半夏根尖染色體壓片技術(shù)研究

賈襲偉　贠小杰　久西加　徐寵然　劉源　毛潔　劉東　杜弢

摘要：半夏根尖染色體壓片效果受多重因素制約，為方便半夏染色體倍性鑒別、染色體計(jì)數(shù)，探索適用于半夏的根尖壓片技術(shù)選取半夏根尖為材料，采用植物染色體常規(guī)壓片法，對(duì)預(yù)處理液、預(yù)處理時(shí)間、固定時(shí)間、染色液以及染色時(shí)間5個(gè)主要參數(shù)進(jìn)行一系列的篩選優(yōu)化。結(jié)果表明，在半夏根尖壓片過程中，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液預(yù)處理3 h，卡諾氏固定液固定20.0 h，60 ℃水浴，1 mol/L鹽酸酸解10 min，45%醋酸軟化20 min，最后用改良石炭酸復(fù)紅染液染色20 min，壓片效果顯著，染色體清晰可辨，可用于半夏染色體觀察研究。

關(guān)鍵詞：半夏；根尖；壓片技術(shù)；染色方法

中圖分類號(hào)：S567? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2097-2172（2023）01-0094-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.01.021

Research on Chromosome Slicing Technology of Pinellia ternate

Root Tip Tissue

JIA Xiwei 1， YUN Xiaojie 1， JIU Xijia 1， XU Chongran 1， LIU Yuan 1， MAO Jie 1， LIU Dong 1， DU Tao 1， 2

（1. School of Pharmacy， Gansu University of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou Gansu 730000， China; 2. Northwest Collaborative Innovation Center for Traditional Chinese Medicine， Lanzhou Gansu 730000， China）

Abstract： The effect of Pinellia root tip chromosome compression is restricted by multiple factors. In order to facilitate the identification of Pinellia chromosomal ploidy and chromosome counting， a root tip compression technology suitable for Pinellia ternate was explored. In this experiment， the root tips of Pinellia ternate were selected as the material， and the routine pressing method of plant chromosomes was used. A set of technical methods for Pinellia root apex compression was developed. The experimental results showed that： in the process of root tip compression of Pinellia ternate， when pretreated with 0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline solution for 3 h， fixed with Carnot's fixative for 20.0 h， water bath at 60 ℃， and acid hydrolyzed in 1 mol/L HCl for 10 min， softened in 45% acetic acid for 20 min， and finally stained with modified carbolic acid fuchsin for 20 min， the tableting effect was remarkable， and the chromosomes were clearly distinguishable， which can be applied to the observation and research of Pinellia ternate.

Key words： Pinellia ternate; Root tip; Tableting technique; Dyeing method

半夏來源于天南星科植物半夏［Pinellia ternata（Thunb.） Breit.］的干燥塊莖，夏、秋兩季采挖，洗凈，除去外皮曬干。半夏始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《禮記·月令》記載“五月半夏生，蓋當(dāng)夏之半也，故名，又名守田、水玉，守田會(huì)意，水玉因形”［1 ］。其味辛，性溫；有毒，歸脾、胃、肺經(jīng)。具燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)功效［2 ］，臨床常用以治療咳喘痰多、嘔吐反胃、胸脘痞悶、瘰疬痰核 等［3 ］。研究發(fā)現(xiàn)，半夏的不同居群、不同生態(tài)型之間染色體倍性混雜、數(shù)目多樣［4 ］，生產(chǎn)中，常因種源混亂影響半夏藥材產(chǎn)量［5 ］。目前對(duì)于半夏的研究，主要集中在藥理活性、化學(xué)成分鑒定及提取等方面，在染色體倍性以及形態(tài)等細(xì)胞遺傳學(xué)方面鮮有報(bào)道。

染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體，是細(xì)胞核中載有遺傳信息（基因）的物質(zhì)，為細(xì)胞在有絲分裂或者減數(shù)分裂時(shí)DNA特定的存在形式。染色體的數(shù)目、形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致遺傳信息發(fā)生改變，從而造成生物個(gè)體差異［6 - 7 ］。因此，探索并掌握染色體壓片技術(shù)方法，方便觀察、統(tǒng)計(jì)染色體的形態(tài)及數(shù)目，可有效解決細(xì)胞學(xué)研究和育種工作中染色體倍性鑒定、育種材料選擇以及親緣關(guān)系確定等技術(shù)難題。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

供試半夏是經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定，為天南星科植物半夏［Pinellia ternata （Thunb.） Breit. ］的干燥塊莖，采自清水縣白沙鎮(zhèn)。

供試試劑有卡諾氏固定液（北京索萊寶科技有限公司）、過氧化氫（天津市大茂化學(xué)試劑有限公司）、1，4 二氯苯（北京沃凱生物科技有限公司）、1-溴化萘及8-羥基喹啉（薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）、考馬斯亮藍(lán)G250（天津市大茂化學(xué)試劑有限公司）、改良石炭酸復(fù)紅染液（北京索萊寶科技有限公司）、1 mol/L鹽酸、45%醋酸。

供試儀器設(shè)備有CX23正置顯微鏡（甘肅嘉瑞貿(mào)易有限公司）、載玻片、蓋玻片、試管、剪刀、鑷子、顯微鏡、擦鏡紙、香柏油、膠頭滴管。

1.2? ?方法

根尖染色體壓片的操作流程：取材→預(yù)處理→固定→酸解→軟化→染色→壓片→鏡檢、拍照［8 - 11 ］。

1.2.1? ? 取材? ? 將半夏種莖用毛刷于自來水中刷洗干凈，用1 g/kg的過氧化氫溶液浸泡20 min，再用無菌水沖洗5～6次，平鋪在放有5～6層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中（每皿5～6個(gè)），置于28 ℃培養(yǎng)箱中，每天定時(shí)補(bǔ)充水分以保持濾紙濕潤(rùn)，3 d后有大量的新生根著生于半夏種莖芽點(diǎn)周圍。切取長(zhǎng)2 cm的根尖（呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，表面類白色，平滑，形態(tài)學(xué)上端類圓形），用蒸餾水沖洗干凈后備用。

1.2.2? ? 預(yù)處理? ? 采用3種不同的預(yù)處理液，為對(duì)二氯苯飽和水溶液、α-溴萘和對(duì)二氯苯飽和水溶液的混合液、0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液。預(yù)處理時(shí)間設(shè)置為1.0、1.5 、2.0、2.5、3.0、3.5 h共6個(gè)梯度。將切取的半夏根尖置于含有不同預(yù)處理液的試管中進(jìn)行預(yù)處理。在每個(gè)預(yù)處理時(shí)間下分別壓片10張，觀察統(tǒng)計(jì)10張壓片中清晰可見的染色體總數(shù)目，比較半夏根尖染色體壓片的效果，從而選出最佳的預(yù)處理液。

1.2.3? ? 固定? ? 采用卡諾氏固定液在4 ℃的條件下固定。固定時(shí)間分別設(shè)置為14、16、18、20、22、24 h，共 6個(gè)梯度。將預(yù)處理結(jié)束的半夏根尖從試管中用鑷子夾出，用蒸餾水反復(fù)沖洗5～6次，置于含有卡諾氏固定液的試管中，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)梯度進(jìn)行固定。

1.2.4? ? 酸解? ? 將固定好的半夏根尖用蒸餾水反復(fù)沖洗5～6次，置于加有1 mol/L鹽酸的試管中，在60 ℃的水浴鍋中酸解10 min。

1.2.5? ? 軟化? ? 將酸解好的半夏根尖置于45%的醋酸中軟化20 min。

1.2.6? ? 染色? ? 采用改良石炭酸復(fù)紅染液、考馬斯亮藍(lán)G250染色液（配制方法：稱取考馬斯亮藍(lán)G250固體粉末10 mg，加入5 mL 90%乙醇進(jìn)行溶解，然后加入5 mL 85%磷酸，最后加水定容到100 mL，振搖，4 ℃?zhèn)溆茫?。兩種染色液進(jìn)行染色，染色時(shí)間均設(shè)置為5、10、15、20、25、30 min。比較染色結(jié)果的清晰程度，從而選出最佳染色液。

1.2.7? ? 壓片? ? 采用植物染色體常規(guī)壓片法。用刀片切取染色完成的半夏根尖分生區(qū)組織，放置在干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，用帶有橡皮的鉛筆均勻敲擊蓋玻片表面［12 ］，使其組織均勻分散在蓋玻片之間［13 ］，最終呈現(xiàn)出一層淡淡的薄霧狀，用濾紙擦去從邊緣滲透出來的染色液。

1.2.8? ? 鏡檢及拍照? ? 采用正置顯微鏡進(jìn)行鏡檢，用JD capture軟件對(duì)染色體進(jìn)行拍照記錄。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?預(yù)處理液篩選

預(yù)處理的目的是抑制紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂過程中的染色體縮短和比較分散，盡可能地使其分裂期停止于中期階段，從而便于觀察。3種預(yù)處理液對(duì)半夏根尖進(jìn)行預(yù)處理的效果（表1）為0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液 > α-溴萘和對(duì)二氯苯飽和水溶液的混合液 > 對(duì)二氯苯飽和水溶液。在顯微鏡下觀察表明，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液處理的半夏根尖效果最好，視野中染色體形態(tài)、縊痕以及隨體清晰可見，染色體數(shù)目精確，便于計(jì)數(shù)分析；α-溴萘和對(duì)二氯苯飽和水溶液的混合液處理的半夏根尖部分染色體縮短變粗不明顯，呈線型的染色體纏繞在一起，不利于數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析；對(duì)二氯苯飽和水溶液處理的半夏根尖效果不佳，染色體同樣變粗不明顯，出現(xiàn)粘連現(xiàn)象。

2.2? ?預(yù)處理時(shí)間

預(yù)處理時(shí)間是預(yù)處理液發(fā)揮最佳效果的重要因素。由圖1可知，以0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液為預(yù)處理液時(shí)處理效果最佳。由表2可知，在0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液預(yù)處理液中，預(yù)處理1.0 ～1.5 h時(shí)，鏡檢發(fā)現(xiàn)染色體形態(tài)較清晰；2.0 ～ 3.0 h時(shí)，染色體形態(tài)清晰； 3.5 h時(shí)，則染色體較模糊不清楚。對(duì)鏡檢觀察到的清晰染色體個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理3.0 h時(shí)最多。因此，半夏根尖的最佳預(yù)處理時(shí)間為3.0 h。

2.3? ?固定時(shí)間

在用3種預(yù)處理液預(yù)處理的前提下，不同固定時(shí)間的固定效果見表3。從表3可知，以0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液為預(yù)處理液時(shí)，在預(yù)處理的前提下固定14 ～18 h，鏡檢發(fā)現(xiàn)染色體是一個(gè)漸變清晰的過程（從模糊到比較模糊再到比較清晰），不便于染色體形態(tài)的觀察以及計(jì)數(shù)；固定20 ～22 h，鏡檢時(shí)染色體清晰，利于觀察以及計(jì)數(shù)（圖2A、2B）；固定24 h，鏡檢時(shí)染色體變得比較模糊（圖2C、2D）。為了提高試驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性，半夏根尖的最佳固定時(shí)間為20 h。

2.4? ?染色液篩選

考馬斯亮藍(lán)G250染色液染出的半夏根尖效果不佳，鏡檢呈現(xiàn)區(qū)域白色或者藍(lán)色，看不到細(xì)胞核內(nèi)的染色體形態(tài)（圖3A、3B）；改良石炭酸復(fù)紅染液染出的半夏根尖效果最佳，鏡檢時(shí)染色形態(tài)數(shù)目清晰可辨（圖4A、4B、4C、4D、4E、4F）。因此，改良石炭酸復(fù)紅染液為半夏根尖染色的最佳染色液。

2.5? ?染色時(shí)間

從表4可知，考馬斯亮藍(lán)G250的染色效果隨著染色時(shí)間延長(zhǎng)，染色加深，但不論時(shí)間長(zhǎng)短都不能清楚地看到細(xì)胞核內(nèi)染色體形態(tài)。改良石炭酸復(fù)紅染液染色時(shí)，隨著染色時(shí)間的延長(zhǎng)，染色同樣加深。染色5～15 min，染色較淺，不利于觀察；染色20 min，染色明顯，能清楚觀察到染色體的形態(tài)以及數(shù)目；染色25 min，染色體顏色較深，稍有模糊；染色30 min，染色體顏色過深，呈現(xiàn)區(qū)域紫色，染色體同時(shí)變得模糊，不利于染色體觀察以及計(jì)數(shù)。為了提高試驗(yàn)的可靠準(zhǔn)確性，20 min為半夏根尖的最佳染色時(shí)間。

3? ?討論與結(jié)論

影響植物根尖壓片效果優(yōu)劣的因素很多，比如選取壓片材料的生理狀況、取樣的時(shí)間、預(yù)處液的種類及濃度、預(yù)處理時(shí)間及溫度，固定液的種類、時(shí)間、溫度，解離的時(shí)間、溫度、染色液的種類、染色時(shí)間、溫度等條件［14 - 15 ］。其中每個(gè)操作步驟都非常重要，直接影響下一步的操作結(jié)果［16 - 17 ］。一般來說，植物細(xì)胞的分裂周期由一系列基因、酶和蛋白質(zhì)精確調(diào)節(jié)，細(xì)胞分裂取決于DNA、RNA和蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分的定量合成，任何影響這些物質(zhì)合成的因素都會(huì)影響細(xì)胞分裂，如溫度、營(yíng)養(yǎng)、蛋白質(zhì)抑制劑或核酸合成的抑制劑、植物激素等都會(huì)影響細(xì)胞分裂。因此，在半夏根尖的壓片中，筆者發(fā)現(xiàn)部分壓片透過燈光照射，呈現(xiàn)出絲狀，并不是淡淡的薄霧狀。對(duì)呈現(xiàn)絲狀的壓片鏡檢發(fā)現(xiàn)，染色體模糊，難以找到清晰的染色體，可觀察區(qū)域不連續(xù)，存在斷層現(xiàn)象，即使用帶橡皮的鉛筆用力敲擊，也不能使其呈現(xiàn)出淡淡的薄霧狀，從而影響鏡檢效果。對(duì)呈現(xiàn)淡淡薄霧狀的壓片鏡檢發(fā)現(xiàn)，染色體分布均勻，形態(tài)清晰，便于觀察以及計(jì)數(shù)。尋找其原因發(fā)現(xiàn)，雖然根尖由同一時(shí)間在同一半夏種莖上切取，但部分根尖粗壯，部分根尖細(xì)小，在解離以及軟化相同時(shí)間的情況下，對(duì)于稍微細(xì)小的半夏根尖足以將其軟化，但對(duì)于粗壯的根尖并不足以使其軟化。因此，對(duì)于材料的選擇至關(guān)重要，選擇形態(tài)大小相同的材料對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功事半功倍。

通過觀察大量壓片發(fā)現(xiàn)，半夏根尖染色體壓片，其中有一部分染色體呈彎曲的線狀，扭曲纏繞在一起，同時(shí)細(xì)胞間的染色體重重疊疊，交叉纏繞在一起，非常不利于觀察以及計(jì)數(shù)。究其原因，很大可能是在壓片過程中用帶橡皮的鉛筆敲擊力度不夠，沒有使染色體充分分散開來；也有可能是在觀察過程中載玻片與蓋玻片錯(cuò)位，導(dǎo)致此現(xiàn)象的出現(xiàn)。所以，在壓片以及觀察的過程要避免人為誤差。在觀察尋找典型分裂相細(xì)胞染色體時(shí)，有些壓片找不到典型分裂相細(xì)胞的染色體，有些壓片只能清楚地觀察到幾個(gè)典型分裂相細(xì)胞的染色體，而有些壓片則能觀察到許多典型分裂相細(xì)胞的染色體。這可能與取材時(shí)間和取材部位有關(guān)。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，8：00 — 10：00時(shí)取材［12 - 13 ］，就有極大可能獲得處于細(xì)胞分裂各個(gè)時(shí)期的材料［18 ］。于是，我們分別在8：00 — 10：00時(shí)以及14：00 — 16：00時(shí)切取同一培養(yǎng)皿培養(yǎng)的半夏根尖部位，使用本試驗(yàn)探索出的最佳條件進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8：00 — 10：00時(shí)取材的半夏根尖和14：00 — 16：00時(shí)取材的半夏根尖鏡檢并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異，并沒有發(fā)現(xiàn)8：00 — 10：00時(shí)取材的半夏根尖比14：00 — 16：00時(shí)取材的半夏根尖有更多的典型分裂相細(xì)胞的染色體?？赡鼙驹囼?yàn)用的半夏根尖培養(yǎng)在保溫箱里進(jìn)行，溫度以及濕度變化不顯著，從而影響了半夏有絲分裂的進(jìn)程，這與李淑潔［19 ］關(guān)于大麥根尖染色體研究發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象具有相似性；試驗(yàn)樣本過少，缺乏有效性，精度不夠，有存在偶然誤差的可能，不具代表性。由于半夏的染色體相對(duì)比較小，通過顯微鏡觀察時(shí)具有很大的挑戰(zhàn)性。本試驗(yàn)選擇改良石炭酸復(fù)紅染液，染色時(shí)間相對(duì)較短，鏡檢效果明顯，易于觀察，此方法方便簡(jiǎn)單快捷。

染色體的倍性鑒定是倍性育種及其應(yīng)用中不可缺少的工作。利用最方便、最快捷的方法盡早確定出植物的倍性水平，就能極大地減少工作量、避免盲目性、降低成本，加快育種工作的進(jìn)程［20 ］。我們采用最方便快捷的壓片方法，通過對(duì)根尖染色體制片的5個(gè)主要參數(shù)預(yù)處理液、預(yù)處理時(shí)間、固定時(shí)間、染色液以及染色時(shí)間進(jìn)行一系列合理的篩選優(yōu)化，探索出的適合半夏根尖的染色方法為半夏根尖用0.002 mol/L 8-羥基喹啉預(yù)處理3.0 h、卡諾氏液固定20 h，在60 ℃水浴，1 mol/L鹽酸中酸解10 min，45%的醋酸中軟化20 min，用改良石炭酸復(fù)紅染液染色20 min，壓片效果最佳。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 王依明，王秋紅.? 半夏的化學(xué)成分、藥理作用及毒性研究進(jìn)展［J］.? 中國(guó)藥房，2020，31（21）：2676-2682.

［2］ 文建水.? 采收期對(duì)天水小拱棚半夏產(chǎn)量的影響［J］.? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2020（4）：14-16.

［3］ 左? ?軍，牟景光，胡曉陽.? 半夏化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理作用研究進(jìn)展［J］.? 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，21（9）：26-29.

［4］ 成? ?彬，馬小軍，陳? ?力，等.? 半夏多倍體復(fù)合體及其細(xì)胞地理學(xué)研究［J］.? 中國(guó)中藥雜志，2006（17）：1405-1408.

［5］ 魯? ?斌，王永峰.? 16份半夏地方品種在清水縣引種初報(bào)［J］.? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（1）：52-55.

［6］ 顧衛(wèi)紅.? 西瓜染色體的細(xì)胞學(xué)觀念初報(bào)［J］.? 北方園藝，1995（5）：9-12.

［7］ 徐道娜，薛志強(qiáng)，李世棟，等.? 西瓜染色體壓片技術(shù)改進(jìn)研究［J］.? 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007（6）：301- 304.

［8］ 王玉祥，陳述明，張? ?博.? 苜蓿根尖制片技術(shù)研究［J］.? 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（9）：163-166.

［9］ 劉? ?瑩，趙翠榮，王立峰，等.? 小麥根尖染色體制片及植株倍性鑒定［J］.? 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（25）： 12349-12350.

［10］ 梁? ?韶，雷秀娟，宋? ?娟，等.? 人參不同材料染色體制片技術(shù)優(yōu)化［J］.? 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，40（5）：583-588；530.

［11］ 張?zhí)煜?，林宗鏗，蔡坤秀，等.? 金線蓮根尖染色體制片技術(shù)研究［J］.? 福建熱作科技，2011，36（1）：12-14.

［12］ 王? ?彬.? 中國(guó)沙棘染色體的染色和制片技術(shù)［J］.? 青海農(nóng)林科技，2010（3）：8-10.

［13］ 馮? ?斗，王建嶺，席世麗，等.? 木薯根尖染色體的觀察技術(shù)［J］.? 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（9）：3711-3712.

［14］ 王明艷，韓秀玲，吳? ?鵬，等.? 藥用植物刺五加根尖壓片技術(shù)研究［J］.? 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（3）：1149-1150.

［15］ 齊迎春，周光來，高? ?揚(yáng).? 孔雀草的根尖壓片技術(shù)及染色體形態(tài)分析研究［J］.? 湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008（3）：261-265.

［16］ 陳瑞嬌，白? ?肋.? 朱頂紅染色體核型分析［J］.? 北方園藝，2013（8）：110-111.

［17］ 謝珍玉，鄭成木.? 中國(guó)海南島13種菊科植物的細(xì)胞學(xué)研究［J］.? 植物分類學(xué)報(bào)，2003（6）：545-552.

［17］ 韓毅科，杜勝利，王? ?鳴.? 黃瓜染色體制片及倍性研究［J］.? 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2003（1）：72-74.

［19］ 李淑潔.? 一種改進(jìn)的大麥根尖染色體壓片法及其應(yīng)用［J］.? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2020（5）：32-35.

［20］ 楊懋勛，黃永芳.? 植物細(xì)胞工程技術(shù)在盾葉薯蕷研究中的應(yīng)用［J］.? 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（7）：15-18.

收稿日期：2022 - 07 - 26；修訂日期：2022 - 10 - 25

基金項(xiàng)目：國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-21）；2021年甘肅省第五批重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（21YF5NA130）。

作者簡(jiǎn)介：賈襲偉（1993 — ），男，甘肅環(huán)縣人，博士在讀，主要從事藥用植物資源保護(hù)與利用研究工作。Email： 1959322720@ qq.com。

通信作者：杜? ?弢（1967 — ），男，陜西鳳翔人，教授，碩士，主要從事藥用植物栽培及育種的教學(xué)和研究工作。Email： gslzdt@163.com。