潮灘濕地硝化螺菌的代謝潛力和環(huán)境適應(yīng)機(jī)制

陳國(guó)浩, 毛鐵墻, 董宏坡, 歐亞飛, 張家偉

（華東師范大學(xué) 河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200241）

0 引 言

硝化過(guò)程是氮素轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié), 包括氨氧化作用和亞硝酸鹽氧化作用, 主要是由微生物主導(dǎo)[1-2].氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)主要負(fù)責(zé)將氨氧化為亞硝酸鹽[3-4], 而亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(nitrite-oxidizing bacteria, NOB)主要負(fù)責(zé)將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽[5]. 盡管最近發(fā)現(xiàn)了能夠直接將氨氧化為硝酸鹽的細(xì)菌[6], 即全程氨氧化細(xì)菌(complete ammonia oxidizer, Comammox), 但至今仍未在海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)Comammox 的基因組序列[7],故NOB 對(duì)于亞硝酸鹽的氧化仍為硝酸鹽的主要來(lái)源之一[8-9].

硝化螺菌(Nitrospira)是NOB 中多樣性最為豐富的屬, 至今已發(fā)現(xiàn)至少有6 個(gè)世系(lineages)[10],然而, 僅5 個(gè)lineages 的亞硝酸鹽氧化還原酶(nitrite oxidoreductase, NXR)基因序列[11]和3 個(gè)lineages的基因組被揭示. 特別地, lineage Ⅲ的培養(yǎng)代表和基因組至今未被發(fā)現(xiàn), 這意味著Nitrospira仍然存在較多未知的類(lèi)群. 其中, Comammox 在進(jìn)化上屬于Nitrospiralineage Ⅱ, 是近年來(lái)氮循環(huán)中的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn), 該細(xì)菌可以獨(dú)立地完成兩步硝化過(guò)程[6].Nitrospira廣泛分布在土壤、淡水、熱泉、地下水、人工系統(tǒng)和海洋中[10-12]. 根據(jù)調(diào)查和生理實(shí)驗(yàn),Nitrospira的分布和多樣性受到鹽度、溫度和底物濃度等因素的影響[13-15].

近年來(lái), 發(fā)現(xiàn)Nitrospira不僅存在全球分布的特征, 還有著多樣的代謝功能和生存方式. 有的Nitrospira編碼著脲酶和氰酸酶基因[16-17], 能將這些有機(jī)氮素降解為氨, 為氨氧化微生物提供能源. 特別地, 部分ComammoxNitrospira能直接利用尿素和氰酸鹽作為能源[6,18-19], 拓寬了對(duì)Nitrospira利用氮素的認(rèn)識(shí). 另外,Nitrospira還可利用氫氣、甲酸鹽和硫化物作為電子供體驅(qū)動(dòng)生長(zhǎng)[16,19-20]. 這些功能潛力對(duì)氮循環(huán)和Nitrospira自身生長(zhǎng)均至關(guān)重要. 然而, 目前從潮灘濕地獲得的Nitrospira基因組及培養(yǎng)樣品較為缺乏, 對(duì)其在潮灘濕地中的功能認(rèn)識(shí)非常有限. 因此, 利用一些新技術(shù)獲取更多基因組對(duì)Nitrospira進(jìn)行研究很必要.

潮灘濕地是陸地和海洋的交界地帶, 其在全球的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用. 大量富含氮的生活污水和農(nóng)業(yè)肥料通過(guò)徑流作用在潮灘濕地富集, 經(jīng)過(guò)一系列的轉(zhuǎn)化作用后, 部分流入海洋.根據(jù)已有的報(bào)道,Nitrospira在人工污水處理系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用, 具有較高的功能多樣性[18-19,21].天然的潮灘濕地, 包括紅樹(shù)林濕地、鹽沼濕地和河口等, 是龐大而重要的污水處理系統(tǒng), 含有豐富多樣的Nitrospira物種[22-25]. 為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Nitrospira在潮灘濕地中的功能, 本研究選取了中國(guó)沿海5 個(gè)跨不同緯度的潮灘濕地, 從沉積物樣品中恢復(fù)了14 個(gè)Nitrospira基因組. 通過(guò)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育、代謝通路和環(huán)境適應(yīng)等方面的分析, 深入研究了這些基因組, 以期為理解Nitrospira在潮灘濕地中的重要生態(tài)功能提供更多的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究站位和采樣

本研究從中國(guó)沿海的3 個(gè)潮灘濕地獲得12 個(gè)沉積物樣品, 包括遼河口鹽沼濕地(LH01 和LH02)、崇明島東灘濕地(CM01 和CM02)、三亞青梅港紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)(QM). 使用重力柱采集器,在崇明島東灘濕地和三亞青梅港紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)獲得3 個(gè)1 m 深的沉積物柱, 且每個(gè)沉積柱樣品被平均分割成3 ～ 4 份; 在遼河口鹽沼濕地獲得兩個(gè)表層(0 ～ 5 cm)沉積物樣品(LH01 和LH02). 所有樣品采集完后立即裝進(jìn)密封的無(wú)菌樣品盒, 并放入裝有干冰的儲(chǔ)物箱中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室, 將樣品儲(chǔ)藏在 —80℃冰箱中用于測(cè)序和理化分析. 另外, 兩個(gè)潮灘濕地的宏基因組樣品數(shù)據(jù)(表1)從開(kāi)放的公共數(shù)據(jù)庫(kù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(the national center for biotechnology information, NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得.

表1 樣品的物理和化學(xué)性質(zhì)Tab. 1 Physical and chemical properties of the samples

1.2 DNA 提取和測(cè)序

使用DNA 提取試劑盒 (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA), 從5 ～ 10 g 沉積物中提取基因組DNA, 使用Qubit 2.0 和Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量. 檢測(cè)合格的 DNA 樣品被用于文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序. 宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)由Illumina HiSeq 2500 儀器生成, 每個(gè)樣品大約獲得60 G 雙端原始測(cè)序序列數(shù)據(jù).

1.3 宏基因組組裝和基因組重構(gòu)

本研究共獲得15 個(gè)宏基因組數(shù)據(jù)(表1), 包括從NCBI 下載的3 個(gè)數(shù)據(jù) (YD、ZN01 和 ZN02) ,其中, YD 由2 個(gè)較小的宏基因組混合組成. 宏基因組拼接與分箱步驟包括: 先使用Trimmomatic 軟件[26]對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)量裁剪, 再使用MEGAHIT 軟件[27]進(jìn)行組裝, 參數(shù)為(--k-min 27, --k-max 127,--k-step 10), 然后將拼接得到的序列使用MetaBAT 軟件[28]進(jìn)行分箱, 最后使用CheckM 軟件[29]將分箱得到的基因組進(jìn)行完整度和污染度的質(zhì)量分析. 多樣的基因組組裝參數(shù)通過(guò)QUAST[30]進(jìn)行評(píng)估.基因組的分類(lèi)使用GTDB-TK 工具[31]獲得, 僅屬于Nitrospirae 門(mén)的基因組被關(guān)注. 序列分類(lèi)通過(guò)CAT 軟件 (https://github.com/dutilh/CAT/releases/tag/v5.2.3)識(shí)別, 分類(lèi)成其他門(mén)的序列被移除;同時(shí), 不一致的序列被CheckM 軟件[29]基于單拷貝基因進(jìn)行識(shí)別和手動(dòng)移除. 最后, 對(duì)候選的基因組基于GC (guanine and cytosine)含量、覆蓋度和四核苷酸頻率使用RefineM[32]進(jìn)行檢查和校正, 完整度大于70%和污染度小于5%的基因組會(huì)被進(jìn)一步分析.

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析和基因組注釋

為確定重構(gòu)基因組的系統(tǒng)發(fā)育地位, 本研究從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了Nitrospirae 門(mén)的基因組. 通過(guò)使用GTDB-TK 軟件[31]對(duì)細(xì)菌的120 個(gè)標(biāo)記蛋白進(jìn)行串聯(lián), 并使用IQ-TREE 軟件[34]構(gòu)建最大似然樹(shù), 利用iTOL[35]對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化. 為進(jìn)一步識(shí)別基因組的進(jìn)化地位, 使用Barrnap 軟件(https://github.com/tseemann/barrnap)預(yù)測(cè)基因組的16S rRNA 基因. 同時(shí), 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了其他的16S rRNA 基因, 使用MAFFT 軟件[36]對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì), 并使用BMGE 軟件[37]進(jìn)行切邊處理. 最后, 使用IQ-TREE 軟件[34]構(gòu)建最大似然樹(shù)和利用iTOL[35]對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化.

為探究氰酸酯酶基因的進(jìn)化地位, 從NCBI 中下載已知的NOB 和AOA 的氰酸酶基因的氨基酸序列及相似的部分序列, 并利用HMMER3[38]識(shí)別公共數(shù)據(jù)庫(kù)及本研究獲得的Nitrospira屬基因組中的氰酸酶基因. 比對(duì)所有這些氨基酸序列, 對(duì)所得結(jié)果使用IQ-TREE 軟件[35]進(jìn)行最大似然樹(shù)的構(gòu)建.

使用Prodigal 軟件[39]對(duì)基因組的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)進(jìn)行預(yù)測(cè), 并將核酸序列翻譯為蛋白序列. 然后, 使用BlastP 工具[40]比對(duì)COG 和NCBI 非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù), 進(jìn)行蛋白功能的注釋(E-value 閾值 ＜ 1 × 10—5). 同時(shí), 通過(guò)在線(xiàn)的KASS[41]工具進(jìn)行注釋.

2 結(jié)果與討論

2.1 Nitrospira 基因組的恢復(fù)

從5 個(gè)跨越溫帶和熱帶的潮灘濕地沉積物中, 使用宏基因組測(cè)序的方法拼接與組裝得到14 個(gè)較高質(zhì)量(完整度＞70%、污染度＜5%)的Nitrospira基因組 (metagenome-aassembled genomes, MAGs)(表2). 依據(jù) 大 于95%的種 間 平均 核 酸 相 似度 (average nucleotide identity, ANI)閾 值[42], 這 些MAGs 可被劃分為10 個(gè)新物種. 同時(shí), 基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)顯示, 這些MAGs 位于3 個(gè)不同lineages 中, 包括lineage Ⅱ、lineage Ⅳ和一個(gè)未被定義的系統(tǒng)發(fā)育分支. 其中, 3 個(gè)MAGs 與clade A comammoxNitrospira聚在一起. 依據(jù)已有的研究, lineage Ⅱ和lineage Ⅳ分別來(lái)自?xún)蓚€(gè)完全不同的生態(tài)環(huán)境系統(tǒng), 分別為陸地和海洋[10], 這意味著潮灘濕地的Nitrospira有更高的物種多樣性. 有趣的是,基因組進(jìn)化樹(shù)顯示, QMm6 和QMb135 這兩個(gè)Nitrospira物種形成獨(dú)立的一簇(圖1), 且不屬于任何已知的世系, 可能為新的Nitrospira物種.

圖1 基于120 個(gè)保守串聯(lián)蛋白構(gòu)建的Nitrospira 基因組最大似然樹(shù)Fig. 1 Nitrospira genomic maximum likelihood tree based on 120 conserved proteins

表2 從潮灘濕地宏基因組組裝中提取的14 個(gè)硝化螺旋菌的基因組特征Tab. 2 Genomic features of 14 Nitrospira MAGs recovered from metagenomic assembly in tidal flat wetlands

為了進(jìn)一步揭示由QMm6 和QMb135 聚類(lèi)成的這一未知的系統(tǒng)發(fā)育分支, 基于Nitrospira16S rRNA 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2). 本研究發(fā)現(xiàn)16S rRNA 基因樹(shù)與Nitrospira基因組樹(shù)有著近乎一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 且QMm6 和QMb135 這兩個(gè)未曾被揭示的基因組所含的16S rRNA 基因序列與前人報(bào)道的lineage Ⅲ中的16S rRNA 序列聚類(lèi)成一簇, 這意味著這兩個(gè)MAGs 隸屬于此前被劃分的lineage Ⅲ[12]. 這一獨(dú)特的lineage 從發(fā)現(xiàn)至今已超過(guò)20 年, 但只有相應(yīng)的16S rRNA 基因被揭示, 而該分支的培養(yǎng)樣品和基因組均未被獲得[11-12], 因此, 其生理功能和代謝潛力仍有著很大的未知. 本研究首次發(fā)現(xiàn)的這兩個(gè)隸屬于lineage Ⅲ的MAGs 有著較高的恢復(fù)質(zhì)量(完整度分別為95.91%和96.82%),在中國(guó)三亞青梅港紅樹(shù)林沉積物中獲得. 同時(shí), 對(duì)16S rRNA 序列的分析發(fā)現(xiàn), 該lineage 的成員分布在深海沉積物[43-44]、陸地喀斯特巖洞[45-46]和鹽堿土環(huán)境中 (圖2). 而本研究在紅樹(shù)林沉積物中首次發(fā)現(xiàn)了lineage Ⅲ, 擴(kuò)大了它們的生境分布范圍.

圖2 基于Nitrospira 16S rRNA 序列構(gòu)建的最大似然樹(shù)Fig. 2 Maximum likelihood tree based on Nitrospira 16S rRNA sequences

2.2 代謝潛力分析

本研究重構(gòu)了14 個(gè)NitrospiraMAGs 的代謝途徑(圖3), 結(jié)果表明, 這些MAGs 有著典型的Nitrospira所具備的中心碳代謝和能量傳遞系統(tǒng), 如還原型三羧酸循環(huán)、糖酵解/糖質(zhì)新生及磷酸戊糖途徑等. 盡管少部分MAGs 缺失亞硝酸鹽氧化還原酶alpha 亞基和亞硝酸鹽氧化還原酶beta 亞基, 但有多個(gè)拷貝的亞硝酸鹽氧化還原酶gamma 亞基存在于這些基因組中. 在3 個(gè)Comammox 的基因組中, 僅CM01m262 含有氨單加氧酶gamma 亞基和CM01s42 含有羥胺氧化還原酶(hydroxylamine oxidoreductase, HAO), 但它們均含有區(qū)別于嚴(yán)格亞硝酸鹽氧化Nitrospira的Rh 類(lèi)型氨轉(zhuǎn)運(yùn)體[18,47],意味著這3 個(gè)MAGs 為典型的ComammoxNitrospira. 這些MAGs 除具有進(jìn)行亞硝酸鹽氧化或全程氨氧化的作用外, 還具有更多的代謝潛力.

圖3 重構(gòu)14 個(gè)Nitrospira 基因組的代謝途徑Fig. 3 Metabolic pathways of 14 Nitrospira MAGs

近年來(lái), 研究者們發(fā)現(xiàn)Nitrospira可將尿素或氰酸鹽降解為銨鹽, 通過(guò)“互喂作用”為氨氧化微生物和Comammox 提供底物[16-18,48]. 尿素的裂解已經(jīng)在一些富集培養(yǎng)的Comammox 菌株(Ca.Nitrospira nitrosa,Ca.Nitrospira nitrificans和Ca.Nitrospira inopinata) 中被觀察到[6,47]. 在本研究中, 脲酶基因在兩個(gè)Comammox MAGs(CM01m262 和 YD_bin17)中被識(shí)別(圖3), 其中YD_bin17 含有部分相應(yīng)的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng), 這意味著尿素也可以被這些來(lái)自潮灘濕地的Comammox 所利用. 這些Comammox 主要存在于鹽度較低的CM01 和YD 站位中. 最近的研究表明, 有機(jī)肥的使用和工廠(chǎng)產(chǎn)生了大量的尿素, 這些尿素通過(guò)徑流進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)中, 并在河口濕地中積累[45], 導(dǎo)致河口濕地富營(yíng)養(yǎng)化[49]和水體缺氧[50], 而本文獲得的這些Comammox 可以直接轉(zhuǎn)化尿素并減緩尿素的積累. 盡管尿素的利用已經(jīng)在一些富集培養(yǎng)的典型Nitrospira中被觀察到[16,51], 然而, 本研究獲得的所有11 個(gè)典型的Nitrospira基因組均沒(méi)有包含脲酶基因, 這意味著典型的Nitrospira與氨氧化微生物通過(guò)降解尿素進(jìn)行互惠生長(zhǎng)的過(guò)程在潮灘濕地中可能并不普遍. 研究表明, 尿素可自發(fā)地裂解為氰酸鹽, 廣泛存在于環(huán)境中并參與氮循環(huán)[52-53]. 本研究獲得的6 個(gè)NitrospiraMAGs 中含有氰酸酯酶基因(圖3), 其中3 個(gè)來(lái)自CM02 和QM 站位的NitrospiraMAGs 編碼著相應(yīng)的氰酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體, 表明這些Nitrospira可分解潮灘濕地環(huán)境中的氰酸鹽為銨鹽, 并為硝化微生物提供能源, 對(duì)氮素循環(huán)發(fā)揮著重要的作用.本研究中的3 個(gè)Comammox MAGs 均不含有氰酸酯酶基因, 這些基因僅在污水處理系統(tǒng)的幾個(gè)ComammoxNitrospira成員中被發(fā)現(xiàn)[18-19]. 令人意外的是, 從lineage Ⅲ兩個(gè)基因組中發(fā)現(xiàn)的氰酸酯酶與此前在其他Nitrospira成員中發(fā)現(xiàn)的有著不同的進(jìn)化關(guān)系(圖4(a)), 它們之間有著較低的氨基酸相似度(＜40%); 前人發(fā)現(xiàn)的Nitrospira中的氰酸酯酶與AOA 菌株Nitrososphaera gargensis的氰酸酯酶有著更近的發(fā)育關(guān)系(圖4(b)), 而本研究獲得的這些序列與Nitrospinae 門(mén)和厭氧氨氧化細(xì)菌(anaerobic ammonium oxidation, anammox)的氰酸酯酶有著更近的進(jìn)化關(guān)系(圖4(c)). 在AOA 菌株Nitrososphaera gargensis中, 氰酸酯酶可分解氰酸鹽產(chǎn)生氨作為單一能源[17]; 而海洋中的anammox和Nitrospina細(xì)菌也表現(xiàn)出降解氰酸鹽的潛力, 可以使用氰酸鹽作為氮源, 或基于對(duì)氨氧化微生物的“互喂” 機(jī)制作為間接能源[54-56]. 在潮灘濕地MAGs 中發(fā)現(xiàn)的這些氰酸酯酶氨基酸序列均含有保守的Arg96、Glu99、Ser122 活性位點(diǎn)殘基[57](圖5), 這意味著Nitrospira成員中發(fā)現(xiàn)的這兩種有著不同親緣關(guān)系的氰酸酯酶均具有裂解氰酸鹽的潛力. 這些新發(fā)育分支的氰酸酯酶氨基酸序列與Nitrospinasp.(MBM14886.1)有著較高的氨基酸相似度(75% ～ 82%), 意味著它們之間可能發(fā)生了水平基因轉(zhuǎn)移事件. 在Nitrospira中新的氰酸酯酶進(jìn)化分支的這一發(fā)現(xiàn), 拓展了研究人員對(duì)Nitrospira成員中氰酸酯酶的認(rèn)知, 表明該酶在Nitrospira中的分布可能更為多樣化. 這兩個(gè)進(jìn)化分支的氰酸酯酶基因廣泛存在于Nitrospira不同的lineage 基因組中, 而這些不同lineage 的Nitrospira廣泛分布于全球的各種生態(tài)系統(tǒng), 包括開(kāi)闊大洋和陸地生態(tài)系統(tǒng), 意味著氰酸鹽在全球廣泛被Nitrospira作為有機(jī)氮降解的底物, 并為氨氧化微生物提供能源.

圖4 氰酸酯酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of cyanase amino acid sequences

圖5 氰酸酯酶氨基酸位點(diǎn)的比對(duì)Fig. 5 Alignment of cyanase amino acid sites

特別地, 這些NitrospiraMAGs 可能在參與有機(jī)氮轉(zhuǎn)化方面具有更大的功能潛力. 本研究中獲得的9 個(gè)NitrospiraMAGs 中注釋有“nitrilase/cyanide hydratase and apolipoprotein N-acyltransferase”或“carbon-nitrogen hydrolase family protein”, 它們屬于氮-碳裂解酶或腈水解酶超家族蛋白, 所有這些蛋白質(zhì)似乎都參與了有機(jī)氮化合物的還原和氨的產(chǎn)生[58-59](圖3). 另外, 本文還注意到多個(gè)站位的NitrospiraMAGs 含有將一些氨基化合物降解產(chǎn)生氨的酶, 包括煙酰胺酶、酰胺酶和胺氧化酶, 這意味著Nitrospira可能有更多未被揭示的與氨氧化微生物耦合生長(zhǎng)的機(jī)制, 這些酶可能對(duì)潮灘濕地有機(jī)氮的去除發(fā)揮著關(guān)鍵的作用.

在本研究中,NitrospiraMAGs 含有多種潛在的替代能源, 暗示著Nitrospira在潮灘濕地環(huán)境中有更廣泛的生存策略. 甲酸已被發(fā)現(xiàn)作為一些Nitrospiralineage Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ菌株的電子供體和碳源[16,21,60].僅4 個(gè)來(lái)自CM01、ZN02 和QM 站位的NitrospiraMAGs 含有甲酸脫氫酶, 意味著這些Nitrospira可能有著利用甲酸鹽作為生長(zhǎng)能源的潛力. 盡管NitrospiraMAGs 被識(shí)別出含有多種有機(jī)物利用途徑,但大多數(shù)有機(jī)物被驗(yàn)證并不能維持Nitrospira的持續(xù)生長(zhǎng)[15,61-62]. 有研究表明,Nitrospira在混合營(yíng)養(yǎng)中能更好地生長(zhǎng)[12,60-61], 意味著其可能利用部分有機(jī)物作為碳源, 這些過(guò)程可能對(duì)潮灘濕地中有機(jī)物的去除有著重要作用. 10 個(gè)NitrospiraMAGs 含有周質(zhì)的亞硫酸鹽脫氫酶(sulfite oxidoreductase,SOR)和4 個(gè)lineage Ⅱ MAGs 含有硫化氫氧化還原酶(sulfide/quinone oxidoreductase, SQR) (圖3),這兩種酶可催化亞硫酸鹽(SO3—)或硫化氫 (H2S)的氧化, 并產(chǎn)生電子[63-65]; 盡管這兩種酶也存在于Nitrococcus和Nitrotoga中[66-67], 但仍缺乏相關(guān)的生理實(shí)驗(yàn)證實(shí)NOB 能夠利用這兩種酶催化相應(yīng)硫化物作為生長(zhǎng)能源. 另外,NitrospiraMAGs 含有不同類(lèi)型的氫氣氧化酶, 其中11 個(gè)MAGs 編碼著Group 3b 鎳鐵硫還原氫化酶(group 3b [Ni-Fe] sulfur-reducing hydrogenase, HYD), 該酶能將氫氣氧化并產(chǎn)生NADPH, 同時(shí)能消耗NADPH 將硫還原[55,66-68]. 3 個(gè)Comammox MAGs 和來(lái)自CM02 站位的CM02s178 (圖3) 中含有假定的Group 4 氫化酶 (putative group 4 hydrogenase, HYF). 但該酶的大亞基缺失兩對(duì)在鎳鐵類(lèi)型氫化酶中均存在的鎳鐵中心的半胱氨酸配體[69], 這一特征在其他典型Nitrospira中也被揭示[16,70], 暗示著該酶發(fā)揮著未知的功能. 來(lái)自QM 站位的QMb347 和QMm174 中含有Group 2a 鎳鐵氫化酶(group 2a [Ni-Fe] hydrogenase, HUP), 該酶在Nitrospira moscoviensis菌株中被證實(shí)能夠催化氫氣氧化, 從而獲得能量用于碳的固定和生長(zhǎng)[16].

2.3 Nitrospira 在潮灘濕地環(huán)境的適應(yīng)

許多研究表明, 潮灘濕地是重金屬和污染物積累的區(qū)域[71-73], 并且有著較大范圍的鹽度和底物濃度的變化[74]. 本研究獲得的Nitrospira基因組編碼著次氯酸鹽歧化酶、砷酸鹽還原酶和汞還原酶, 這或許能消除細(xì)胞對(duì)來(lái)自潮灘中的毒性[75-77]. 我們還發(fā)現(xiàn), 這些基因組編碼著超過(guò)氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶，這些酶能抵抗高濃度的活性氧(reactive oxygen species, ROS)[78]. 大部分的Nitrospira還編碼著碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA), 可以將進(jìn)入細(xì)胞的 H C轉(zhuǎn)化為CO2[79], 為還原型的三羧酸循環(huán)提供碳源. 根據(jù)報(bào)道, 大部分培養(yǎng)的Nitrospira含有鞭毛[51], 而我們獲得的14 個(gè)基因組中僅QM、ZN02 和LH01 站位中的3 個(gè)編碼著較完整的鞭毛系統(tǒng), 這意味著潮灘濕地中的Nitrospira可能有著獨(dú)立的生態(tài)位.

由于潮灘濕地有著較大的鹽度差, 故Nitrospira可能需要有特殊的代謝途徑來(lái)適應(yīng)鹽度變化較大的潮灘環(huán)境. 有研究表明,Nitrospira編碼著調(diào)節(jié)滲透壓的重要物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道, 包括水通道 (aquaporin Z, AqpZ)、機(jī)械離子感應(yīng)通道 (mechanosensitive ion channel, MSC)和甜菜堿ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[80-82].值得注意的是, 本研究獲得的MAGs 中, 僅隸屬于lineage Ⅳ和lineage Ⅲ的MAGs 編碼有H+/Na+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體和甘氨酸/甜菜堿ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體, 這些基因組主要來(lái)自鹽度更高(9‰ ～ 27‰)的QM 和LH 站位. 水通道蛋白僅在隸屬于lineage Ⅱ的3 個(gè)MAGs 中被發(fā)現(xiàn)(圖3), 這些基因組來(lái)自鹽度更低(＜5‰)的CM02 和ZN01 站位. 有研究表明, 許多生活在低營(yíng)養(yǎng)海洋環(huán)境中的細(xì)菌通常存在一些有機(jī)滲透物(甜菜堿、脯氨酸和甘露糖醇等)的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體[83], 使得這些細(xì)菌能夠更好地適應(yīng)高鹽度的海洋環(huán)境[84]. 這意味著在潮灘濕地中, 不同鹽度站位的Nitrospira成員有著不同的滲透壓調(diào)控機(jī)制, 高鹽度站位的Nitrospira可通過(guò)編碼有機(jī)滲透物的ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)適應(yīng)高鹽度的脅迫.

令人驚訝的是, 本研究獲得的這些NitrospiraMAGs 的抗病毒系統(tǒng)有著較高的多樣性(圖3), 大部分MAGs 編碼CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 相關(guān)蛋白. 然而,由于一個(gè)完整的CRISPR 防御系統(tǒng)至少含有一個(gè)核心的cas基因[85], 而本研究獲得的MAGs 中僅QMb347 和QMb135 含有核心的cas基因, 故而暗示著其他MAGs 可能不能利用CRISPR 系統(tǒng)進(jìn)行病毒的防御. 但有研究表明, 細(xì)菌的限制-修飾 (restriction-modification, R-M) 病毒免疫系統(tǒng)廣泛存在于原核生物中, 能攻擊進(jìn)入細(xì)胞的外來(lái)DNA[86]. 本研究獲得的NitrospiraMAGs 中注釋有Type Ⅰ -ⅢR-M 系統(tǒng)的關(guān)鍵基因 (Restriction endonuclease 和DNA methylase), 意味著該免疫系統(tǒng)可能在這些NitrospraMAGs 中發(fā)揮著重要的病毒防御作用. 此外, 毒素抗毒素系統(tǒng)(toxin-antitoxin, TA) 和流產(chǎn)感染系統(tǒng)(abortive infection system, Abi)的相關(guān)基因也普遍存在于這些MAGs 中, 這兩種免疫系統(tǒng)均采用自殺方式進(jìn)行病毒的抵抗[87-88]. 另外, QMm125 基因組中包含噬菌體排斥系統(tǒng) (bacteriophage exclusion, BREX) 的大部分基因, 也可能發(fā)揮著相應(yīng)的病毒防御功能[89]. 盡管噬菌體讓大量細(xì)菌感染致死并影響著微生物群落結(jié)構(gòu), 但同時(shí)也是驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)化和生物遺傳多樣性的重要?jiǎng)恿90]. 特別地,NitrospiraMAGs 中發(fā)現(xiàn)含有大量噬菌體組裝和侵染相關(guān)基因, 這表明噬菌體介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT) 可能廣泛發(fā)生在Nitrospira群體中[91-92], 并推動(dòng)Nitrospira基因組趨于多樣化和適應(yīng)全球廣泛的生態(tài)環(huán)境.

本研究中從潮灘濕地恢復(fù)的NitrospiraMAGs 分布在較寬的緯度范圍 (18.22°N ～ 40.78°N), 這些長(zhǎng)期棲息在不同緯度位置的Nitrospira可能受到不同溫度的脅迫. 研究表明, 極端嗜熱蛋白需要更多的帶正電荷的殘基及通過(guò)犧牲極性氨基酸殘基來(lái)保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[93]. 因此, 帶電氨基酸和極性氨基酸的百分比差異(difference between the proportions of charged versus polar (non-charged) amino acids, CvP-bias)常被用來(lái)研究微生物的熱適應(yīng)能力[94-95]. 我們計(jì)算了14 個(gè)Nitrospira基因組的CvPbias 值, 將每個(gè)站位基因組的CvP-bias 平均值與緯度位置進(jìn)行線(xiàn)性回歸. 結(jié)果顯示, CvP-bias 平均值與緯度之間有一定負(fù)相關(guān)性, 但并不顯著 (y= — 5.708x+ 46.58,R2= 0.203 8,p= 0.445 4; 圖6(a)).最小和最大的平均基因組CvP-bias 值分別對(duì)應(yīng)最高緯度和最低緯度. 這意味著, 在有更高溫度的較低緯度位置,NitrospiraMAGs 可能有更高的CvP-bias 值, 即需要使用更多的帶電氨基酸以適應(yīng)更高的溫度. 但這一結(jié)果并不顯著, 這可能與基因組和站位數(shù)量有關(guān). 為進(jìn)一步驗(yàn)證緯度及溫度與Nitrospira基因組CvP-bias 值關(guān)系的顯著性, 所有含緯度信息(1°N ～ 82°N)的99 個(gè)Nitrospira基因組的CvP-bias 值被計(jì)算. 為克服不同生境差異帶來(lái)的偏差, 取每10° 緯度間的基因組CvP-bias 值的平均值, 且熱泉基因組被假定為赤道樣品(0°), 并與緯度位置進(jìn)行線(xiàn)性回歸. 線(xiàn)性擬合結(jié)果顯示, 基因組的CvP-bias 與緯度呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性 (y= — 67.99x+ 227.7,R2= 0.773 9,p＜ 0.005; 圖6(b)).這表明, 生活在較低緯度和熱環(huán)境的Nitrospira在一定程度上擁有更多帶電氨基酸來(lái)維持蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性, 而在高緯度位置的Nitrospira普遍有更低的CvP-bias 值.

圖6 緯度與平均CvP-bias 值的線(xiàn)性關(guān)系Fig. 6 Linear relationship between latitude and CvP-bias

3 結(jié) 論

本研究獲得了不同緯度位置潮灘濕地的宏基因組樣品, 并分析了14 個(gè)從中恢復(fù)的NitrospiraMAGs 的系統(tǒng)發(fā)育、功能潛力和潮灘環(huán)境適應(yīng)機(jī)制. 結(jié)果顯示, 這些NitrospiraMAGs 有著豐富的物種多樣性和生態(tài)功能潛力. 本研究首次獲得了兩個(gè)隸屬于Nitrospiralineage Ⅲ的基因組, 暗示潮灘濕地含有未被揭示的類(lèi)群. 代謝通路分析發(fā)現(xiàn), 這些NitrospiraMAGs 有多種可選擇能源利用途徑、壓力防御方式和病毒抵抗機(jī)制. Comammox 和典型的Nitrospira在尿素和氰酸酶的利用上存在明顯差異. 此外, 更多含氮有機(jī)化合物可能被這些Nitrospira作為硝化作用的能源, 這對(duì)潮灘濕地有機(jī)氮素的去除起著重要作用. 同時(shí), 這些Nitrospira來(lái)自不同的緯度位置, 研究表明了它們?cè)诓煌恼疚粦?yīng)對(duì)鹽度、溫度和含氮化合物等展現(xiàn)出不同的適應(yīng)策略. 這些研究結(jié)果加深了對(duì)Nitrospira在代謝潛力和環(huán)境適應(yīng)機(jī)制上的認(rèn)識(shí), 為深入理解潮灘濕地的氮循環(huán)過(guò)程提供了重要的依據(jù)。