中西藥聯(lián)用對(duì)柱狀黃桿菌體外抑菌作用研究

趙良煒 徐赟霞 王禹 馮守明 尤宏?duì)? 張振國

摘要：為研究中西藥復(fù)方制劑對(duì)柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）的抑菌效果，采用水煎煮法提取五倍子、黃芩等12種中草藥的活性成分，首先采用紙片法測(cè)定15種藥物中西藥單方制劑的抑菌效果，然后使用二倍稀釋法測(cè)定具有抑菌效果藥物的最小抑菌濃度，最后使用采用棋盤交叉法測(cè)定中西藥復(fù)方制劑的協(xié)同作用。結(jié)果表明，氟苯尼考和黃芩聯(lián)用形成的復(fù)方制劑對(duì)柱狀黃桿菌具有協(xié)較好的抑菌作用。

關(guān)鍵詞：中西藥；最小抑菌濃度（MIC）；聯(lián)合抑菌指數(shù)（FIC）

中圖分類號(hào)：S942.1 ????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：：A

基金項(xiàng)目：甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（21CX6NP223）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（22ZYCGSN00050）。

作者簡(jiǎn)介：趙良煒（1983-），男，工程師，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害防治。E-mail： 75985330@qq.com。

*通訊作者：張振國（1981—），E-mail：zhangzg8249@163.com。

柱狀病的病原是柱狀黃桿菌，柱狀黃桿菌可以感染草魚［1］、鯉魚［2］、斑點(diǎn)叉尾鮰［3］、銀龍魚［4］、蟲紋鱈鱸［5］等魚類，幾乎所有的淡水魚類都易感。感染初期鰭條頂端、吻端，皮膚鰓絲末端生長繁殖，形成黃白色點(diǎn)狀病灶，隨著病情發(fā)展，鰭條蛀爛，向基部潰爛，鰓絲潰爛。以柱狀黃桿菌為研究對(duì)象，進(jìn)行了中西藥單方及復(fù)方制劑的體外抑制試驗(yàn)。

1 材料方法

1.1 菌株

柱狀黃桿菌分離于發(fā)病蟲紋鱈鱸Murraycod （Maccullochella peelii peelii）；恩諾沙星、復(fù)方磺胺二甲氧嘧啶、氟苯尼考購于北京漁經(jīng)公司；黃柏、黃芩、金銀花、板藍(lán)根、苦參、大黃、魚腥草、五倍子、穿心蓮、黃芪、大青葉、連翹購自甘肅省卓尼縣九峰生態(tài)藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備

西藥母液的制備：稱取市場(chǎng)上購買的西藥50mg，溶于50mL滅菌水，完全溶解后0.22μm濾膜過濾除菌，制備成1000mg/L的藥液，4℃保存?zhèn)溆?。中草藥的制備?稱取10 g藥物， 加入滅菌水100 mL浸泡1 h， 煎煮0.5 h， 不時(shí)進(jìn)行攪拌， 藥液用尼龍紗布過濾， 濾渣再次煎煮、過濾， 合并藥液后，水浴濃縮至50mL，藥液濃度即為200mg/mL， 5000rpm離心，取上清，0.22μm濾膜過濾除菌。配制好的藥物分裝于1.5 mL滅菌離心管中， -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 藥物的初篩

采用紙片擴(kuò)散法， 參照杭州天和微生物有限公司操作手冊(cè)進(jìn)行， 黃桿菌采用Shieh培養(yǎng)基。均勻涂布試驗(yàn)菌液（1.0×108 CFU/mL）于平板上， 將空白藥敏紙片平貼于平板上（4片/平板），每個(gè)空白紙滴加5μL藥液， 28℃培養(yǎng)48h，用精度1mm尺子測(cè)量抑菌環(huán)的直徑， 并記錄結(jié)果。

1.2.2 藥物的最小抑菌濃度測(cè)定

根據(jù)初篩結(jié)果，選取抑菌效果較好的藥物進(jìn)行最小抑菌濃度測(cè)定。在1.5mL離心管進(jìn)行，第1管中加入900μL液體培養(yǎng)基，第2管至第12管分別加入500μL培養(yǎng)基，第1管加入100μL藥液，混勻后吸出500μL加入第2管，依次2倍稀釋，只至最后1管。每個(gè)管加入10μL菌液，28℃振蕩培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長。另外，做1個(gè)陽性對(duì)照（加菌不加藥）和1個(gè)陰性對(duì)照（不加藥不加菌）。

1.2.3 中西藥聯(lián)合抑菌指數(shù)（ FIC） 的測(cè)定

采用棋盤交叉法［6-8］， 以藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）的2倍濃度開始進(jìn)行2倍梯度稀釋。2種藥物的稀釋分別在微量細(xì)胞培養(yǎng)板的列和行進(jìn)行， 一種藥物是沿行稀釋， 在同一列上各孔的藥物濃度相同； 另一種藥物沿列稀釋， 同一行中各孔的藥物濃度相同。這樣在每孔中可得到不同濃度組合的2種藥物混合液。每塊細(xì)胞培養(yǎng)板均設(shè)有不加菌液的陰性對(duì)照和不加藥物的陽性對(duì)照。除不加菌液的對(duì)照孔外， 每孔中加入10μL活化的細(xì)菌培養(yǎng)物（1×108 CFU/mL）， 振蕩混合均勻， 28℃培養(yǎng) 24 h。每個(gè)樣品進(jìn)行4次重復(fù)。

西藥與中藥聯(lián)用試驗(yàn)以FIC（Fractional Inhibitory Concentration）指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判定依據(jù)。FIC指數(shù)= （聯(lián)用后A藥MIC值/聯(lián)用前A藥MIC值） + （聯(lián)用后B藥MIC值/聯(lián)用前B藥MIC值）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC指數(shù)≤0.75時(shí)，兩藥為協(xié)同作用；FIC指數(shù)=1時(shí)， 兩藥為相加作用；1 2時(shí)， 則兩藥為拮抗作用。FIC指數(shù)越小， 協(xié)同作用越強(qiáng)， 若小于0.5則認(rèn)為兩藥有顯著的協(xié)同作用。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 初篩藥敏結(jié)果

對(duì)柱狀黃桿菌藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)，參照常用抗生素藥物敏感性試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)分析，柱狀黃桿菌對(duì)氟苯尼考、黃芩和五倍子3種藥物敏感性（見圖1、圖2及表1）。

2.2 最小抑菌濃度測(cè)定

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取氟苯尼考、黃芩和五倍子3種藥物測(cè)定對(duì)柱狀黃桿菌最小抑菌濃度，氟苯尼考最小抑菌濃度為1.25 mg/L，黃芩最小抑菌濃度為1.25 mg/mL，五倍子最小抑菌濃度為0.156 mg/mL。

2.3 中西藥聯(lián)用結(jié)果

按照1.2.3中的測(cè)定方法，測(cè)定氟苯尼考+黃芩和氟苯尼考+五倍子聯(lián)用效果，結(jié)果顯示，氟苯尼考+黃芩聯(lián)用后，具有協(xié)同抑菌作用；氟苯尼考+ 五倍子聯(lián)用后，不具有協(xié)同抑菌作用。（見表2）

3? 結(jié)論與討論

柱狀黃桿菌引起的魚類疾病目前主要采用投喂抗生素或中草藥以及消毒劑消毒等方法來治療［9-11］，例如張?jiān)热藞?bào)道單方中草藥訶子、烏梅、連翹、五倍子對(duì)鱖源柱狀黃桿菌有較好的抑菌效果，張玉蕾［12］等人黃顙魚源柱狀黃桿菌對(duì)四環(huán)素、新霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考5種藥物敏感，對(duì)中西藥復(fù)方聯(lián)合治療還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)選取了水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的氟苯尼考、恩諾沙星和復(fù)方磺胺二甲氧嘧啶3種抗生素類藥物，同時(shí)選取黃柏、黃芩、金銀花、板藍(lán)根、苦參、大黃、魚腥草、穿心蓮、黃芪、大青葉、連翹、五倍子12種常見中草藥，對(duì)柱狀黃桿菌進(jìn)行了體外抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示氟苯尼考、黃芩和五倍子抑菌效果較好；利用西藥與中藥聯(lián)用試驗(yàn)，顯示氟苯尼考和黃芩聯(lián)用后，具有協(xié)同作用，而氟苯尼考和五倍子聯(lián)用不具有協(xié)同作用，為防治魚類柱狀病提供理論基礎(chǔ)。氟苯尼考和黃芩價(jià)格相對(duì)便宜，可以在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

［1］李楠， 郭慧芝， 焦冉，等. 草魚的一種急性細(xì)菌性傳染病病原的分離鑒定及致病性研究［J］. 水生生物學(xué)報(bào)， 2011. 35（06） ：980-987.

［2］楊玲， 安麗， 付佩勝. 四種鯉魚對(duì)柱形病抗病能力的差異［J］. 河北漁業(yè)， 2015（10）： 18-21.

［3］謝宗升， 童桂香， 廖榮秋，等. 斑點(diǎn)叉尾鮰柱形病病原的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 40（13）： 123-126.

［4］史謝堯，賈文平，郝爽等. 銀龍魚爛鰓病病原的分離和鑒定［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 046（015）：75-78.

［5］Zhenguo Zhang， Shuang Hao ， Xiaohui Bai et al. Prolonged low-salt immersion effectively controls Flavobacterium columnare infection in Murray cod? Maccullochella peelii peelii［J］.Dis Aquat Org，2022，150：53–60.

［6］昌莉麗，李華坤，劉桂蘭． 中西藥聯(lián)用對(duì)禽源大腸桿菌的體外抑菌效果研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（ 16） ： 5037-5038.

［7］文英． 中西藥對(duì)大腸埃希菌的體外聯(lián)合抑菌作用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（ 03 ）：145-146.

［8］王洪彬，朱利霞，張志強(qiáng)等 中西藥聯(lián)用對(duì)嗜水氣單胞菌體外抑菌作用研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018，（16） ：177-179.

［9］張生元，艾桃山，喻運(yùn)珍等.鱖源柱狀黃桿菌的分離鑒定及其對(duì)10種中草藥的敏感性研究［J］.水產(chǎn)科技情報(bào). 2019，46（06）： 338-341.

［10］張遼， 姚池蓓， 袁夢(mèng)瑩，等. 五倍子預(yù)防草魚細(xì)菌性爛鰓病效果的研究［J］. 畜牧與飼料科學(xué)， 2020， 41（6）： 90-93.

［11］劉麗娟， 王亞軍， 石存斌，等. 水產(chǎn)常見消毒劑對(duì)魚源柱狀黃桿菌的抑菌和殺菌效果研究［J］.科學(xué)養(yǎng)魚， 2021（11）： 47-49.

［12］張玉蕾， 趙麗娟， 周偉東，等. 黃顙魚源柱狀黃桿菌的分離鑒定及其對(duì)翹嘴鱖的致病性［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 35（2）：7.