誘導牙髓干細胞神經向分化的研究進展

陳冠宇 馮紅超

[摘要] 牙髓干細胞來源于神經嵴細胞，與其他來源的干細胞相比，具有更高的神經源性潛能。牙髓干細胞可以分化為雪旺細胞、膠質細胞以及神經元前體細胞，彌補了神經元細胞缺乏再生能力的缺陷。牙髓干細胞還可分泌神經營養(yǎng)因子，修復和保護神經。本文就目前誘導牙髓干細胞神經向分化的研究進展作一綜述。

[關鍵詞] 牙髓干細胞；神經細胞；神經誘導；誘導因子；神經向分化

[中圖分類號] R782? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.02.028

牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在2000年被Gronthos等[1]首次分離出來并進行鑒定，發(fā)現其具有多向分化的能力，其中就包括神經向分化的能力。DPSCs與其他成體干細胞不同，其來源于神經嵴，因此具有更高的神經源性潛能[2]。據文獻報道，Martens等[3]從未分化的DPSCs中，檢測出了早期神經標志物巢蛋白（Nestin）和波形蛋白，神經元標志物β和波形蛋白，神經元標志物β和p75，以及星形膠質細胞標志物S100蛋白。DPSCs來源廣泛，可從因治療需要而拔除的正畸牙或第三磨牙中獲取，由于離體牙屬于病理性醫(yī)療廢物，不會引起倫理道德上的爭議，且其免疫原性低，排異反應小，成為組織工程研究的熱點。

1? 誘導DPSCs神經向分化

DPSCs來源于神經嵴，這也使DPSCs能夠在沒有預誘導分化的情況下表達神經元標志物，如Nestin、p75等。目前優(yōu)化DPSCs神經向分化的方法可以分為兩種，第一種最常用，是將提取的DPSCs與誘導因子在一定條件下進行培養(yǎng)，繼而檢測誘導因子對DPSCs中神經因子表達的調控作用，最后得出DPSCs向神經樣細胞分化的結論。第二種則是有部分學者通過采取改變培養(yǎng)條件的方法來優(yōu)化DPSCs神經向分化。

1.1? 通過誘導因子誘導DPSCs神經向分化

獲取原代DPSCs后，在其傳代和培養(yǎng)過程中，加入神經誘導因子，以此促進DPSCs的神經向分化是一種比較常用的誘導方法，常用的神經誘導因子有堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，bDNF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等。有文獻報道，在對DPSCs經過神經誘導后，細胞向神經膠質樣細胞分化。尼爾樣-1型分子（Nel-like molecule-1，Nell-1）不僅可以促進成牙本質細胞的分化和牙本質的形成，而且其本身還可以與神經標志物共同表達[4]。研究表明，Nell-1在誘導DPSCs向神經樣細胞分化中起積極作用[5]，如大鼠的牙髓組織在經過Nell-1作用后，P物質、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）和Nestin等神經標志物的表達明顯增加；在通過對Nell-1誘導后的人DPSCs的檢測中，發(fā)現其膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、Nestin和β-tubulin等神經標志物的表達也有明顯增加。

bFGF作為常用的神經誘導因子，在誘導DPSCs神經向分化的研究中也較為多見，例如Rafiee等[6]通過利用肝素來穩(wěn)定bFGF，以此提高bFGF因子的存活率，從而更好地誘導DPSCs神經向分化；另外一項研究則是使用3D多孔殼聚糖支架為DPSCs的存活和神經分化提供了適宜的環(huán)境，并發(fā)現在將殼聚糖支架聯合bFGF應用時，可促進DPSCs的神經向分化[7]；而在Farhang等[8]的研究中，則是分別使用了bFGF和音猬因子（sonic hedgehog，SHH）兩種神經誘導因子，結果表明在懸滴法培養(yǎng)條件下使用SHH誘導培養(yǎng)后的DPSCs分化為神經元樣細胞的效率更高。鄧軒等[9]在對人乳牙牙髓干細胞的研究中，miR-20通過激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路，從而促進牙髓干細胞向神經元樣細胞分化。近期有學者成功的從人的牙髓中提取出脫細胞基質水凝膠（hydrogel derived from human dental pulp，hDDPM-G）[10]，并將DPSCs接種在hDDPM-G涂層表面上，通過含有bFGF的預誘導液對進行培養(yǎng)后，再使用神經誘導液（含羥基苯甲醚、毛喉素、β-巰基乙醇等誘導因子）進行誘導，發(fā)現hDDPM-G能夠更好地激發(fā)DPSCs的分化潛能，誘導DPSCs分化為神經樣細胞，而且這種方法減少了牙髓組織的使用量，為誘導DPSCs神經向分化提供了一個優(yōu)化方案。綜上，研究人員需要更系統(tǒng)和廣泛的研究，探索不同誘導因子對DPSCs神經向分化的誘導效率，闡明各種誘導因子對DPSCs神經向分化的的關鍵作用和相關機制，從而探究最佳的神經誘導條件。

1.2? 優(yōu)化培養(yǎng)條件促進DPSCs神經向分化

多數學者在研究DPSCs的神經向分化時，常常局限于對誘導因子的使用，但有文獻報道顯示，當使用的誘導因子不變時，比較常規(guī)培養(yǎng)基和無血清條件的培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)條件下誘導的DPSCs，發(fā)現無血清培養(yǎng)條件下DPSCs衍生的神經球中的表達比常規(guī)培養(yǎng)條件下的DPSCs中更顯著[11]。Farhang等[8]在DPSCs神經向誘導的實驗中，發(fā)現懸滴法（3D細胞培養(yǎng)法）比組織培養(yǎng)板（2D細胞培養(yǎng)法）條件下誘導的DPSCs具有更高的神經源向潛能。Luzuriaga等[12]在研究中發(fā)現，使用bDNF聯合神經營養(yǎng)因子3（neurotrophins-3，NT-3）誘導DPSCs神經向分化時，無血清培養(yǎng)基中誘導的DPSCs比在10%胎牛血清誘導的DPSCs向神經元和神經膠質細胞分化的潛力大大增加。另外，現有的研究主要是在一些特殊條件（高糖、缺氧等）下對DPSCs進行成牙本質向分化，成骨分化[等方面的誘導[13-14]，或是在特殊條件檢測DPSCs的分化潛能[15]，對DPSCs神經向分化的研究較少，Matsumura等[16]等發(fā)現缺氧條件下經過神經誘導的DPSCs更具有活力。

2? 關于DPSCs不同的神經誘導方案

在DPSCs神經向誘導的研究中，雖然已經取得了相當不錯的進展，但是仍存在很多障礙。多項研究利用神經誘導體系已經成功誘導DPSCs神經向分化[5-7，10-11，17-18]，Nestin和βstin10，11作為主要的神經元標志物，許多研究在鑒定DPSCs是否具有神經向分化能力時，都對其進行了檢測，且在誘導后兩種標志物的表達都得到了顯著提升，這使得對Nestin和βstin到了顯著提的檢測結果成為了鑒定DPSCs是否神經向分化有力證據之一。另外，Guo等[19]的研究表明通過基因敲除熱休克蛋白27，可以促使DPSCs分化為少突膠質前體細胞。Stanwick等[20]發(fā)現轉化生長因子受體2（transforming growth factor receptor 2，TGFBR2）的缺失減少了DPSCs神經軸突的生長，并推斷TGFBR2在牙齒礦化和神經支配過程中具有引導神經軸突生長的能力。階段特異性胚胎抗原4（stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4）是鑒定多能胚胎干細胞的標志物之一，有研究表明，對SSEA-4呈陽性的人類脫落乳牙牙髓干細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）在經過神經誘導后，其在形態(tài)和功能上都與神經元前體細胞類似[21]。但是在眾多的神經誘導方法中，哪種方法是最成功、最高效、最適合推廣的，目前無法得出一個準確的結論。既往研究結果表明DPSCs神經向誘導后的培養(yǎng)物中產生了表達神經元標志物的神經元樣細胞，在形態(tài)和功能上具有相似的生物學行為，但無法證實其為真正意義上的神經元細胞。

3? DPSCs參與神經修復

神經損傷是一種常見的疾病，可能是外傷、腫瘤手術、感染等因素所致。神經損傷后難以自我恢復，主要是因為神經元細胞缺乏再生能力，神經營養(yǎng)因子生成不足，細胞處于神經生長抑制因子分泌的環(huán)境。一直以來，神經損傷的修復都是醫(yī)學界關注的焦點和難點。

關于DPSCs在神經修復及神經系統(tǒng)性疾病上的應用，目前大多數的研究是在動物模型上進行，并且在脊髓損傷[22]、阿爾茨海默癥[23]、帕金森病[24]的治療上取得了一些成效，也證明了DPSCs非常有希望成為修復神經損傷以及治療神經系統(tǒng)性疾病的干細胞來源[6]。例如，Takaoka等[25]將DPSCs誘導分化為神經譜系細胞（neural lineage cells，NLCs）后，移植到免疫缺陷大鼠體內，觀察到NLCs軸突伸長，髓鞘再生，并且大鼠的肌肉萎縮得到改善。有研究表明，在腦梗小鼠模型的實驗中，與DPSCs相比，N-DPSCs的移植能夠更好的改善腦梗死后的功能恢復[16]。Wang等[18]研究發(fā)現經過神經誘導的DPSCs（neural-induced DPSCs，N-DPSCs）分泌物可以促進雪旺細胞的增殖，并證實N-DPSCs和DPSCs均能促進大鼠坐骨神經擠壓傷后運動功能的恢復。Luo等[26]的研究表明，與單獨使用DPSCs相比，DPSCs聯合bFGF在修復中樞神經損傷方面能夠更好的促進神經元再生以及大鼠脊髓損傷后的功能恢復。DPSCs和SHEDs的分泌蛋白質組，即在條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）或細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）中釋放的所有生物活性分子，CM和EV均能夠刺激神經突生長，并在神經系統(tǒng)疾病和神經元損傷的動物模型中表現出神經保護作用[27]。這些研究證明了DPSCs促進神經修復的能力，也為再生醫(yī)學提供了寶貴的資源，但在研究人員進入臨床試驗之前，必須更加徹底地研究不同物種DPSCs的生物學特性和免疫學基礎。

DPSCs修復神經的機制目前尚不明確，無論是通過DPSCs直接分化為神經元樣細胞來補充損失的神經細胞，還是通過DPSCs分泌的神經營養(yǎng)因子作用于病損區(qū)的神經細胞來修復神經，都沒有獲得充分的理論依據支持。綜上所述，在DPSCs的分離、培養(yǎng)、神經向誘導以及臨床應用等各方面，無不充斥著這項研究未來所面臨的挑戰(zhàn)和困難。

4? 展望

基于DPSCs的研究為組織再生領域帶來了光明的未來，尤其是DPSCs的神經向分化更是為神經修復及神經疾病的治療帶來了巨大希望。DPSCs不僅更容易獲取，而且與神經細胞共同來源于神經嵴，因此DPSCs比其他干細胞來源具有更良好的應用前景，是治療神經損傷的理想干細胞來源。

目前，隨著生物材料廣泛用于組織再生，組織再生領域也出現了一線新機，將干細胞工程與生物材料相結合，也為神經修復指明了一個新的方向。在利用DPSCs進行神經修復的研究時，最常采用的生物學材料是糖[7]，另外，如硅膠管[28]、肝素-泊洛沙姆水凝膠[29]、3D納米纖維支架[30]等其他生物學材料也時有報道。Drewry等[31]使用神經向誘導的DPSCs及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）設計了無生物活性支架的細胞片，DPSCs可以分泌高水平的神經營養(yǎng)因子，ECM可以促進軸突延伸，應用于面神經損傷時可以與神經導管結合使用，以增強其生物活性或形成獨立的無支架神經導管，進一步改善面神經的恢復?？傊@些研究提供了關于DPSCs與生物學材料相結合并應用于神經修復或再生的信息，并為開發(fā)應用于神經修復或再生的新生物材料提供了難得的寶貴經驗。國內有研究采用3D懸滴培養(yǎng)技術對前列腺上皮細胞、間充質干細胞、DPSCs進行培養(yǎng)，并發(fā)現3D懸滴培養(yǎng)法獲取的細胞數量與2D貼壁培養(yǎng)法相比，獲得了顯著提升[32-33]。另外，SASAKI等[28]采用三維模擬微重力培養(yǎng)技術培養(yǎng)的DPSCs與靜態(tài)3D技術培養(yǎng)相比，不僅在細胞數量上有顯著提升，而且在細胞的分化潛能（特別是向成牙本質細胞分化）上也明顯提高，但并未對其神經向分化能力進行檢測，這尚需要進行更進一步的研究。

總之，自2000年DPSCs被發(fā)現后，經過國內外學者的不斷探索和深入研究，DPSCs在修復神經損傷以及治療神經系統(tǒng)性疾病等方面的應用已經得到了極大的發(fā)展，但就目前而言，將其真正應用到臨床還為時尚早，仍需要先弄清DPSCs修復神經的機制，進一步提高DPSCs神經向分化的效率，并結合現有的科技及生物學材料，將研究成果實際應用于神經疾患的臨床治療，任重而道遠。

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（收稿日期：2022-07-30）

（修回日期：2022-12-04）