血清miRNA-210、miRNA-223預(yù)測(cè)新生兒缺血缺氧性腦病預(yù)后的臨床價(jià)值

趙 穎,馬彤輝,郝淑娟

(1.河北省保定市第二中心醫(yī)院新生兒科,河北 保定 072750;2.河北省保定市第二中心醫(yī)院兒科,河北 保定 072750)

新生兒缺血缺氧性腦病圍產(chǎn)期缺氧窒息導(dǎo)致的腦缺氧缺血損害,導(dǎo)致新生兒智力障礙、腦癱等,可引起一系列腦病,隨著疾病進(jìn)展可導(dǎo)致新生兒死亡[1-2]。因此,及時(shí)發(fā)現(xiàn)并評(píng)估新生兒缺血缺氧性腦病嚴(yán)重程度對(duì)改善患兒預(yù)后具有重要意義。但目前可有效評(píng)估新生兒缺血缺氧性腦病嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)較少,尋找可及時(shí)、準(zhǔn)確評(píng)估新生兒缺血缺氧性腦病嚴(yán)重程度及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)是臨床研究重點(diǎn)[3-4]。微小核糖核酸(mircoRNA,miRNA)是一類非編碼小RNA分析,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、信號(hào)通路調(diào)節(jié)等過(guò)程中起到重要作用,在心腦血管疾病診治中具有重要意義。血清微小RNA-210(mircoRNA-210,miRNA-210)在大腦缺氧缺血性腦水腫中的作用已有報(bào)道,微小RNA-223(mircoRNA-223,miRNA-210)水平在心肌損傷相關(guān)疾病的作用已被證實(shí),但目前關(guān)于miRNA-210、miRNA-223與新生兒缺血缺氧性腦病病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系的尚無(wú)報(bào)道[5-6]?；诖?本研究通過(guò)檢測(cè)不同疾病嚴(yán)重程度及不同預(yù)后患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)情況,了解其表達(dá)變化與患兒病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系,旨在為新生兒缺血缺氧性腦病預(yù)后評(píng)估及臨床治療提供依據(jù)。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2019年8月—2021年8月本院新生兒缺血缺氧性腦病患兒124例作為觀察組進(jìn)行回顧性分析,依據(jù)患兒病情嚴(yán)重程度將患兒分為輕度組51例、中度組40例、重度組33例,并選取同期60例健康新生兒作為對(duì)照組。隨訪兒出生后28 d內(nèi)預(yù)后情況將患兒分為生存組81例與死亡組43例。

納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《新生兒缺氧缺血性腦病的診斷和治療》[7]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),出生24 h內(nèi)經(jīng)MRI確認(rèn)存在腦損傷;②入院時(shí)間超過(guò)1周;③入院時(shí)采用新生兒阿氏評(píng)分[8](Apgar scores,Apgar)進(jìn)行評(píng)估,出生5 min時(shí)Apgar評(píng)分不超過(guò)7分;④患兒家屬知曉并同意研究?jī)?nèi)容,并簽署相關(guān)協(xié)議。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他先天性疾病;②合并呼吸系統(tǒng)或感染性疾病;③腦膜炎或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形患兒;④非生產(chǎn)或窒息導(dǎo)致的頭顱血腫。

本研究符合赫爾辛基宣言中關(guān)于醫(yī)學(xué)倫理的相關(guān)建議,并獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-KYLN-023)。

1.2方法

1.2.1病情嚴(yán)重程度 依據(jù)《新生兒缺氧缺血性腦病的MRI診斷》[9]中患兒病情嚴(yán)重程度判定標(biāo)準(zhǔn):病灶范圍僅限于大腦半球1～5個(gè)腦葉為輕度;病灶累及3～5個(gè)腦葉,或雖未累及3個(gè)以上腦葉,但伴有腦出血或重要功能區(qū)受累為中度;病灶累及6～7個(gè)腦葉,或雖未累6個(gè)以上腦葉,但伴2個(gè)以上腦出血或重要功能區(qū)灰質(zhì)受累為重度。

1.2.2血清指標(biāo)檢測(cè) 采集入組新生兒出生24 h內(nèi)空腹靜脈血,以3 000 r/min,離心10 min,取上層血清,置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。使用QuantoBioRNA提取總RNA,使用RTaseM-LAV逆轉(zhuǎn)為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)血清miRNA-210、miRNA-223水平。miRNA-210上游引物5′-ATGGTTCGTGGGAGCCCCTGCCC-ACCGCA-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCC-GAGGT-3′。miRNA-223正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3′,反向引物:5′-TGGTGTCGTGGATTCG-3′。反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 10 s,59 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參,上游引物:5′-CATCCGATAAAATTGGAACGA-3′,下游引物:5′-TTTGTGCGTGTCATCCTTGCG-3′,采用2-△△Ct計(jì)算miRNA-210、miRNA-223相對(duì)表達(dá)量。使用美國(guó)BEP2000型全自動(dòng)酶標(biāo)儀,使用中國(guó)深圳依諾金生物科技有限公司試劑盒,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素6水平。

1.3觀察指標(biāo) ①搜集所有入組新生兒分娩孕周、性別、出生時(shí)體重、平均日齡等臨床資料及血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)量并進(jìn)行分析比較;②檢測(cè)不同病情嚴(yán)重程度患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá),分析其表達(dá)與與患兒病情嚴(yán)重程度的關(guān)系;③根據(jù)患兒出生后28 d內(nèi)預(yù)后情況將患兒分為存活組和死亡組,搜集患兒孕周、分娩方式、性別、出生時(shí)體重、日齡、體溫、心率、Apgar評(píng)分、孕母親貧血、孕母親合并糖尿病、孕母親合并高血壓、臍帶異常、孕母親分娩時(shí)使用催產(chǎn)素、開始治療日齡、病情嚴(yán)重程度、白細(xì)胞介素6、C反應(yīng)蛋白、miRNA-210表達(dá)量、miRNA-223表達(dá)量等資料并進(jìn)行分析比較,找出影響患兒預(yù)后的相關(guān)因素,然后進(jìn)一步進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,篩選出影響患兒預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。④根據(jù)血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)繪制ROC曲線,以曲線下面積評(píng)估其對(duì)新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值,曲線下面積越大,預(yù)測(cè)價(jià)值越高。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);多因素分析采用Logistic回歸分析,以ROC曲線下面積評(píng)估其對(duì)患兒預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組臨床資料及血清miRNA-210、miRNA-223水平比較 觀察組患兒與健康對(duì)照組新生兒分娩孕周、性別、出生時(shí)體重、平均日齡等臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而觀察組患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)量均高于健康對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 2組研究對(duì)象臨床資料及血清miRNA-210、miRNA-223水平比較Table 1 Comparison of clinical data and serum miRNA-210 and miRNA-223 levels between two groups

2.2不同病情程度患兒血清miRNA-210、miRNA-223水平比較 重度組患兒血清miRNA-210、miRNA-223水平高于輕度組和中度組患兒,且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 不同病情程度患兒血清miRNA-210、miRNA-223水平比較Table 2 Comparison of serum miRNA-210 and miRNA-223 levels in children with different disease severity

2.3不同預(yù)后患兒臨床資料比較 單因素分析結(jié)果顯示,開始治療日齡、Apgar評(píng)分、缺血缺氧性腦病病情嚴(yán)重程度、白細(xì)胞介素6、C反應(yīng)蛋白、血清miRNA-210表達(dá)量、血清miRNA-223表達(dá)量與新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后有關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后患兒臨床資料比較Table 3 Comparison of clinical data of children with different prognosis

2.4影響新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 多因素分析結(jié)果顯示,開始治療日齡高于2.25 d(OR=3.554,95%CI:1.300～9.713)、病情嚴(yán)重程度未重度(OR=4.450,95%CI:2.189～9.048)、血清miRNA-210升高(OR=3.117,95%CI:1.598～6.082)、血清miRNA-223升高(OR=3.384,95%CI:1.790～6.398)是影響新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 影響新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of factors affecting the prognosis of newborns with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy

2.5血清miRNA-210、miRNA-223對(duì)新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 血清miRNA-210最佳分界值為1.71時(shí),預(yù)測(cè)新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的曲線下面積為0.76,此時(shí)敏感度為78.62%,特異度為76.35%;miRNA-223最佳分界值為1.48時(shí),預(yù)測(cè)新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的曲線下面積為0.79,此時(shí)敏感度為81.54%,特異度為76.18%;二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的曲線下面積為0.85,此時(shí)敏感度為86.73%,特異度為75.49%,見(jiàn)圖1。

圖1 血清miRNA-210、miRNA-223預(yù)測(cè)新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

新生兒缺血缺氧性腦病是缺血、缺氧引起腦水腫、腦壞死,進(jìn)而導(dǎo)致的腦組織病理改變,腦微血管缺氧及血流減少,引起腦缺血,血管通透性增高,進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫和神經(jīng)元壞死,加劇腦缺血,形成惡性循環(huán)[10-11]。血清miRNA-210表達(dá)上調(diào)可通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成,參與腦組織缺氧、缺血及神經(jīng)元損傷過(guò)程,血清miRNA-223表達(dá)上調(diào)可通過(guò)調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng),加劇腦水腫,進(jìn)而參與新生兒缺血缺氧性腦病疾病進(jìn)展過(guò)程,對(duì)患兒病情及預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示,觀察組患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)水平較高,且其水平隨患兒病情嚴(yán)重程度的增加而升高,其水平異常升高對(duì)評(píng)估,新生兒缺血缺氧性腦病病情嚴(yán)重程度具有重要指導(dǎo)意義。這主要是因?yàn)閙iRNA-210在調(diào)控血管生成、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用,已被廣泛應(yīng)用于多種神經(jīng)疾病、腦卒中、心力衰竭等疾病診斷中[12-13]。miRNA-210表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、原肌球蛋白相關(guān)激酶異構(gòu)體B表達(dá)降低,進(jìn)而導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧[14-15]。并通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、分化及毛細(xì)血管網(wǎng)形成,誘導(dǎo)血管再生,導(dǎo)致腦組織缺血缺氧、神經(jīng)元損傷,進(jìn)而參與新生兒缺血缺氧性腦病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,提示miRNA-210可作為評(píng)估病情嚴(yán)重程度的重要生物標(biāo)志物之一[16-17]。miRNA-223表達(dá)上調(diào),可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞發(fā)育、活化,影響機(jī)體炎癥反應(yīng),進(jìn)而參與缺血、缺氧引起的腦組織水腫過(guò)程,并通過(guò)刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖,引起腦組織微血管損傷,加劇腦組織缺血、缺氧,導(dǎo)致腦損傷[18-19]。因此,miRNA-223可通過(guò)了解腦組織水腫程度,評(píng)估患兒腦損傷程度。因此,可通過(guò)靶向調(diào)控miRNA-210、miRNA-223表達(dá),改善腦組織缺血缺氧情況,進(jìn)而緩解病情,推測(cè)miRNA-210、miRNA-223可作為治療新生兒缺血缺氧性腦病的潛在靶點(diǎn)。

并且,比較不同預(yù)后患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),死亡組患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)高于存活組,且Logistic回歸分析結(jié)果顯示,血清miRNA-210、miRNA-223是影響新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。說(shuō)明血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)與新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后密切相關(guān),其表達(dá)上調(diào)對(duì)于預(yù)測(cè)患兒不良預(yù)后具有重要提示作用。這主要是因?yàn)檠錷iRNA-210表達(dá)水平變化可評(píng)估患兒腦組織損傷程度,進(jìn)而幫助評(píng)估新生兒缺血缺氧性腦病患兒病情嚴(yán)重程度,其表達(dá)上調(diào),患兒腦損傷越嚴(yán)重,預(yù)后越差[20-21]。血清miRNA-223表達(dá)水平變化可評(píng)估腦水腫程度,進(jìn)而有助于新生兒缺血缺氧性腦病患兒病情評(píng)估,其表達(dá)上調(diào),腦組織水腫程度越嚴(yán)重,腦損傷越嚴(yán)重,進(jìn)而導(dǎo)致預(yù)后不良。血清miRNA-210、miRNA-223表達(dá)與患兒病情變化程度及損傷程度保持一致,提示其對(duì)評(píng)估新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義[22-23]。ROC曲線證實(shí),血清miRNA-210最佳分界值為1.71時(shí)、miRNA-223最佳分界值為1.48時(shí)對(duì)預(yù)測(cè)新生兒缺血缺氧性腦病患兒預(yù)后具有較好預(yù)測(cè)價(jià)值,且聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)價(jià)值更高。這可能是因?yàn)槁?lián)合檢測(cè)通過(guò)優(yōu)勢(shì)補(bǔ)互補(bǔ)可更全面評(píng)估患兒腦損傷程度,進(jìn)而幫助病情及預(yù)后評(píng)估[24]。但由于本研究樣本有限,且miRNAs是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,還需擴(kuò)大樣本,證實(shí)其可行性,進(jìn)而為臨床治療及干預(yù)提供可靠依據(jù)。

綜上所述,新生兒缺血缺氧性腦病患兒血清miRNA-210、miRNA-223上調(diào),其表達(dá)上調(diào)是影響患兒預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,對(duì)新生兒缺血缺氧性腦病患兒病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估具有重要參考意義。