姜荷花‘紅色印象’工廠化組培育苗技術(shù)研究

譚健俊　葉遠(yuǎn)俊　劉金梅　朱根發(fā)　許偉兵　崔曉東　徐曄春

關(guān)鍵詞：姜荷花；外植體；叢生芽誘導(dǎo)；組培；規(guī)?；a(chǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

姜荷花（Curcuma alismatifolia）為姜科姜黃屬多年生球根花卉，原產(chǎn)于泰國(guó)北部，主要觀賞部位是花序頂端的不育苞片，因其形似郁金香，有“熱帶郁金香”的美譽(yù)，具有花型優(yōu)美、顏色艷麗、觀賞期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。荷蘭、泰國(guó)等最早對(duì)姜荷花進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究和商業(yè)種植，作為優(yōu)秀的切花品種引入世界花卉市場(chǎng)[3-4]。中國(guó)于1999 年開(kāi)始引進(jìn)栽培，在臺(tái)灣、廣東、福建等地均有分布種植[5]。在華南地區(qū)生長(zhǎng)的姜荷花，自然花期在6—10 月，正好填補(bǔ)夏秋季節(jié)盆花和切花短缺的空檔[6]。近年來(lái)，隨著對(duì)姜荷花品種雜交選育，以及栽培技術(shù)的改良，培育了許多適合推廣的品種，如‘紅色印象‘鴻運(yùn)‘影子紅等，優(yōu)質(zhì)種苗的需求日益增加[7-9]。自然條件下，姜荷花主要通過(guò)地下塊莖繁殖，存在周期長(zhǎng)、效率低、病蟲(chóng)害風(fēng)險(xiǎn)高等弊端，而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行工廠化組培育苗，可以滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)種苗的需求，實(shí)現(xiàn)保質(zhì)保量。

目前，姜荷花組培擴(kuò)繁技術(shù)研究多集中于培養(yǎng)基種類(lèi)和激素濃度的篩選。牟小翎等[10]2006 年研究發(fā)現(xiàn)采用姜荷花球莖萌發(fā)的小芽作外植體，在MS+NAA 0.02 mg/L 的培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)叢生芽，在MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L 的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖，最終獲得大量組培苗并移栽成活，實(shí)現(xiàn)姜荷花引種國(guó)內(nèi)后首次組培擴(kuò)繁。商宏莉等[11]在‘紅觀音姜荷花的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，采用剝?nèi)ケ荒さ那蚯o切成小塊后，接種到MS+BA2.0～3.0 mg/L+NAA 0.2～0.3 mg/L 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽，增殖階段采用花寶2 號(hào)為主的培養(yǎng)基和TDZ 0.5 mg/L 的組合效果最佳，增殖系數(shù)可達(dá)3.73，經(jīng)過(guò)生根壯苗后移栽成活率可達(dá)95%以上。趙彥杰等[12]研究姜荷花組培快繁技術(shù)，使用消毒后的塊莖切成帶有1～2 個(gè)芽點(diǎn)的小塊，接種在MS+BA 2-3 mg/L+NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基上獲得最佳叢生芽誘導(dǎo)效果，增殖階段繼代接種在MS+BA2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+10%椰子水，增殖倍數(shù)可達(dá)4.4，經(jīng)過(guò)生根壯苗后移栽到疏松透氣的基質(zhì)中成活率可達(dá)94%。在國(guó)外的組織培養(yǎng)報(bào)道中，多集中于姜黃屬姜黃、郁金等藥用植物的組培快繁，也有利用姜荷花未成熟花蕾為外植體材料誘導(dǎo)叢生芽的報(bào)道[13-14]。TOPPOONYANONT 等[15]使用MS+BA 10.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L 培養(yǎng)基接種未成熟的花芽，利用含有高濃度6-BA 的MS 培養(yǎng)基誘導(dǎo)花芽轉(zhuǎn)變成葉芽，成功獲得大量叢生芽，在增殖繼代階段使用MS+TDZ 0.5 mg/L+IMA4.0 mg/L 的培養(yǎng)基，高濃度細(xì)胞分裂素使叢生芽延緩生長(zhǎng)并不斷分化芽點(diǎn)，獲得大量芽簇，可使接種的1 個(gè)芽接種后增殖分枝得到30～40 個(gè)小芽簇， 最后在生根階段MS+BA 0.3 mg/L+IAA0.1 mg/L 培養(yǎng)基中恢復(fù)正常生長(zhǎng)，并移栽成苗。迄今為止，對(duì)姜荷花流行品種和姜黃屬資源開(kāi)展組培快繁研究較多，關(guān)于‘紅色印象的快繁研究尚未開(kāi)展。

在工廠化組培擴(kuò)繁育苗過(guò)程中，綜合成本和時(shí)間周期是重要的參考因素，實(shí)踐操作要求也必須降低，如外植體消毒污染率，切分叢生芽接種的操作難度等，同時(shí)小苗生長(zhǎng)的一致性和移栽成活率也是需要注意的問(wèn)題。為此，本研究以姜荷花‘紅色印象為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其各個(gè)部位的外植體消毒接種，挑選作為外植體的最佳部位，增殖階段比較分析不同濃度激素對(duì)組培苗增殖系數(shù)的影響，最后生根壯苗出瓶，對(duì)移栽不同的種植基質(zhì)的成活率進(jìn)行比較，最終優(yōu)化完善姜荷花工廠化組培擴(kuò)繁育苗技術(shù)流程，實(shí)現(xiàn)技術(shù)與生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合，滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)姜荷花‘紅色印象種苗生產(chǎn)的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料種植在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地環(huán)境園藝研究所大棚內(nèi)，選取外觀飽滿(mǎn)、干凈無(wú)損傷的姜荷花‘紅色印象種球和健壯無(wú)病蟲(chóng)害的植株，分別取材姜荷花的球莖、儲(chǔ)藏根、球莖小芽、側(cè)芽、幼嫩花芽、幼嫩葉片進(jìn)行消毒接種（圖1）。在取材前進(jìn)行適當(dāng)控水保持干燥，降低外植體帶菌量，其中球莖和儲(chǔ)藏根于休眠期取材（12 月至翌年3 月），球莖小芽于萌芽初期取材（4—5 月），側(cè)芽、幼嫩花芽、幼嫩葉片于旺盛生長(zhǎng)期取材（6—9 月）。MS 培養(yǎng)基成分藥品、6-BA和NAA 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同外植體消毒處理 ①姜荷花種球球莖取回后，用洗潔精反復(fù)清洗表面，在流水下沖洗30 min，將儲(chǔ)藏根和球莖分離，表皮清理干凈后，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理，先用75%酒精消毒1 min，再加入1 滴吐溫80 的0.1%升汞溶液消毒20 min，無(wú)菌水沖洗5 遍，二者均切成小塊，球莖的小塊需帶上1～2 個(gè)芽點(diǎn)接種。②用沙藏法恒溫箱28℃催芽獲得姜荷花球莖小芽，待小芽萌發(fā)到2～4 cm 時(shí)切下，流水下沖洗30 min，消毒過(guò)程同上，切除消毒壞死傷口后直接接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。③選擇姜荷花主芽開(kāi)花后旁邊萌發(fā)出的10 cm 以上側(cè)芽，切下后在流水下沖洗30 min，消毒過(guò)程同上，根據(jù)芽大小切分為2～4 塊帶芽點(diǎn)的小塊接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（圖2A）。④選取包裹在葉鞘中的未成熟花序，在超凈工作臺(tái)上剝開(kāi)葉鞘切下幼嫩花序，用75%酒精消毒1 min后，無(wú)菌水沖洗5 遍，在無(wú)菌條件下剝?nèi)グ?，將其中整個(gè)花芽簇切下接種。⑤選用抽出但未展開(kāi)的幼嫩葉片，用75%酒精消毒30 s 后，再加入1 滴吐溫80 的0.1%升汞溶液消毒8 min，無(wú)菌水沖洗5 遍，將幼葉切成0.5 cm×1 cm 左右的小塊，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 選用 MS 培養(yǎng)基進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，設(shè)置不同的6-BA 濃度，具體配方為MS+6-BA（0、1、3、5、10 mg/L）+NAA0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調(diào)至5.8。采用小口徑組培瓶，每瓶只接種1 個(gè)外植體（圖2B），防止交叉污染，不同部位外植體不同培養(yǎng)基各接種30 瓶，2 周后統(tǒng)計(jì)污染數(shù)量。接種后每隔1 個(gè)月繼代更換1 次培養(yǎng)基，并適當(dāng)切除褐化組織和葉片，保留小芽，記錄下接種后第1 個(gè)月的外植體芽啟動(dòng)個(gè)數(shù)。第2 個(gè)月繼代到增殖培養(yǎng)基上，并記錄叢生芽的小芽數(shù)量。姜荷花的幼嫩花芽誘導(dǎo)叢生芽的周期較長(zhǎng)，第1 個(gè)月無(wú)明顯的芽啟動(dòng)現(xiàn)象，因此在第2 個(gè)月時(shí)統(tǒng)計(jì)外植體芽啟動(dòng)個(gè)數(shù)，在第3 個(gè)月繼代到增殖培養(yǎng)基上，并記錄叢生芽的小芽數(shù)量。按下列公式計(jì)算污染率、芽啟動(dòng)率和叢生芽平均芽數(shù)：

1.2.3 叢生芽增殖培養(yǎng) 選用 MS 培養(yǎng)基進(jìn)行叢生芽增殖培養(yǎng)，設(shè)置3 種不同6-BA 濃度，具體配方為MS+6-BA（1、3、5 mg/L）+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調(diào)至5.8。采用240 mL 廣口組培瓶，挑選誘導(dǎo)培養(yǎng)中健康生長(zhǎng)的叢生芽，用無(wú)菌鑷子和手術(shù)刀將叢生芽葉子和根系去除，切割至帶有1～2 小芽的小塊，每瓶接種7 個(gè)（圖2C），每種培養(yǎng)基接種50 個(gè)芽塊，在培養(yǎng)室光照下恒溫培養(yǎng)，每月繼代1 次，記錄繼代接種后出芽個(gè)數(shù)，3 個(gè)月后轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)，最終統(tǒng)計(jì)組培苗數(shù)量，按下列公式計(jì)算增殖系數(shù)：

1.2.4 生根壯苗培養(yǎng) 姜荷花生根容易，只需降低激素濃度，減少叢芽誘導(dǎo)，使用常規(guī)的1/2 MS的生根培養(yǎng)基，具體配方為1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調(diào)至5.8。采用340 mL 廣口組培瓶，將增殖培養(yǎng)獲得的叢生芽去除葉片后，挑選優(yōu)質(zhì)健壯的小芽，切割成單芽接種，每瓶接種7 棵，培養(yǎng)室室內(nèi)恒溫光照培養(yǎng)1個(gè)月（圖2D），剩余叢生芽可以繼代留種，作為下一輪擴(kuò)繁的母瓶。

1.2.5 煉苗移栽育苗 待組培苗株高達(dá)到10 cm以上，具有3 片以上葉片時(shí)進(jìn)行煉苗移栽。將達(dá)到出苗標(biāo)準(zhǔn)的組培瓶搬到大棚苗床上煉苗至少1周，清洗干凈根系附近的培養(yǎng)基，適當(dāng)修剪葉片，用多菌靈1000 倍液溶液浸泡根系10 min，種植在50 孔育苗穴盤(pán)上，注意遮陰保濕，定植后逐漸進(jìn)入正常水肥管理。基質(zhì)選用純細(xì)椰糠、純細(xì)泥炭和細(xì)椰糠∶細(xì)泥炭1∶1 混合基質(zhì)，每種基質(zhì)各種100 棵，每組處理3 個(gè)重復(fù)，1 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)移栽成活率（圖2E）。

1.2.6 組培苗遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 采集母株和隨機(jī)選擇20 棵留種擴(kuò)繁第10 代的組培苗幼嫩葉片，采用北京天根公司試劑盒提取基因組DNA，利用TP-M13-SSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。選用課題組前期開(kāi)發(fā)的EST-SSR 標(biāo)記用于擴(kuò)增[5]，在1.5%瓊脂糖電泳中檢測(cè)擴(kuò)增穩(wěn)定性，并利用TP-M13 熒光測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)多態(tài)性[16]。擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3730 DNA 自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)，利用GeneMarker 1.51 對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010 和SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用Duncans 法進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)各平均值在0.05 水平上的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜荷花外植體和叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

本研究通過(guò)接種姜荷花不同部位的外植體，以不同6-BA 濃度的MS 培養(yǎng)基啟動(dòng)誘導(dǎo)，研究誘導(dǎo)姜荷花叢生芽最高效的方法，結(jié)果如表1 和表2 所示。由表1 可知，不同的外植體污染率差別較大，其中球莖和儲(chǔ)藏根接種污染率較高，均達(dá)到50%以上，其他部位的接種污染率控制在20%以?xún)?nèi)，主要與外植體生長(zhǎng)部位環(huán)境相關(guān)，初步表明地上部位消毒效果優(yōu)于地下部位。在叢生芽誘導(dǎo)效果方面，儲(chǔ)藏根和葉片均無(wú)法誘導(dǎo)叢生芽，只有含芽點(diǎn)的部位可以直接誘導(dǎo)叢生芽。幼嫩花芽需要高濃度的6-BA 或者效果更強(qiáng)的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)才能產(chǎn)生叢生芽，且誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間最長(zhǎng)，不適宜用于姜荷花工廠化育苗。球莖小芽和側(cè)芽的效果最好，叢生芽啟動(dòng)率達(dá)70%以上，可作為外植體誘導(dǎo)效果最佳的材料。

由表 2 可知，當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA 濃度上升時(shí)，叢生芽啟動(dòng)率不斷增加。6-BA 濃度≥3 mg/L 時(shí)，球莖小芽和側(cè)芽的叢生芽啟動(dòng)率可以達(dá)到近80%。叢生芽的平均小芽數(shù)量也隨著6-BA濃度的增加而增加，當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA 濃度為10 mg/L，球莖、球莖小芽、側(cè)芽誘導(dǎo)的叢生芽平均芽數(shù)最高，達(dá)到2.4～2.5。同時(shí)發(fā)現(xiàn)高濃度6-BA 誘導(dǎo)的叢生芽雖然數(shù)量多，但小芽淺綠細(xì)長(zhǎng)，繼代后小苗生長(zhǎng)勢(shì)較弱，有玻璃化趨勢(shì)。幼嫩花芽的叢生芽誘導(dǎo)需要5 mg/L 及以上的高濃度6-BA 誘導(dǎo)啟動(dòng)，否則無(wú)法誘導(dǎo)花芽轉(zhuǎn)變產(chǎn)生葉芽，繼而分化獲得叢生芽。結(jié)合消毒接種的操作難度，發(fā)現(xiàn)姜荷花誘導(dǎo)初代叢生芽的最佳外植體材料是球莖小芽和側(cè)芽，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA （ 3 、5 mg/L ） +NAA 0.2 mg/L+ 蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調(diào)至5.8。

2.2 姜荷花叢生芽增殖培養(yǎng)基篩選

由表 3 可知，當(dāng)增殖培養(yǎng)基的6-BA 濃度增加，姜荷花叢生芽的增殖系數(shù)明顯提升，其中6-BA 濃度為5 mg/L 的增殖培養(yǎng)基的平均增殖系數(shù)最高，達(dá)到2.54，壯苗數(shù)量也最多，為643 棵。由外植體誘導(dǎo)獲得的初代叢生芽，在增殖培養(yǎng)基上不斷繼代，每一輪的增殖系數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，外源激素在叢生芽體內(nèi)累積效應(yīng)明顯，其中6-BA濃度為5 mg/L 的增殖培養(yǎng)基在第3 輪的繼代培養(yǎng)中，增殖系數(shù)高達(dá)3.43。雖然在高濃度6-BA 的影響下叢生芽數(shù)量大幅增加，但叢生芽的整體質(zhì)量不斷下滑，在第3 輪6-BA 濃度為5 mg/L 的增殖培養(yǎng)中觀察發(fā)現(xiàn)，部分新生的叢生芽出現(xiàn)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受抑制，形成被抑制的芽簇。雖然增殖系數(shù)增加，但組培苗之間生長(zhǎng)速度變得不一致，品質(zhì)也難以控制，對(duì)工廠化生產(chǎn)較為不利。在6-BA濃度為≤3 mg/L 的增殖培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)芽生長(zhǎng)受抑制的現(xiàn)象，組培苗健壯正常生長(zhǎng)。因此，姜荷花工廠化育苗的最佳叢生芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，pH 調(diào)至5.8。

2.3 姜荷花生根壯苗和煉苗移栽

在增殖培養(yǎng)后期挑選生長(zhǎng)健壯的單個(gè)小芽，接種在1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉膠7 g/L 的壯苗培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)組培苗生長(zhǎng)健壯，整齊度一致，壯苗效果明顯。由表4 可知，3 種基質(zhì)的移栽成活率均達(dá)到90%以上，通過(guò)方差分析顯示基質(zhì)間的平均成活率無(wú)顯著差別。不同基質(zhì)間姜荷花組培苗的生長(zhǎng)情況略有差異，細(xì)泥炭保水性強(qiáng)，但透氣性差，出現(xiàn)少量組培苗根莖腐爛死亡的現(xiàn)象，是3 種基質(zhì)中成活率最低的。細(xì)椰糠透氣性強(qiáng)，保水保肥能力一般，成活率接近混合基質(zhì)，但小苗后期生長(zhǎng)葉緣發(fā)黃，可能與缺素癥相關(guān)。細(xì)椰糠∶細(xì)泥炭1∶1 混合基質(zhì)的平均成活率最高，達(dá)95.33%，小苗后期生長(zhǎng)健壯，無(wú)不良癥狀，適宜作為出苗移栽的最佳基質(zhì)。移栽后對(duì)小苗進(jìn)行觀察，表型穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)明顯的表型變異。

2.4 組培苗遺傳穩(wěn)定性分析

使用 8 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記引物對(duì)隨機(jī)選取的20株組培苗擴(kuò)繁到第10 代組培苗進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。結(jié)果（表5）顯示，8 對(duì)引物全部可以穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰的條帶（圖3），產(chǎn)物大小范圍為100～300 bp。毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4 所示，引物JHH12 在母株和20 株組培苗中均有2 個(gè)峰值，產(chǎn)物大小完全一致，表明組培苗未發(fā)生DNA水平的變異，與母株完全一致。

3 討論

工廠化組培育苗的快速繁殖主要通過(guò)器官發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)，可分為直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑[17]。前者主要是通過(guò)主芽、側(cè)芽等作為外植體通過(guò)外源激素誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，再通過(guò)人工切割操作，實(shí)現(xiàn)叢生芽數(shù)量的倍數(shù)增加，該途徑優(yōu)點(diǎn)是變異率低，可以保持母本優(yōu)良性狀，后者則是通過(guò)外源激素誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，通過(guò)繼代增殖愈傷組織，最終再分化得到新植株，該途徑優(yōu)點(diǎn)是增殖系數(shù)高，外植體取材方便，只需要幼嫩葉片等作為外植體材料，但變異率高難以保持母本性狀[18]。

在本研究中，姜荷花‘紅色印象的幼嫩葉片和儲(chǔ)藏根接種誘導(dǎo)并未觀察到愈傷組織產(chǎn)生，可以得知姜荷花的組培快繁主要通過(guò)直接器官發(fā)生途徑，屬于較難誘導(dǎo)愈傷產(chǎn)生和再分化的植物之一，這與MAHADTANAPUK 等[19]對(duì)姜荷花組織培養(yǎng)研究結(jié)果相似。在外植體的選擇上，姜荷花的球莖由于長(zhǎng)期埋在土壤中，作為外植體消毒效果差，接種后污染率高，而且由于球莖上的芽點(diǎn)過(guò)于幼嫩，在消毒過(guò)程中活力容易受到影響，不適宜批量取材接種。而選擇花芽作為外植體，雖然污染率低，但是取材時(shí)期受限制，只有姜荷花開(kāi)花早期的5—8 月可以取材，使用花芽誘導(dǎo)葉芽發(fā)生需要的時(shí)間也更長(zhǎng)，需要60～80 d。較為理想的外植體材料為球莖小芽和側(cè)芽，誘導(dǎo)叢生芽的時(shí)間短，只需要30～50 d。球莖小芽取材方便，可以通過(guò)沙盤(pán)法催芽全年取材。在大規(guī)模的工廠化育苗過(guò)程中，品種的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。所有外植體材料中，側(cè)芽的取材時(shí)期為母株第一次開(kāi)花后，可以做到準(zhǔn)確判斷品種，防止出現(xiàn)取材錯(cuò)誤，在生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)保質(zhì)保量。通過(guò)隨機(jī)選取20株擴(kuò)繁第10 代的組培苗，提取DNA 進(jìn)行的TP-M13-SSR 分子標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)，研究結(jié)果表明8 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記引物擴(kuò)增目的片段的大小數(shù)量與母株完全一致，與母株相比均未發(fā)生DNA 水平上的變異，通過(guò)該組培技術(shù)擴(kuò)繁10 代的種苗依舊保持低變異率[20-21]。

姜荷花的組培以MS 培養(yǎng)基為主，在許多姜黃屬植物的組織培養(yǎng)中使用廣泛[22-24]，本研究中姜荷花組培苗生長(zhǎng)生根健壯正常，葉片鮮綠，培養(yǎng)效果較好。姜荷花的增殖繼代培養(yǎng)主要使用6-BA、TDZ 等細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)叢生芽的增殖，當(dāng)使用低濃度細(xì)胞分裂素，如6-BA 濃度為1～3 mg/L 的MS 培養(yǎng)基做增殖培養(yǎng)時(shí)，叢生芽正常生長(zhǎng)，增殖系數(shù)保持在2～3 之間，組培苗生長(zhǎng)速度一致，適合作為工廠化組培快繁的增殖培養(yǎng)基使用。當(dāng)增殖培養(yǎng)基中6-BA 濃度≥5 mg/L 或使用細(xì)胞分裂素活性更強(qiáng)的TDZ 作增殖培養(yǎng)時(shí)，姜荷花的部分不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制，呈現(xiàn)被抑制的叢生芽狀態(tài)，繼代到低濃度細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上可以逐漸恢復(fù)正常生長(zhǎng)，其增殖系數(shù)可以達(dá)到4～8。但該增殖方式不適用于工廠化組培育苗，組培苗生長(zhǎng)速度不一致對(duì)工廠化管理和生產(chǎn)計(jì)劃安排會(huì)造成較大麻煩。這種增殖方式適合優(yōu)良新品種（系）的擴(kuò)繁或者稀有品種的母瓶生產(chǎn)，高增殖系數(shù)可以快速獲得大量組培苗母瓶或者小苗。

通過(guò)本研究獲得生長(zhǎng)整齊一致的姜荷花組培苗，同時(shí)對(duì)姜荷花組培苗的出瓶移栽育苗技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)姜荷花組培苗喜疏松透氣的基質(zhì)，生根簡(jiǎn)單，移栽成活率高，可達(dá)到90%以上成活率，其中組培苗種植基質(zhì)選用細(xì)泥炭∶細(xì)椰糠1∶1 混合基質(zhì)最佳[25]。單獨(dú)使用其中一種基質(zhì)效果低于兩種混合效果，細(xì)泥炭保水性強(qiáng)，含有大量有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，但在高溫高濕條件下容易滋生病原菌，加上組培苗出瓶過(guò)程容易受到機(jī)械擦傷，種植過(guò)程中觀察到少量組培苗出現(xiàn)根莖腐爛現(xiàn)象，因此不適合直接使用細(xì)泥炭出苗種植。細(xì)椰糠整體pH呈酸性，不易滋生病菌，透氣性強(qiáng)，適合作為姜荷花組培苗出瓶移栽育苗的種植基質(zhì)，但椰糠礦質(zhì)元素含量低，栽培過(guò)程中需要及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)元素，進(jìn)入后期旺盛生長(zhǎng)階段時(shí)養(yǎng)分供應(yīng)不足，出現(xiàn)葉緣發(fā)黃現(xiàn)象[26]。椰糠適合用于混配基質(zhì)，經(jīng)過(guò)混合細(xì)泥炭等基質(zhì)改良后使用效果更佳。

綜上，姜荷花‘紅色印象工廠化組培育苗技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于克服外植體誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽增殖擴(kuò)繁，以及出瓶移栽育苗步驟。研究結(jié)果表明，姜荷花‘紅色印象最佳的外植體為球莖小芽和側(cè)芽，基本可以滿(mǎn)足全年任何時(shí)候的外植體接種需要，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA（3、5 mg/L）+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L。增殖擴(kuò)繁階段的最佳叢生芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L，叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到2～3，小芽生長(zhǎng)健壯，切分操作簡(jiǎn)單。生根壯苗培養(yǎng)基選用1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉膠7 g/L，生根率100%，經(jīng)過(guò)煉苗后出瓶移栽，組培苗種植基質(zhì)宜選用細(xì)泥炭∶細(xì)椰糠1∶1 混合基質(zhì)最佳，出瓶移栽成活率95%以上，經(jīng)過(guò)表型觀察和分子檢測(cè)，擴(kuò)繁多代的組培苗表型和DNA 水平上與母株相比均未發(fā)生明顯變異。