甲型流感病毒感染所致AECOPD與氧化應(yīng)激的關(guān)系

盧文宣,韓偉,唐華平

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院東院呼吸科,山東青島 266071)

甲型流感病毒感染所致AECOPD與氧化應(yīng)激的關(guān)系

盧文宣,韓偉,唐華平

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院東院呼吸科,山東青島 266071)

目的探討甲型流感病毒感染所致慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)與氧化應(yīng)激關(guān)系。方法選取152例AECOPD病人,采用RT-PCR方法檢測病人痰液中甲型流感病毒RNA,甲型流感病毒陽性病人23例(A組),陰性者129例(B組)。比較兩組病人痰液中8-異前列腺素(8-isoprostane)、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)水平。結(jié)果A組病人痰標(biāo)本中8-isoprostane水平高于B組,SOD、GSH水平低于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝16.75～24.33,P＜0.01)。結(jié)論甲型流感病毒感染所致AECOPD與人體的氧化應(yīng)激狀態(tài)有較強(qiáng)的相關(guān)性,這對于指導(dǎo)臨床治療有重要的參考價值。

肺疾病,慢性阻塞性;流感病毒A型;氧化性應(yīng)激

病毒性上呼吸道感染與慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)有關(guān)。采用PCR技術(shù),40%～60%的AECOPD病人的呼吸道分泌物可檢出呼吸道病毒,其中最常見的病毒有鼻病毒、流感病毒、副流感病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及人偏肺病毒等[1]。近期甲型流感的流行造成許多慢性呼吸系統(tǒng)疾病,尤其是慢性阻塞性肺疾病病人病情惡化、甚至死亡。呼吸道病毒在AECOPD中的作用再次受到各國學(xué)者的關(guān)注。由于經(jīng)常變異,目前缺少針對呼吸道病毒感染的有效藥物,致使一些病人因?yàn)閲?yán)重的呼吸道病毒感染引起病情惡化。近年來研究發(fā)現(xiàn),病毒感染導(dǎo)致的病情加重與機(jī)體廣泛的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),但有關(guān)呼吸道病毒的氧化應(yīng)激損害研究較少,主要集中在呼吸道合胞病毒,未見有關(guān)流感病毒氧化應(yīng)激的報道[2]。本文旨在探討甲型流感病毒感染所致AECOPD與機(jī)體氧化應(yīng)激的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象

2011年11月1日—2012年6月1日,選取入住我科的AECOPD病人152例,男90例,女62例;年齡52～86歲,平均(73.90±9.83)歲;病程3～40年。AECOPD診斷參照《慢性阻塞性肺疾病防治全球倡議》的標(biāo)準(zhǔn),并符合下列條件:①入院前未接受任何抗生素治療;②無支氣管哮喘病史,吸入沙丁胺醇400μg后FEV1占預(yù)計值%的可逆性＜12%;③未合并嚴(yán)重心、肝、腎等系統(tǒng)疾病;④胸部X線片未顯示其他肺部疾病。

1.2 儀器和試劑

二流蘇糖醇溶液(DTT)、磷酸鹽緩沖液(PBS)由康思泰得化學(xué)試劑公司提供;RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)、PrimeScript Rt Master Mix Perfect Real Time、DL2000 Marker流感病毒引物均由Takara公司生產(chǎn)或合成,PCR擴(kuò)增試劑盒由上海生工生物工程有限公司生產(chǎn);低溫離心機(jī)、常溫離心機(jī)、PCR儀、凝膠圖像分析儀、電泳槽、微波爐、數(shù)顯恒溫水浴鍋、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計、酶標(biāo)儀等均由青島市市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供;超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、8-異前列腺素(8-isoprostane)檢測試劑盒由南京建成生物有限公司提供。

1.3 研究方法

1.3.1 痰液的處理 取病人入院后次日清晨深咳第一口痰為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本,取痰后立即與等體積含1 g/ L DTT的PBS平衡鹽溶液混勻,37℃水浴15 min,水浴過程中適當(dāng)震蕩混勻,之后在常溫離心機(jī)中以3 000 r/min離心10 min,取100μL上清液用于總RNA提取;另取100μL上清液用于氧化應(yīng)激因子的測定,－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 參考文獻(xiàn)[3]的方法。

1.3.3 流感病毒的普通PCR擴(kuò)增 流感病毒引物序列為Forward 5′-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3′,Reverse 5′-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3′,由Takara公司合成。反應(yīng)體系如下:10×PCR Buffer 2.5μL,d NTP Mix 2.5μL,上、下游引物各1μL,pfu DNA Polymerase 0.2μL,模板DNA 1μL,Sterilized dd H2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)參數(shù):95℃10 min,95℃15 s,55℃31 s,72℃30 s,共35個循環(huán)。每次擴(kuò)增均設(shè)立陽性對照和陰性對照。

1.3.4 8-isoprostane、SOD和GSH測定 SOD測定采用WST-1法,8-isoprostane測定采用ELISA法,GSH測定采用酶標(biāo)微板法。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 痰液中提取總RNA常規(guī)PCR擴(kuò)增

痰液中提取的總RNA電泳驗(yàn)證提取成功,見圖1。將提取出的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳,結(jié)果在108 bp處可見亮帶,與預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致。見圖2。

2.2 兩組痰液中SOD、GSH和8-isoprostane水平比較

甲型流感病毒陽性病人23例(A組),陰性者129例(B組)。A組痰液中8-isoprostane水平高于B組,SOD、GSH水平低于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝16.75～24.33,P＜0.01)。見表1。

表1 兩組痰液中GSH、SOD、8-isoprostane水平比較(±s)

與A組比較,＃t＝16.75～24.33,P＜0.01。

組別n GSH (ρ/mg·L－1)___ SOD (z/k U·L－1)___ 8-isoprostane (ρ/ng·L－1)_ A組23 255.28±46.69 52.01±7.41 158.92±23.41 B組129_350.98±43.73＃_____82.23±6.31＃______89.75±12.03＃

3 討 論

AECOPD的早期多為病毒感染,如果在病毒感染48 h之內(nèi)得不到及時有效的控制,多繼發(fā)細(xì)菌感染,但是病毒感染和普通細(xì)菌感染對AECOPD的發(fā)生、病情、預(yù)后以及治療的影響均有明顯差異。與沒有病毒參與的AECOPD相比較,伴有病毒感染的AECOPD病人的臨床癥狀評分更高,痰和血液中的炎癥因子水平更高,中位恢復(fù)時間更長,發(fā)作也更頻繁[4-5]。在發(fā)病早期及時抑制病毒的復(fù)制顯得至關(guān)重要。而目前檢測病毒抗體的實(shí)驗(yàn)易出現(xiàn)一些假陰性和假陽性,從而限制了抗病毒藥物在AECOPD中的應(yīng)用。因此,積極地尋求其他的檢測手段和治療手段成為近幾年來研究的熱點(diǎn)。

YATMAZ等[6]研究顯示,甲型流感病毒感染的小鼠肺組織中GSH、Vc和Ve濃度下降,提示體內(nèi)氧化應(yīng)激發(fā)生改變。而且抗氧化劑對流感病毒感染也有治療的作用。ODA等[7]報道,用吡喃聚合物連接SOD,可保護(hù)小鼠抵抗致死劑量甲型流感病毒的作用,治療組存活。

本課題組欲通過研究病毒引發(fā)的病理生理損害,并阻斷其中關(guān)鍵步驟來達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的。本研究結(jié)果顯示,流感病毒感染所致AECOPD病人痰液中氧化產(chǎn)物8-isoprostane水平高于流感病毒陰性組,且抗氧化產(chǎn)物SOD、GSH水平低于流感病毒陰性組,即甲型流感病毒感染病人氧化產(chǎn)物的活性較對照組高,抗氧化物的活性較對照組低,這與YATMAZ等[6]的研究結(jié)果一致。說明流感病毒感染的人體存在氧化應(yīng)激損傷,故在發(fā)病早期或流感病毒高發(fā)季節(jié)積極應(yīng)用抗氧化藥物,抑制病毒復(fù)制,理論上可以降低AECOPD的患病風(fēng)險,這有待進(jìn)一步的深入研究及臨床驗(yàn)證。

鐘南山[8]曾提出,慢性阻塞性肺疾病病死率居高不下,其中一個重要的原因就是缺乏對慢性阻塞性肺疾病早期診斷的敏感性和特異性評估指標(biāo)或標(biāo)記物。有研究表明,降鈣素原(PCT)定量監(jiān)測可作為評估AECOPD合并細(xì)菌感染的早期指標(biāo)[9]。希望本研究對AECOPD病人氧化應(yīng)激因子的監(jiān)測能引起大家的重視,為臨床醫(yī)生診斷AECOPD合并病毒感染提供一些指導(dǎo),在AECOPD早期積極進(jìn)行干預(yù),以延緩疾病進(jìn)展。郝敏等[10]已做過慢性阻塞性肺疾病大鼠模型其他氧化指標(biāo)的檢測,其參考價值也是肯定的。呼吁臨床醫(yī)師轉(zhuǎn)變對慢性阻塞性肺疾病病人的治療理念,將治療慢性阻塞性肺疾病的重點(diǎn)像治療冠心病、高血壓、糖尿病一樣放在早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)等環(huán)節(jié)。

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(本文編輯 馬偉平)

RELATIONSHIP BETWEEN ACUTE EXACERBATION OF CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE INDUCED BY IN-FLUENZA A VIRUS INFECTION AND OXIDATIVE STRESS

LU Wenxuan,HAN Wei,TANG Huaping (The Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266071,China)

ObjectiveTo study the relationship between acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)caused by influence A virus(flu-A virus)and oxidative stress.MethodsThis study consisted of 152 patients with acute exacerbation of COPD-flu-A virus positive 23 patients(group A),and negative 129 patients(group B)－the RNA of flu-A virus in sputum was detected by using RT-PCR,the levels of 8-isoprostane,SOD,and GSH in sputum were compared between the two groups.ResultsThe level of 8-isoprostane in group A was higher than group B,and that of SOD and GSH lower,the differences being significant(t＝16.75－24.33,P＜0.01).ConclusionAcute exacerbation of COPD due to flu-A virus infection is strongly correlated with oxidative stress state of the organism,which is of important reference value in guiding clinical therapy.

pulmonary disease,chronic obstructive;influenza A virus;oxidative stress

R563

A

1008-0341(2013)04-0351-03

10.11712/qlyx201304023

2013-01-16;

2013-05-10

青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃資助項(xiàng)目(10-3-3-4-3-nsh)

盧文宣(1984-),女,碩士研究生。

唐華平(1963-),男,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師。