針刺調(diào)控腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)circRNAs表達的研究

李展富 江姍姍 唐紅 汪紅娟 田浩梅

〔摘要〕 目的 探討針刺調(diào)控腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)circRNAs的表達，為針灸臨床治療腦缺血提供一定的實驗理論依據(jù)。方法 24只健康成年雄性SD大鼠隨機分為針刺組、模型組、假手術(shù)組，每組8只。使用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞再灌注模型（middle cerebral artery occlusion/reper-fusion， MCAO/R），針刺組大鼠捆綁后，選取大椎、百會、人中穴進行針刺處理，每隔15 min行針1次，留針30 min，每間隔12 h進行1次，連續(xù)進行7次；模型組、假手術(shù)組只捆綁，不做其余處理。干預(yù)前及干預(yù)72 h后，行Garcia神經(jīng)功能評分；干預(yù)72 h后，行腦TTC染色觀察腦梗死面積比，采用circRNAs基因芯片檢測缺血側(cè)海馬區(qū)circRNAs表達譜。結(jié)果 （1）干預(yù)前：與假手術(shù)組比較，針刺組、模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著下降（P＜0.01）。干預(yù)后：與假手術(shù)組比較，針刺組、模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著下降、腦梗死面積比增加（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高、腦梗死面積比減少（P＜0.05）。（2）circRNA芯片分析：模型組與假手術(shù)組比較，共有603個差異基因，其中下調(diào)circRNAs 315個、上調(diào)circRNAs 288個；針刺組與模型組比較，共有51個差異基因，其中下調(diào)circRNAs 18個、上調(diào)circRNAs 33個；共同調(diào)控的circRNAs有23個。模型組與假手術(shù)組比較，差異表達circRNAs功用表現(xiàn)為神經(jīng)元間突觸、細胞形態(tài)改變等方面的改變，通路主要歸屬于ErbB信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路等；針刺組與模型組比較，差異表達circRNAs 功用表現(xiàn)為神經(jīng)營養(yǎng)素結(jié)合、H3組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、逆行軸突運輸?shù)确矫娴母淖儯分饕獨w屬于MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、Hippo信號通路等。共同調(diào)控功用有神經(jīng)元投射、蛋白質(zhì)結(jié)合、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等，共同調(diào)控的信號通路有MAPK信號通路。結(jié)論 針刺大椎、百會、人中穴能改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損評分，減少腦梗死面積比，其機制可能與調(diào)控多個circRNAs表達、激活多種功用和多條信號通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 針刺；腦缺血再灌注損傷；circRNAs；大椎；百會；人中

〔中圖分類號〕R245 ? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.021

Effects of acupuncture on circRNAs expression in hippocampus of rats with

cerebral ischemia-reperfusion injury

LI Zhanfu， JIANG Shanshan， TANG Hong， WANG Hongjuan， TIAN Haomei*

College of Acupuncture & Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the regulation of acupuncture on the expression of circRNAs in the ischemic hippocampus of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury， so as to provide experimental theoretical basis for the treatment of cerebral ischemia with acupuncture. Methods Twenty four healthy adult male SD rats were randomized into acupuncture group， model group and sham-operated group， with 8 rats in each group. The middle cerebral artery occlusion/reperfusion （MCAO/R） model of rats was established by thread embolism. After the rats in the acupuncture group were bound， the points of Dazhui （GV14）， Baihui （GV20） and Renzhong （GV26） were selected for acupuncture. The needles were manipulated every 15 min and were retained for 30 min. The treatment was performed every 12 h， 7 times in a row. The model group and the sham-operated group were only bound without any treatment. The neurological function was assessed by Garcia score before and 72 h after intervention. At 72 h after intervention， the area ratio of cerebral infarction was observed by TTC staining， and the expression profile of circRNAs in the ischemic hippocampus was detected by circRNAs gene chip. Results （1） Before intervention： Compared with the sham-operated group， the score of neurological function impairment in the acupuncture group and the model group dropped significantly （P<0.01）. After intervention： Compared with sham-operated group， the score of neurological function impairment in the acupuncture group and the model group decreased significantly， whereas the area ratio of cerebral infarction increased （P<0.01）. Compared with the model group， the score of neurological function impairment in the acupuncture group went up while the area ratio of cerebral infarction went down （P<0.05）. （2） CircRNA chip analysis： Compared with the sham-operated group， there were 603 differential genes in the model group， including 315 down-regulated circRNAs and 288 up-regulated circRNAs. Compared with the model group， there were 51 differential genes in the acupuncture group， including 18 down-regulated circRNAs and 33 up-regulated circRNAs. There were 23 circRNAs under co-regulation. Compared with the sham-operated group， the function of the differentially expressed circRNAs showed changes in synapses between neurons and cell morphology， which were mainly attributed to ErbB signaling pathway， MAPK signaling pathway， cAMP signaling pathway， etc. Compared with the model group， the function of the differentially expressed circRNAs in the acupuncture group showed changes in neurotrophin binding， H3 histone acetyltransferase complex， and retrograde axonal transport， which were mainly involved in MAPK signaling pathway， neurotrophin signaling pathway， Hippo signaling pathway， etc. The functions of co-regulation include neuron projection， protein binding， nervous system development， etc. The signaling pathway of co-regulation includes MAPK signaling pathway. Conclusion Acupuncture at Dazhui （GV14）， Baihui （GV20） and Renzhong （GV26） can improve the score of neurological function impairment and reduce the area ratio of cerebral infarction in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. The mechanism may be related to regulating the expression of multiple circRNAs， activating multiple functions and multiple signaling pathways.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 acupuncture; cerebral ischemia-reperfusion injury; circRNAs; Dazhui （GV14）; Baihui （GV20）; Renzhong （GV26）

腦卒中是臨床最常見的腦血管疾病之一[1]，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率等特點[2]。在我國，缺血性腦卒中占比高達70%左右[3]。目前，在時間窗內(nèi)使用藥物進行靜脈溶栓，重新恢復(fù)大腦血流循環(huán)，是臨床上治療缺血性腦卒中的有效手段[4]。但血液的再灌注，可導(dǎo)致大腦發(fā)生更嚴(yán)重的病理損害，此即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI）[5]。

有研究表明，環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）在哺乳動物的腦中高度富集，且在神經(jīng)元分化、神經(jīng)細胞修復(fù)、腦血管內(nèi)皮細胞損傷等過程中扮演重要角色，有望成為CIRI研究與治療的重要方向[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，在慢性低灌注腦缺血大鼠模型中共檢測出4109個circRNAs，其中包括1個上調(diào)及18個下調(diào)的circRNAs，表明circRNAs在低氧低灌注腦缺血大鼠模型中發(fā)揮了一定作用[7]；還有研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs通過激活相關(guān)信號通路對CIRI產(chǎn)生作用，可見CIRI損傷是一個多種circRNAs參與的過程[8]。circRNAs基因芯片技術(shù)具有高通量、快速、低誤差、用途廣泛等特點，是一項廣泛應(yīng)用于基因組功能研究的技術(shù)，可以全面、整體地反映CIRI后circRNAs整體變化情況。

近年來，針灸對CIRI的治療也逐漸被肯定，在改善腦血液循環(huán)[9]、抗細胞凋亡[10]、減輕炎癥反應(yīng)[11]、清除自由基[12]等方面，均有深入研究。針刺能否通過調(diào)控circRNAs來影響CIRI的研究報道尚不多。課題組前期研究證明，針刺治療與依達拉奉對CIRI大鼠效應(yīng)相當(dāng)，均能明顯降低神經(jīng)功能缺損評分，減少腦梗死面積[13]。本研究以針刺調(diào)控circRNA抗CIRI為著眼點，探討針刺調(diào)控CIRI相關(guān)的circRNAs的表達及其功用、通路，為CIRI的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量200～230 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2020-0004。正常飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房，自由攝食飲水，溫度22～26 ℃，濕度40%～60%。本實驗所有動物實驗均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗倫理委員會批準(zhǔn)（編號：LL2022030912）。

1.2 ?動物分組

24只實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用隨機數(shù)字表法分為針刺組（8只）、模型組（8只）、假手術(shù)組（8只）。課題組預(yù)實驗死亡率約為25%，造模后，如果動物死亡導(dǎo)致大鼠數(shù)量不足，則補齊對應(yīng)的實驗大鼠。

1.3 ?主要試劑及儀器

2，3，5-苯氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride， TTC） 溶液（美國Sigma公司，批號：G3004）；4%多聚甲醛溶液（中國醫(yī)藥集團有限公司，貨號：10010061）；circRNA芯片標(biāo)記試劑盒（美國Arraystar公司，貨號：Human circRNA Arry V2）；規(guī)格8×15 K circRNAs芯片（美國Arraystar公司，批號：R312-01）；0.32±0.2 mm MCAO線栓（北京西濃科技有限公司，貨號：2432-100）；0.25 mm×13 mm無菌毫針（蘇州天一針器械有限公司，批號：210501）；安捷倫G2505C掃描儀（美國Agilent公司，型號：G250-5C）；立體定位儀（成都泰盟科技有限公司，型號：DW-5）水浴箱（常州金壇恒豐儀器制造有限公司，型號：HH-W600）。

1.4 ?模型制備及評定標(biāo)準(zhǔn)

采用線栓法[14]并改良[15]大鼠大腦中動脈栓塞模型（middle cerebral artery occlusion/reper-fusion， MCAO/R）。造模前24 h停止喂食，僅喂水。造模大鼠腹腔注射麻醉劑，待麻醉后，在頸部備皮、消毒，沿頸正中作一條約10 mm縱行切口，分離出頸總動脈（common carotid artery， CCA）、頸內(nèi)動脈（inner carotid aretry， ICA）和頸外動脈（extra carotid aretry， ECA），在近心端處結(jié)扎CCA和ECA，沿CCA結(jié)扎處上方剪一小口，從切口處緩緩插入并微有阻力時停止（線栓黑色標(biāo)記約在分叉口處），永久性結(jié)扎右側(cè)ICA，青霉素消毒后縫合，且標(biāo)記線栓。于缺血后2 h，取出栓線約10 mm[16]，從而制備出CIRI模型。假手術(shù)組僅分離血管，青霉素消毒后縫合。待大鼠生命體征平穩(wěn)后采用Zea Longa評分法評定[17]，1～3分者入選實驗。

1.5 ?干預(yù)方法

大鼠生命體征穩(wěn)定后（約再灌注后2 h），進行各組干預(yù)。針刺組選取大椎、百會、人中穴（穴位取穴參考《實驗動物圖譜》[18]《實驗針灸學(xué)》[19]）。每隔15 min行針1次，留針30 min，每間隔12 h進行1次，連續(xù)進行7次。模型組和假手術(shù)組不針刺，僅捆綁30 min，每隔12 h進行1次，連續(xù)進行7次。

1.6 ?指標(biāo)檢測及方法

1.6.1 ?神經(jīng)功能缺損評分 采用Garcia評分法[20]分別在治療前和治療72 h后對各組進行評分，評分內(nèi)容包括：自主運動、體態(tài)對稱性、前肢伸展運動、抓持和攀爬能力、兩側(cè)身體觸覺反射、兩側(cè)胡須觸碰反應(yīng)?？偡?8分，得分越低，表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.6.2 ?腦梗死面積比 ?干預(yù)72 h后，大鼠經(jīng)麻醉，迅速斷頭后取腦，放入低溫冰箱冷凍20 min，去除嗅球、小腦和低位腦干，沿冠狀位連續(xù)切成等分5片，每片厚度約2 mm，放置于2% TTC溶液燒杯中，并放入37 ℃恒溫水浴箱中充分反應(yīng)10～15 min，注意避光，每隔5 min翻轉(zhuǎn)1次腦切片以便充分反應(yīng)。染色結(jié)束后，將腦切片放入4%多聚甲醛溶液固定24 h，用數(shù)碼相機拍攝完整清晰圖案并上傳電腦，使用圖像分析軟件Image-Pro Plus（6.0版本）測定腦梗死面積百分比（IS），計算公式參考Swanson法[21]，即IS=（S1-Sr）/2S1×100%（S1：健側(cè)總面積，Sr：患側(cè)非梗死區(qū)面積）。

1.6.3 ?circRNAs基因芯片檢測 ?干預(yù)72 h后，大鼠經(jīng)麻醉，迅速斷頭取腦，然后于冰袋上分離出患側(cè)海馬組織，用ND-1000納米滴定法對每個樣本的總RNA數(shù)進行定量，RNA的完整性則通過變性瓊脂糖凝膠上電泳評估、樣本標(biāo)記和陣列雜交，制備成circRNAs基因表達芯片，最后使用掃描儀掃描圖像并分析數(shù)據(jù)。

1.6.4 ?差異基因分析方法 ?使用Agilent Feature Exteaction軟件對獲得的陣列圖像進行分析。使用R軟件limma軟件包進行分位數(shù)歸一化等數(shù)據(jù)處理，以P<0.05和|log2 FC|≥1.25為標(biāo)準(zhǔn)。通過火山圖篩選，確定兩組間差異表達有統(tǒng)計學(xué)意義的circRNAs；通過折疊變化篩選來識別兩個樣本之間差異表達的circRNAs；采用層次聚類的方法顯示樣本間可區(qū)分的circRNAs表達模式。

1.6.5 ?統(tǒng)計學(xué)方法 ?采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)性檢驗的計量資料用“ｘ±s”表示，若方差齊者采用單因素方差分析；不滿足正態(tài)性則采用非參數(shù)檢驗。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

干預(yù)前：與假手術(shù)組比，針刺組、模型組神經(jīng)功能缺損評分下降（P＜0.01）；針刺組、模型組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后：與假手術(shù)組比，針刺組、模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分下降（P＜0.01）；與模型組比，針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評分上升（P＜0.05）。組內(nèi)比較：假手術(shù)組、模型組大鼠干預(yù)前后神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；針刺組大鼠干預(yù)后較干預(yù)前神經(jīng)功能缺損評分上升（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2 ?各組大鼠腦梗死面積比較

假手術(shù)組未觀察到缺血梗死灶。與假手術(shù)組對比，針刺組、模型組均觀察到大小不等的缺血梗死灶（P＜0.01）；與模型組對比，針刺組的缺血梗死灶面積比明顯減少（P＜0.05）。詳見圖2—3。

2.3 ?各組大鼠缺血側(cè)組織circRNAs差異表達

模型組與假手術(shù)組比較，共有603個差異基因，其中下調(diào)circRNAs 315個、上調(diào)circRNAs 288個；針刺組與模型組比較，共有51個差異基因，其中下調(diào)circRNAs 18個、上調(diào)circRNAs 33個。共同調(diào)控的circRNAs有23個。詳見圖4—6。

2.4 ?各組大鼠缺血側(cè)海馬組織差異表達circRNAs功用分析

根據(jù)差異表達circRNAs的分子功能（molecular function， MF）、細胞成分（cellular component， CC）、生物過程（biological process， BP）這3種GO_Function上的差異基因的富集情況，繪制出GO富集分析結(jié)果的柱狀圖，詳見圖7。依據(jù)注釋到這3種功用層面上的富集倍數(shù)（Fold Enrichment），對Top10的GO_Term由低到高進行排列?？v軸上的Fold Enrichment代表實際富集概率/隨機富集概率，F(xiàn)old Enrichment越大，代表GO的富集程度越高。橫軸是GO_Term，是對GO途徑的注釋。

由圖7可知，模型組與假手術(shù)組差異表達circRNAs在MF層面主要富集于細胞黏附分子結(jié)合、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、小GTPase結(jié)合、激酶活性等；在CC層面主要富集于突觸前膜、谷氨酸能突觸、神經(jīng)元間突觸、突觸后致密蛋白等；在BP層面主要富集于突觸組織、細胞連接組織、細胞形態(tài)改變、囊泡運輸?shù)?。由圖8可知，針刺組與假手術(shù)組差異表達circRNAs在MF層面主要富集于微管末端結(jié)合、突觸后特化結(jié)構(gòu)、神經(jīng)營養(yǎng)素結(jié)合、wnt活化受體等；在CC層面主要富集于微管末端結(jié)合、微管末端、H3組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、細胞器膜接觸位點等；在BP層面主要富集于逆行軸突運輸、微管解聚、視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)生、甾醇轉(zhuǎn)運等。共同調(diào)控的GO分析在MF層面主要富集于蛋白結(jié)合、蛋白特異結(jié)合、激酶結(jié)合；在CC層面主要富集于細胞連接、神經(jīng)元投射、神經(jīng)元間突觸等；在BP層面主要富集于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

2.5 ?各組大鼠缺血側(cè)海馬組織差異表達circRNAs信號通路分析

模型組與假手術(shù)組比較：上調(diào)的差異表達circRNAs主要富集于軸突導(dǎo)向信號通路、ErbB信號通路、磷脂酶D信號通路、MAPK信號通路等；下調(diào)的差異表達circRNAs主要富集于cAMP信號通路、ErbB信號通路、B細胞受體信號通路等。針刺組與模型組比較：上調(diào)的差異表達circRNAs主要富集于神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、Hippo信號通路等；下調(diào)的差異表達circRNAs主要富集于MAPK信號通路；共同調(diào)控的信號通路為MAPK信號通路。詳見圖8。

3 討論

缺血性腦卒中血流循環(huán)恢復(fù)后導(dǎo)致的CIRI屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。現(xiàn)代研究表明，針灸對于“中風(fēng)”患者，可以調(diào)節(jié)其腦血循環(huán)，降低炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)功能缺損癥狀[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺大椎、百會、人中穴，可有效改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，改善細胞超微結(jié)構(gòu)，改善缺血腦血流量，從而減少腦梗死面積，恢復(fù)神經(jīng)功能[15，22-24]。大椎、百會、人中穴均屬督脈，督脈絡(luò)于腦，《靈樞·邪氣臟腑病形》曰：“病變在腦，首取督脈”，當(dāng)“腦脈閉阻”引起“腦髓損傷”時，多取督脈穴[25]。大椎穴為“三陽督脈之會”，為全身交會經(jīng)脈最多的一個交會穴；百會穴位于頭部巔頂，又稱三陽五會，為百脈聚會處；人中穴為督脈和手足陽明經(jīng)的交會穴，為一身陽脈之綱領(lǐng)，督任二脈氣血相通。故針刺大椎、百會、人中穴可有效改善CIRI而起到腦保護作用。

circRNAs在人類大腦中高度豐富，與CIRI關(guān)系密切[26]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs不僅在大腦神經(jīng)元分化過程中表現(xiàn)上調(diào)，還參與了腦微血管內(nèi)皮細胞損傷過程，同時，還通過其他信號通路參與了細胞凋亡過程[27]。如WU等[28]研究發(fā)現(xiàn)，局灶性CIRI小鼠的腦內(nèi)，circTLK1水平顯著上升，參與誘導(dǎo)ADP核糖聚合酶途徑加重了CIRI，敲除了circTLK1后，神經(jīng)功能缺損則顯著減少。LIU等[29]也在大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的氧糖剝奪/富氧模型中，成功驗證了8個差異表達最明顯的circRNAs。circRNAs在CIRI過程參與范圍廣、程度深，但針灸對與circRNAs的研究還處于初始階段，有部分研究者已經(jīng)關(guān)注到針刺對一些疾病circRNAs的調(diào)控作用，如：針灸在治療不孕過程中調(diào)控相關(guān)circRNAs的表達[30]；針灸在抑制嗎啡成癮過程中，調(diào)控相關(guān)circRNAs以發(fā)揮針灸機制效應(yīng)等[31]。

circRNAs芯片技術(shù)具有高通量、快速、低誤差、用途廣泛等特點，主要應(yīng)用于疾病分子生物學(xué)、實驗檢測等。組織芯片可以用來在蛋白水平檢測相應(yīng)標(biāo)靶，RNA芯片則可以在RNA水平篩選相應(yīng)的標(biāo)靶，并且可以與臨床信息相結(jié)合，從而實現(xiàn)基因及其表達產(chǎn)物水平與預(yù)后相結(jié)合的目的，因此，基因芯片技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疾病的病理機制研究中[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，基因芯片技術(shù)分析能夠提示多種circRNAs的表達變化與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其利用高通量的基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析從食管鱗癌與附近組織間篩選了大量差異表達的circRNAs[33]。

本研究大鼠造模后，出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，TTC染色也證明了大鼠MCAO/R模型造模成功。干預(yù)過程中，針刺組能減輕大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，減少腦梗死面積，說明針刺有效。假手術(shù)組與模型組對比，共有603個差異表達circRNAs，其中有下調(diào)circRNAs 288個、上調(diào)circRNAs 315個；針刺組與模型組對比，共有315個差異表達circRNAs，其中有下調(diào)circRNAs 33個、上調(diào)circRNAs 18個；共同調(diào)控的circRNAs有23個。上述結(jié)果提示，針刺、大椎、百會、人中穴能調(diào)控腦缺血再灌注損傷后多種circRNAs表達。

對本實驗差異表達circRNAs功用分析發(fā)現(xiàn)，大鼠造模成功后，與假手術(shù)組比較，差異表達circRNAs主要功用富集于神經(jīng)元投射、小GTPase結(jié)合、激酶活性、突觸前膜、神經(jīng)元間突觸、突觸后致密蛋白、突觸組織、細胞連接組織等。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦損傷疾病中，新生神經(jīng)元可以分化成熟并與原有神經(jīng)建立新的突觸聯(lián)系，新生的神經(jīng)元能夠形成長投射到皮質(zhì)及紋狀體[34]。在對MCAO/R大鼠進行針刺干預(yù)后，與未進行干預(yù)的模型組比較，差異表達circRNAs的主要功用發(fā)生了改變，主要富集于神經(jīng)元投射、微管末端結(jié)合、突觸后特化結(jié)構(gòu)、神經(jīng)營養(yǎng)素結(jié)合、逆行軸突運輸?shù)?。在相關(guān)研究中，進行針刺干預(yù)后，在慢性缺血缺氧性腦損傷中，腦缺血誘導(dǎo)的新生神經(jīng)元可以長時間存活并投射到相關(guān)區(qū)域，促進神經(jīng)元的發(fā)育，減輕腦缺血引起的腦損傷[35]。由此可見，在大鼠腦缺血損傷過程中，大腦神經(jīng)元投射功能被抑制，在針刺干預(yù)MCAO/R大鼠后，調(diào)控了相關(guān)circRNAs，促進了神經(jīng)元投射的發(fā)生。由此說明，針刺確實可以通過調(diào)控相關(guān)circRNAs的功用，逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致病變的功用，以達到緩解腦缺血損傷的功能。除神經(jīng)元投射外，共同調(diào)控的差異表達circRNAs功用分析還包括蛋白結(jié)合、蛋白特異結(jié)合、激酶結(jié)合、細胞連接、神經(jīng)元間突觸、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等。

對本實驗中差異表達circRNAs進行信號通路分析后發(fā)現(xiàn)，大鼠造模成功后，與假手術(shù)組比較，差異表達基因主要富集于絲裂原活性蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號通路、軸突導(dǎo)向信號通路、ErbB信號通路、磷脂酶D信號通路、cAMP信號通路、ErbB信號通路、B細胞受體信號通路等。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在CIRI小鼠造模成功后，大腦缺血側(cè)海馬區(qū)MAPK陽性細胞明顯增多，MAPK信號通路被激活[36]。針刺干預(yù)MCAO/R大鼠后，與模型組比較，差異表達基因則主要富集在MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、Hippo信號通路。共同調(diào)控的信號通路只有MAPK信號通路。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，MAPK可通過NF-κB通路來調(diào)節(jié)炎性因子的表達，從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與腦卒中的形成[37]。通過抑制MAPK信號通路能夠有效抑制炎性反應(yīng)，減少神經(jīng)細胞凋亡，從而減輕缺血性腦卒中引起的神經(jīng)損傷。由此可見，MAPK信號通路不僅參與了缺血性腦損傷的形成，在針刺干預(yù)過程中也參與了腦損傷的修復(fù)過程，說明針刺干預(yù)可有效逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致病變的信號通路，抑制病變信號通路過程，從而緩解腦損傷。

由此可知，針刺大椎、百會、人中穴確實可以改善CIRI，其有多種circRNAs參與，且參與多種功用和多條信號通路的激活。后續(xù)可繼續(xù)采用RNA-seq技術(shù)，進一步驗證涉及的circRNAs以及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路。

參考文獻

[1] CAMPBELL B C V， DESILVA D A， MACLEOD M R， et al. Ischaemic stroke[J]. Nature Reviews Disease Primers， 2019， 5（1）： 70.

[2] 孫海欣，王文志.中國60萬人群腦血管病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2018，18（2）：83-88.

[3] 于洗河，高 ?尚，賈歡歡，等.1999年、2009年、2019年我國與全球腦卒中疾病負擔(dān)研究[J].中國衛(wèi)生經(jīng)濟，2021，40（6）： 58-61.

[4] SCHREGEL K， BEHME D， TSOGKAS I， et al. Optimized management of endovascular treatment for acute ischemic stroke[J]. Journal of Visualized Experiments， 2018（131）： 56397.

[5] SHEN L A， GAN Q Y， YANG Y C， et al. Mitophagy in cerebral ischemia and ischemia/reperfusion injury[J]. Frontiers in Aging Neuroscience， 2021， 13： 687246.

[6] 黃 ?超，陳懷龍，王明山.環(huán)狀RNA在缺血/再灌注損傷中的作用研究進展[J].國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2022，43（1）：109-112.

[7] LI W X， WEI D， LIANG J Y， et al. Comprehensive evaluation of white matter damage and neuron death and whole-transcriptome analysis of rats with chronic cerebral hypoperfusion[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience， 2019， 13： 310.

[8] ZHANG Z H， WANG Y R， LI F， et al. Circ-camk4 involved in cerebral ischemia/reperfusion induced neuronal injury[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 7012.

[9] 李凌燕，劉洪軍，李金霞，等.針推結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療急性缺血性腦卒中臨床觀察[J].湖北中醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2020，22（5）：81-83.

[10] 鄭婉群，曹 ?奕，王玉影，等.針灸通督法對缺血性腦卒中患者Caspase-3、Caspase-9水平影響的臨床研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，38（9）：1106-1110.

[11] 鄧 ?容.電針任督脈對腦缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)的影響[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[12] 舒兆瑞.針刺對急性缺血性腦卒中患者血漿自由基水平的影響[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[13] 武姿含，蔣素容，陳芯儀，等.針刺大椎、百會、人中穴對大鼠腦缺血再灌注損傷后ES蛋白表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2019， 39（4）： 507-510.

[14] LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSON S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989， 20（1）： 84-91.

[15] 盧小葉，何灝龍，呂倩憶，等.針刺介導(dǎo)miR-34c-5p調(diào)控腦缺血再灌注損傷大鼠海馬神經(jīng)細胞自噬的研究[J].針刺研究，2022，47（5）：415-421.

[16] XU X J， LONG J B， JIN K Y， et al. Danshen-Chuanxiongqin Injection attenuates cerebral ischemic stroke by inhibiting neuroinflammation via the TLR2/TLR4-MyD88-NF-κB Pathway in tMCAO mice[J]. Chinese Journal of Natural Medicines， 2021， 19（10）： 772-783.

[17] PHANIENDRA A， JESTADI D B， PERIYASAMY L. Free radicals： Properties， sources， targets， and their implication in various diseases[J]. Indian Journal of Clinical Biochemistry， 2015， 30（1）： 11-26.

[18] 華興邦，周浩良.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗，1991（1）：1-5.

[19] 李忠仁，郭 ?義.實驗針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：314.

[20] 喬 ?琳，胡 ?彬，常明則，等.兩種神經(jīng)功能評分評價大鼠局灶性腦缺血模型的初步研究[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，43（12）：893-895.

[21] SWANSON R A， MORTON M T， TSAO-WU G， et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume[J]. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism， 1990， 10（2）： 290-293.

[22] 賀 ?平，顏 ?虹，蔣素容，等.針刺大椎、人中、百會穴對腦缺血再灌注損傷大鼠腦線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，38（1）：55-58.

[23] 何灝龍，鄭慧娥，高音來，等.針刺調(diào)控腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側(cè)海馬差異miRNA信號歸屬通路及mir-34c-3p表達的研究[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2020，35（11）：1290-1295.

[24] 鄭慧娥，何灝龍，陳芯儀，等.針刺對CIRI大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)miRNA表達及miR-20a-5p和miR-22-5p的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，40（10）：1226-1231.

[25] 黃瀏姣，陳邦國，洪亞群.電針對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能及腦組織微血管密度影響的研究[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，15（1）：9-11.

[26] RYBAK-WOLF A， STOTTMEISTER C， GLA■AR P， et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant， conserved， and dynamically expressed[J]. Molecular Cell， 2015， 58（5）： 870-885.

[27] HAN B， ZHANG Y， ZHANG Y H， et al. Novel insight into circular RNA HECTD1 in astrocyte activation via autophagy by targeting MIR142-TIPARP： Implications for cerebral ischemic stroke[J]. Autophagy， 2018， 14（7）： 1164-1184.

[28] WU F F， HAN B， WU S S， et al. Circular RNA TLK1 aggravates neuronal injury and neurological deficits after ischemic stroke via miR-335-3p/TIPARP[J]. The Journal of Neuroscience， 2019， 39（37）： 7369-7393.

[29] LIU W， JIA C， LUO L， et al. Novel circular RNAs expressed in brain microvascular endothelial cells after oxygen-glucose deprivation/recovery[J]. Neural Regeneration Research， 2019， 14（12）： 2104-2111.

[30] SHEN J， CHEN L， CHENG J， et al. Circular RNA sequencing reveals the molecular mechanism of the effects of acupuncture and moxibustion on endometrial receptivity in patients undergoing infertility treatment[J]. Molecular Medicine Reports， 2019， 20（2）： 1959-1965.

[31] ZHANG H， WANG Q， WANG Q S， et al. Circular RNA expression profiling in the nucleus accumbens： Effects of electroacupuncture treatment on morphine-induced conditioned place preference[J]. Addiction Biology， 2020， 25（4）： e12794.

[32] OHUCHIDA K， MIZUMOTO K， ISHIKAWA N， et al. The role of S100A6 in pancreatic cancer development and its clinical implication as a diagnostic marker and therapeutic target[J]. Clinical Cancer Research， 2005， 11（21）： 7785-7793.

[33] 陳 ?昊.基因芯片分析提示多種環(huán)狀RNA的表達變化與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2017.

[34] 張秋婉.腦卒中大鼠紋狀體及皮層投射神經(jīng)元新生及分子機制研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2013.

[35] 林 ?瑤.艾灸對快速老化小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[36] 馮毅慧.電針對JNK基因敲除小鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡與MAPK信號通路影響的實驗研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[37] 張富慧，郝靜峰，張自艷，等.菊苣酸調(diào)控p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元凋亡及炎癥反應(yīng)的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2022，39（8）：694-698.

〔收稿日期〕2022-07-18

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金項目（81874508）；國家自然科學(xué)基金項目（82274662）；長沙市科技局自然科學(xué)基金項目（kq2014094）；湖南省自然科學(xué)基金項目（2021JJ30490）。

〔第一作者〕李展富，男，碩士研究生，研究方向：針灸推拿臨床應(yīng)用及機制研究。

〔通信作者〕*田浩梅，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：451358104@qq.com。