCDPK9的轉(zhuǎn)錄本水平在根和黃化葉片中高于綠葉,2個基因可能在光照下表達下調(diào)[28]。真菌感染和真菌誘導(dǎo)子處理玉米幼苗后,ZmCDPK10在幼苗生長和發(fā)育過程中表達[29]。ZmCDPK11的表達和酶活性被證明受亞麻酸(LA)和MeJA的調(diào)控以及參與創(chuàng)傷信號通路[30]。【本研究切入點】干旱脅迫嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)。作物對干旱反應(yīng)的分子機制仍不清楚,鑒定玉米抗旱基因并將其整合到玉米優(yōu)質(zhì)品種中是十分必要的。鈣依賴性蛋白激酶(CDPKs)已被證明在各種生理過程中發(fā)揮重要作用,包括參與植物生長和發(fā)育,非生物和生物脅迫反應(yīng)以及植物激素信號途徑。基于該基因家族對干旱脅迫的研究鮮有報道,需對玉米CDPK基因家族進行全基因組分析,研究其對玉米干旱脅迫反應(yīng)的能力?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析玉米全基因組,篩選并鑒定在玉米中的所有CDPK基因,系統(tǒng)發(fā)育分析其進化起源及在玉米干旱脅迫中的表達水平,為進一步研究CDPK基因家族在干旱脅迫下的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料:玉米自交系B73,實驗室自交繁育。

生長條件:在培養(yǎng)室中培養(yǎng)玉米自交系B73幼苗(ZeamaysL. cv) 在25℃/22℃(白天和夜間)條件下,光合有效輻射200 μmol/(m2·s),光周期16/8 h(白天和夜間),持續(xù)2～3周。

1.2 方 法

1.2.1 搜索玉米全基因組數(shù)據(jù)庫CDPK基因

從擬南芥信息資源(http://www.Arabidopsis.org/)和水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)或GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)分別下載了34個和30個水稻CDPKs的蛋白質(zhì)序列。玉米基因組數(shù)據(jù)庫的序列從(http://www.maizesequence.org/ index.html)下載。為鑒定玉米CDPK基因家族,擬南芥和水稻的CDPKs蛋白序列分別用檢索玉米基因組和NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTP。序列的一個自BLAST被執(zhí)行到刪除冗余。所有假定的候選基因均通過InterProScan程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)手工驗證,以確認激酶結(jié)構(gòu)域的存在。使用Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/search)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)資源進一步檢查所有獲得的蛋白質(zhì)序列。

1.2.2 玉米CDPK系統(tǒng)發(fā)育及重復(fù)分析

采用Clustal X比對多個氨基酸序列,利用MEGA5.0程序建立系統(tǒng)發(fā)育樹。按照定義基因重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn):比對長度包括>80%的長基因;比對區(qū)域有身份>80%;緊密連接基因只計算一次重復(fù)事件,研究玉米B73中CDPK基因的重復(fù),將所有在玉米基因組中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因用Clustal X比對,用MEGA v5.0進行計算。

1.2.3 干旱脅迫處理

當(dāng)玉米幼苗在28℃的培養(yǎng)室中生長至三葉期(大概14 d左右)進行干旱脅迫處理。處理后按不同時間間隔采集樣品,立即冷凍于N2液體并放置在-80℃冰箱中備用。

1.2.4 RNA分離和實時定量RT-PCR表達分析

利用Trizol試劑和從玉米幼苗(不同干旱時間處理后)的根部按照說明書(Invitrogen公司,Carlsbad,CA,USA)提取總RNA。第一鏈cDNA用First strand cDNA Synthesis kit (Fermentas,USA)合成。實時定量RT-PCR反應(yīng)在Bio-RAD MyiQTM實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-RAD,美國)中進行,使用TransStart Top Green qPCR SuperMix (TransGen,中國),并根據(jù)制造商的說明進行。每個PCR反應(yīng)(20 μL)含2 × real-time PCR Mix(含SYBR Green I) 10 μL,每個引物0.5 μL和適當(dāng)?shù)南♂尩腸DNA。熱循環(huán)條件為95℃ 30 s,然后為95℃ 15 s,55～60℃ 30 s,72℃ 15 s。所有qRT-PCR分析均以Zmactin基因為內(nèi)參。每個處理獨立進行,共3次重復(fù)。根據(jù)系統(tǒng)的2-ΔΔCt方法計算相對基因表達量,所使用的引物均列在附件表S1中。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米CDPK基因家族成員的全基因組鑒定

研究表明,玉米中含有39個推定的CDPK基因,分別命名為ZmCDPK1-ZmCDPK39,包括6個已知的CDPKs。雖然玉米基因組(～2 300 Mb)遠大于擬南芥(125 Mb)和水稻(389 Mb),但玉米CDPK基因總數(shù)與擬南芥和水稻的相近。39個CDPKs均具有保守的CDPK結(jié)構(gòu)域,包括N端可變結(jié)構(gòu)域、1個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、1個自抑制結(jié)構(gòu)域和1個鈣調(diào)素類似結(jié)構(gòu)域。在擬南芥、水稻和小麥中,許多CDPKs在其高度可變N端結(jié)構(gòu)域的開頭具有與膜關(guān)聯(lián)的潛在豆蔻?；?在第二位置有1個Gly殘基。39個玉米CDPKs中的19個被預(yù)測為膜關(guān)聯(lián)的豆蔻?；颉Ｆ渲?15個CDPKs在3、4或5位點上至少有1個Cys殘基,這是潛在的棕櫚?；稽c。大多數(shù)玉米CDPKs含有4個EF基團,而ZmCDPK24有3只EF手。表1

2.2 玉米CDPK基因家族系統(tǒng)發(fā)育

研究表明,從完整的CDPK氨基酸序列中構(gòu)建了1個無根樹,39個ZmCDPKs可以分為4組,屬于CDPK家族。第I組含有15個來自玉米的CDPKs,11個來自水稻,10個來自擬南芥。ZmCDPK5和ZmCDPK6與OsCDPK13高度相似,ZmCDPK5和ZmCDPK6可能參與了非生物脅迫。第二類包含11個玉米CDPKs,8個水稻CDPKs,13個擬南芥CDPKs。ZmCDPK29與OsCDPK12相似性達100%。第III組含有10個玉米CDPKs,8個水稻CDPKs和8個擬南芥CDPKs。ZmCDPK38與OsCDPK21的氨基酸序列同源性接近100%。第IV組包含3個來自玉米,2個來自水稻,3個來自擬南芥。ZmCDPK18與AtCDPK28在氨基酸水平上有91%的相似性。 大多數(shù)玉米-水稻同源基因具有相似的N-肉豆素化基序,EF手數(shù)和基因結(jié)構(gòu)。圖1

2.3 玉米CDPK基因結(jié)構(gòu)組織和染色體定位

研究表明,根據(jù)預(yù)測序列確定玉米CDPK基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。同一組中的大多數(shù)成員具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。玉米I - III組的CDPKs包含2～9個外顯子,而IV組CDPKs包含11～12個外顯子,與擬南芥和水稻CDPKs的外顯子數(shù)一致。在所有3個物種中,每個類群中都存在著保守的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。對CDPKs的染色體定位顯示,其中39個CDPKs分布在玉米的全部10個染色體上。在擬南芥和水稻中,34個擬南芥CDPK和30個水稻CDPK基因也分布在各自基因組的全部染色體上,CDPK基因廣泛分布在植物基因組中。CDPK基因在玉米每條染色體上的分布是非隨機的,一些CDPKs似乎聚集在特定的染色體上,包括染色體1、2、3、4、5、7、8和10。6號染色體有2個CDPK基因,而9號染色體未發(fā)現(xiàn)編碼1個CDPK基因。圖2,圖3

2.4 玉米CDPK基因在干旱脅迫下的表達譜

研究表明,CDPK基因參與了玉米對環(huán)境刺激的各種生理適應(yīng),而且CDPK基因的表達也受到激素、鹽、冷、旱、熱和傷等多種刺激的調(diào)控。利用qRT-PCR技術(shù)檢測了39個CDPKs的表達水平。與處理相比除了ZmCDPK2、ZmCDPK3、ZmCDPK9和ZmCDPK32無明顯變化外,其它CDPK基因的表達均發(fā)生了改變,ZmCDPK6、ZmCDPK11、ZmCDPK12、ZmCDPK14、ZmCDPK15、ZmCDPK19、ZmCDPK22、ZmCDPK25、ZmCDPK28、ZmCDPK31和ZmCDPK37上調(diào),上調(diào)幅度為1.2～1.8倍。相反,ZmCDPK4、ZmCDPK5、ZmCDPK6、ZmCDPK7、ZmCDPK10、ZmCDPK13、ZmCDPK18、ZmCDPK20、ZmCDPK21、ZmCDPK23、ZmCDPK24、ZmCDPK29、ZmCDPK30、ZmCDPK31、ZmCDPK34和ZmCDPK36明顯下調(diào)。 圖3

表1 玉米CDPKs的特征

注:利用39個玉米、29個水稻和34個擬南芥的CDPK蛋白全長序列,使用MEGA5.0程序建立玉米CDPK基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。棕色代表玉米CDPK基因;藍色代表水稻CDPK基因,黑色代表擬南芥CDPK基因

注:染色體編號在每個染色體表示法的頂部標(biāo)明

注:圖中所示數(shù)字表示相對信號強度值,采用了分層聚類進行數(shù)據(jù)分析

3 討 論

玉米基因組已經(jīng)完成測序[31,32],OsCDPK13已表明與低溫、干旱和鹽脅迫的響應(yīng)[18]有關(guān),OsCDPK12為耐鹽調(diào)節(jié)因子和抗稻瘟病負調(diào)控因子[20],OsCDPK21對水稻具有的耐鹽性[19],AtCDPK28通過改變NAC轉(zhuǎn)錄因子和赤霉素穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子的表達來調(diào)節(jié)植物莖的伸長和維管的發(fā)育[32]。擬南芥以及其他物種的CDPKs已經(jīng)有了報道[21-26]。根據(jù)擬南芥CDPKs和水稻CDPKs全基因組分析發(fā)現(xiàn)的34個CDPK基因和29個CDPK基因,推測CDPKs在玉米中是由1個大的多基因家族編碼的[21,22]。只有少數(shù)玉米CDPK家族成員被鑒定[27-30]。由于玉米全基因組的基因草圖序列已經(jīng)完成,進行了玉米數(shù)據(jù)庫搜索,利用之前已識別的玉米CDPKs的整個氨基酸序列和編碼CDPKs的玉米全長cDNA克隆來識別玉米基因組中的CDPK家族基因。運用TBLASTN算法評分為>90的基因組序列作為候選序列,采用BLASTX程序和基序掃描對候選序列進行分析,以區(qū)分CDPKs與其他相關(guān)蛋白激酶。通過分析確定了在玉米基因組中含有39個推測的玉米CDPK基因,根據(jù)CDPK基因的命名方法命名為ZmCDPK1-ZmCDPK39。這些玉米CDPK基因都具有CDPK基因家族的典型結(jié)構(gòu),包括N端可變結(jié)構(gòu)域、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、自抑制結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白樣結(jié)構(gòu)域。將39個玉米CDPKs分為4個不同的類,所有的玉米CDPK基因分布在除9號染色體外的所有染色體上。然而,在玉米基因組中沒有觀察到CDPK基因的串聯(lián)導(dǎo)向簇。因此,CDPK基因在玉米基因組中沒有發(fā)生串聯(lián)復(fù)制。

玉米CDPK基因?qū)δ承┐碳さ姆磻?yīng)有調(diào)控作用,并從這些數(shù)據(jù)推斷其功能。研究熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)的結(jié)果表明,大多數(shù)玉米CDPK基因的表達在干旱逆境脅迫下都有改變并表現(xiàn)出不同的表達模式。由于Ca2+作為一種通用的第二信使,這些玉米CDPK基因的改變在干旱等非生物脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。

在玉米全基因組中鑒定出39個CDPK基因,大多數(shù)CDPKs及其相關(guān)蛋白激酶的功能仍不清楚。探明該基因家族成員的功能差異,還需要采用多種方法進行進一步的研究。

4 結(jié) 論

4.1從玉米中鑒定出了39個CDPK基因。

4.2由于有共同的蛋白質(zhì)基序和外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu),每個群體的成員可能有最近的共同的進化起源關(guān)系,并錨定在特定的玉米染色體上。

4.3在干旱脅迫下,大多數(shù)玉米CDPK基因的表達在干旱逆境脅迫下都有改變并表現(xiàn)出不同的表達模式。大多數(shù)玉米CDPK基因家族成員可能是干旱脅迫信號通路中的調(diào)控因子。