卵黃抗體及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的研究進(jìn)展

于子健 楊冰 謝國(guó)駟 史成銀

摘 要：卵黃抗體（IgY）是一種存在于卵黃中的免疫球蛋白，具有性質(zhì)穩(wěn)定、安全高效、綠色環(huán)保、不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。文章介紹了卵黃抗體的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和作用機(jī)制以及卵黃抗體在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景，以期為今后卵黃抗體在水產(chǎn)養(yǎng)殖的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：卵黃抗體；水產(chǎn)養(yǎng)殖；病害防治

我國(guó)是漁業(yè)大國(guó)，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國(guó)。2021年，全國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量6 690.29萬(wàn)噸，養(yǎng)殖產(chǎn)品占比達(dá)到了80.63%，中國(guó)養(yǎng)殖水產(chǎn)品占世界水產(chǎn)品養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%以上［1］。但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加以及養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致水體環(huán)境污染嚴(yán)重，水產(chǎn)動(dòng)物病害頻發(fā)，病害發(fā)生的時(shí)間增長(zhǎng)、規(guī)模增大，病害種類增加，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的防治工作難度加大。嚴(yán)重的病害問(wèn)題不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而且嚴(yán)重威脅到水產(chǎn)品的質(zhì)量以及人類的安全。因此，加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治的研究有著至關(guān)重要的意義?？股赜休^強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)和殺滅細(xì)菌的作用，被廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治。但抗生素的濫用也會(huì)給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)一定程度的副作用及危害，不僅會(huì)產(chǎn)生耐藥菌株，破壞水體環(huán)境，藥物殘留問(wèn)題更會(huì)直接危害到人體健康。2020年7月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了“禁抗令”，在禁止抗生素使用后，尋找安全、綠色、高效的抗生素替代品成為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的研究熱點(diǎn)。卵黃抗體具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)和使用方便等優(yōu)勢(shì)，是預(yù)防和治療疾病的理想藥物，其作為一種抗生素藥物的替代品，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 卵黃抗體研究進(jìn)展

卵黃免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk，IgY）又稱卵黃抗體，是指從免疫后的禽類卵黃中提取的針對(duì)特定抗原的抗體［2］。1893年，Klemperer［3］首次發(fā)現(xiàn)通過(guò)免疫產(chǎn)蛋母雞可以從其卵黃中獲得具有中和作用的特異性抗體；1969年，Leslie和Clem［4］將這種富集于卵黃中的免疫球蛋白命名為IgY。然而，在之后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，卵黃抗體的發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有引起學(xué)者們的重視。直到20世紀(jì)末期，動(dòng)物福利問(wèn)題逐漸受到重視，卵黃抗體才再次進(jìn)入學(xué)者們的視野。目前，卵黃抗體在畜禽養(yǎng)殖、免疫檢測(cè)、疾病防治等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著對(duì)IgY研究的不斷深入，卵黃抗體在水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病、病毒性疾病防治領(lǐng)域也有相關(guān)應(yīng)用的報(bào)道。

1.1 卵黃抗體的分子結(jié)構(gòu)

IgY呈Y型結(jié)構(gòu)，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，分子量約為180 ku。輕鏈約為22～30 kDa，由1個(gè)可變區(qū)VL和1個(gè)恒定區(qū)CL構(gòu)成；重鏈約為67～70 kDa，由1個(gè)可變區(qū)VH和4個(gè)恒定區(qū)Cυ1、Cυ2、Cυ3、Cυ4構(gòu)成［5-6］。輕鏈（VL-CL）和重鏈（VH-Cυ1）之間通過(guò)二硫鍵連接，構(gòu)成了IgY的抗原結(jié)合區(qū)（Fab區(qū)），其可變末端（VL和VH）共同構(gòu)成了IgY的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，決定了抗體的抗原特異性［7］。重鏈間存在3個(gè)重鏈間二硫鍵［8］，重鏈的Cυ2、Cυ3、Cυ4區(qū)為可結(jié)晶片段（Fc區(qū)），是IgY與細(xì)胞表面受體或補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白相互作用的部位，在涉及去除病原體的補(bǔ)體系統(tǒng)中起主要作用，例如裂解入侵細(xì)胞、經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活和吞噬外來(lái)病原等［9-10］。

1.2 卵黃抗體的理化性質(zhì)

IgY性質(zhì)穩(wěn)定，即使作為一種生物蛋白大分子，也具有較強(qiáng)的耐熱、耐酸以及抗酶降解能力。IgY在30～70 ℃的溫度范圍內(nèi)也能保持穩(wěn)定，但在70 ℃或更高溫度下加熱15 min后活性會(huì)明顯下降［11-12］；干燥處理后的IgY制劑可以在4 ℃條件下儲(chǔ)存5～10年，在室溫條件下放置6個(gè)月其活性也不會(huì)明顯改變［13］。IgY在pH值4.0～11.0時(shí)比較穩(wěn)定，當(dāng)pH值＜4.0或pH值＞12.0時(shí)活性會(huì)迅速下降［14］。研究顯示，pH值和酶與底物的比例不同，卵黃抗體對(duì)胃蛋白酶的耐受程度也會(huì)發(fā)生變化；卵黃抗體抗胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的水解能力要強(qiáng)于胃蛋白酶，在胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化8 h后，仍能保留部分活性［15］。

1.3 卵黃抗體的作用機(jī)制

關(guān)于IgY防治疾病的具體機(jī)制尚未闡明，但是根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果來(lái)看，卵黃抗體在防治疾病過(guò)程中，主要通過(guò)以下幾種機(jī)理發(fā)揮作用［16］：一是卵黃抗體可以通過(guò)凝集作用使細(xì)菌凝集，破壞細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和定植。靖凱霖等［17］通過(guò)透射電鏡、免疫熒光電鏡和掃描電鏡實(shí)驗(yàn)表明，特異性IgY可以使?fàn)N爛弧菌凝集，改變其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞完整性致菌體死亡。二是卵黃抗體可以通過(guò)黏附作用，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而減少毒素的產(chǎn)生和釋放。靖凱霖等［17］的研究顯示，特異性IgY能夠有效阻止?fàn)N爛弧菌在固體培養(yǎng)基上黏附，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。三是卵黃抗體可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，清除有害物質(zhì)，避免病原的擴(kuò)散。Li等［18］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，與非特異性卵黃抗體相比，抗鰻弧菌卵黃抗體可顯著提高巨噬細(xì)胞對(duì)鰻弧菌的體外吞噬活性，表明特異性IgY可通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用來(lái)降低組織中的細(xì)菌負(fù)荷。四是當(dāng)卵黃抗體進(jìn)入體內(nèi)后，會(huì)被腸道內(nèi)的消化酶降解為小肽，這些小肽可以與特定病原體結(jié)合達(dá)到中和病毒的作用［19］。五是卵黃抗體可以識(shí)別病毒表面的結(jié)構(gòu)蛋白或整個(gè)病毒粒子，并與之結(jié)合后破壞病毒的結(jié)構(gòu)，影響病毒與細(xì)胞結(jié)合，從而避免宿主受到病毒的侵染。Li等［20］的研究證實(shí)，抗rVP60-N IgY可以很好地識(shí)別和檢測(cè)到RHDV（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染的肝臟中的病毒粒子，阻斷病毒的傳播與感染。

2 卵黃抗體在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的應(yīng)用

目前的研究表明，卵黃抗體能夠有效防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病和病毒性疾病。卵黃抗體的應(yīng)用方式有注射、浸泡和口服，不同的使用方式，所產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果也會(huì)有所差異。其中，注射方式的免疫效果最好，可直接提高血清中的抗體水平，適用于因病原體感染引起的全身性病變［21］。浸泡免疫對(duì)于很多水生動(dòng)物體表病原引起的感染效果更好，與注射免疫相比，浸泡免疫雖然能在一定程度上減小對(duì)水生動(dòng)物的刺激，但是也存在抗體需求量大、生產(chǎn)成本較高等問(wèn)題?？诜庖吒m用于防治腸道微生物引起的感染［22］，通過(guò)口服卵黃抗體的方式來(lái)靶向消除病原的感染是有顯著療效的。因此，在考慮動(dòng)物福利和實(shí)際生產(chǎn)可行性的同時(shí)，口服免疫是一種更理想的預(yù)防策略［23］。

2.1 防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病

近年來(lái)，將卵黃抗體用于防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的研究已有較多報(bào)道。Zhang等［23］在抗哈維氏弧菌特異性IgY對(duì)日本河豚的被動(dòng)免疫保護(hù)研究中發(fā)現(xiàn)，注射、口服和浸泡的方式均能夠增強(qiáng)日本河豚的抵抗力。攻毒后特異性卵黃抗體組的存活率分別為80%、50%和60%，均顯著高于非特異性卵黃抗體組和對(duì)照組，表明特異性卵黃抗體能夠有效預(yù)防日本河豚哈維氏弧菌病。Li等［24］的實(shí)驗(yàn)表明，注射和浸泡抗?fàn)N爛弧菌特異性IgY能夠顯著降低仿刺參呼吸樹(shù)、體壁、腸和體腔液中的細(xì)菌載量，增強(qiáng)體腔細(xì)胞的吞噬活性，將感染仿刺參的存活率提高了60%，具有良好的預(yù)防和治療的作用。Xu等［25］在飼料中添加5%、3%和1%殼聚糖-藻酸鹽包被的特異性IgY，連續(xù)投喂7 d后，對(duì)大菱鲆進(jìn)行愛(ài)德華氏菌的注射攻毒，并在攻毒后對(duì)大菱鲆頭腎和脾臟組織的免疫相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，口服微囊化IgY可以顯著降低脾臟和頭腎中促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-8、TNF-α）和補(bǔ)體C3的轉(zhuǎn)錄水平，減輕炎癥反應(yīng)，并將大菱鲆的存活率由0%提高到63.3%、56.7%和20%。王仁寶等［26］用添加了含0.2%和0.5%抗致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease，VpAHPND）卵黃抗體制劑的飼料來(lái)投喂凡納濱對(duì)蝦，測(cè)定了對(duì)蝦肝胰腺免疫酶活和免疫基因的相對(duì)表達(dá)水平，并通過(guò)浸浴感染實(shí)驗(yàn)對(duì)特異性IgY的保護(hù)效果進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示，添加0.2% VpAHPND卵黃抗體制劑可顯著提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）活力和抗菌肽基因（Crustin）的相對(duì)表達(dá)水平，增強(qiáng)對(duì)蝦免疫機(jī)能。在浸浴感染實(shí)驗(yàn)中，0.2%免疫組對(duì)蝦的存活率為72.22%，0.5%免疫組對(duì)蝦的存活率為48.89%，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的存活率均高于對(duì)照組的23.33%，但0.5%免疫組與對(duì)照組的差異不顯著；結(jié)果表明，卵黃抗體的抗病效果與其添加劑量密切相關(guān)，適量添加卵黃抗體制劑可顯著提高患病對(duì)蝦的存活率，提高對(duì)蝦抗VpAHPND感染的能力。

2.2 防治水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疾病

目前，關(guān)于卵黃抗體在防治水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疾病的研究主要集中在了對(duì)蝦白斑綜合征（white spot disease，WSD）上，對(duì)于病毒性神經(jīng)壞死?。╲iral nervous necrosis，VNN）和錦鯉皰疹病毒?。╧oi herpes virus disease，KHVD）也有少量報(bào)道。王仁寶等［27］的人工感染結(jié)果顯示，添加了0.2%和0.5%抗白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的卵黃抗體制劑實(shí)驗(yàn)組的存活率分別為48.89%和87.78%，均顯著高于對(duì)照組。免疫功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加0.5% WSSV卵黃抗體制劑能夠明顯提高對(duì)蝦的PO、SOD活力和熱休克蛋白70基因（Hsp70）相對(duì)表達(dá)水平。研究表明，口服特異性卵黃抗體，能夠增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦的免疫力，提高對(duì)蝦抗WSSV感染的能力，在一定程度上延緩對(duì)蝦的死亡。盧亞楠等［28］通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒制備了抗WSSV特異性IgY，并且采用注射、口服、浸泡的方式對(duì)抗WSSV特異性卵黃抗體的保護(hù)效果進(jìn)行了評(píng)估。研究結(jié)果顯示，注射、口服、浸泡滅活疫苗的IgY各實(shí)驗(yàn)組累計(jì)存活率相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照顯著提升80%、46.7%及66.7%，表明IgY能夠很好地中和病毒，降低感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率，表現(xiàn)出很好的免疫保護(hù)效果。Liu等［29］發(fā)現(xiàn)制備的特異性卵黃抗體能夠中和病毒，有效阻斷赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒（red spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）對(duì)石斑魚鰭細(xì)胞系（grouper fin cell line，GF-1）的侵襲。用含10%特異性卵黃粉的飼料投喂石斑魚幼魚，治療組和連續(xù)喂養(yǎng)組的相對(duì)保護(hù)率分別達(dá)到了68%和70%，組織中的病毒載量也顯著降低，表明抗RGNNV-IgY能夠有效地保護(hù)石斑魚免受RGNNV感染。Liu等［30］通過(guò)免疫蛋雞獲得了抗鯉皰疹病毒3型特異性卵黃抗體，并在連續(xù)投喂10 d含0.05%特異性IgY的顆粒飼料后，對(duì)鯉進(jìn)行攻毒。經(jīng)IgY口服被動(dòng)免疫后，鯉的死亡率由85%下降至30%。結(jié)果表明，抗CyHV-3 IgY可以有效降低鯉皰疹病毒3型（cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）感染的鯉的死亡率，為鯉提供被動(dòng)保護(hù)。

3 展望

卵黃抗體具有性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、綠色安全、符合動(dòng)物福利要求等優(yōu)勢(shì)，在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治方面得到了廣泛應(yīng)用。目前的研究表明，用特異性抗原免疫蛋雞制備出的特異性卵黃抗體，通過(guò)注射、口服、浸泡的方式均可以引發(fā)動(dòng)物機(jī)體的被動(dòng)免疫機(jī)制，起到預(yù)防、治療動(dòng)物疾病的作用。卵黃抗體口服應(yīng)用中，IgY在進(jìn)入動(dòng)物腸道后會(huì)受到胃蛋白酶和胰蛋白酶的影響，但是利用β-環(huán)糊精［31］、卵磷脂、膽固醇［32］、海藻酸鈉［25，33］等進(jìn)行包被處理后，能極大提高IgY抗水解能力，充分保證了IgY的活性。雖然口服的效果不如注射和浸泡，但是口服的方式不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生刺激，勞動(dòng)強(qiáng)度小，節(jié)約成本，具有很強(qiáng)的可行性。同時(shí)，將卵黃抗體作為添加劑添加到飼料中，不僅可以促進(jìn)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，改善水產(chǎn)品的品質(zhì)，還能在一定程度上提高機(jī)體的免疫功能，對(duì)預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病具有積極作用。

目前，卵黃抗體在生產(chǎn)應(yīng)用中也存在以下幾個(gè)問(wèn)題：一是，卵黃抗體的免疫保護(hù)效果受添加劑量的影響，不同抗原的卵黃抗體的最適添加劑量難以確定；二是，目前卵黃抗體產(chǎn)業(yè)還未形成標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程，生產(chǎn)出的產(chǎn)品參差不齊，實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中的保護(hù)效果差異明顯；三是，卵黃抗體的大規(guī)模應(yīng)用仍受到提純工藝的限制，目前的卵黃抗體提純工藝差，生產(chǎn)成本高，還沒(méi)有一種適用于工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)高效的提純方法。因此，今后應(yīng)在如何提高抗體的免疫保護(hù)效果、降低生產(chǎn)成本等方面展開(kāi)深入研究，充分發(fā)揮卵黃抗體在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治方面的作用，推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的綠色健康、可持續(xù)發(fā)展。

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（收稿日期：2022-12-11）