補(bǔ)腎活血湯對大鼠腰椎間盤退行性變模型Fas/FasL信號通路的影響

王鎮(zhèn)遠(yuǎn) 馮帥華 李澤湘 羅陽騫 李明洋 蔣佳豪 吳官保

〔摘要〕 目的 探索補(bǔ)腎活血湯對大鼠腰椎間盤退行性變模型脂肪酸合成酶（fatty acid synthase， Fas）/脂肪酸合成酶配體（fatty acid synthase ligand， FasL）信號通路的影響。方法 50只大鼠隨機(jī)分成空白組、假手術(shù)組、補(bǔ)腎活血湯組、腰痹通組、模型組，每組10只。空白組、假手術(shù)組、模型組每日10 mL/kg生理鹽水灌胃；補(bǔ)腎活血湯組每日28.98 g/kg補(bǔ)腎活血湯灌胃；腰痹通組每日0.34 g/kg腰痹通灌胃，各組均干預(yù)4周。干預(yù)結(jié)束后，取腰椎間盤組織，番紅固綠、Masson染色觀察病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法計(jì)算積分光密度（integral optical density， IOD）值，Western bolt檢測Fas、FasL蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測Fas、FasL mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 空白組、假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)基本正常，細(xì)胞核清晰可見；模型組纖維環(huán)碎裂明顯，纖維環(huán)與髓核間中斷，結(jié)構(gòu)不清晰，且染色較深；補(bǔ)腎活血湯組纖維環(huán)輕度破裂，髓核細(xì)胞及空泡數(shù)量略有減少，髓核中基質(zhì)輕度凝結(jié)。與空白組比較，模型組Fas、FasL IOD值均明顯升高（P<0.01），F(xiàn)as、FasL蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P<0.01）。假手術(shù)組與空白組間Fas、FasL IOD值、蛋白和mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎活血湯組、腰痹通組Fas、FasL IOD值均明顯降低（P<0.01），F(xiàn)as、FasL蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P<0.01）。與腰痹通組比較，補(bǔ)腎活血湯組Fas、FasL IOD值均明顯降低（P<0.01），F(xiàn)as、FasL蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P<0.01）。結(jié)論 補(bǔ)腎活血湯能夠有效治療因腰椎退行性變對髓核及纖維環(huán)造成的損傷，促進(jìn)相關(guān)蛋白的表達(dá)，可能與其調(diào)控Fas/FasL信號通路相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)腎活血湯；腰椎退行性變；Fas/FasL信號通路；大鼠；椎間盤；腰痛

〔中圖分類號〕R274.9 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.010

Effects of Bushen Huoxue Decoction on Fas/FasL signaling pathway of

lumbar intervertebral disc degeneration rat model

WANG Zhenyuan1， FENG Shuaihua2， LI Zexiang1， LUO Yangqian1， LI Mingyang1， JIANG Jiahao1， WU Guanbao2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Hospital of Integrated

Chinese and Western Medicine， Changsha， Hunan 410006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the effects of Bushen Huoxue Decoction （BSHXD） on Fas/FasL signaling pathway of lumbar intervertebral disc degeneration rat model. Methods Fifty rats were randomized into blank group， sham-operated group， BSHXD group， Yaobitong group and model group， with 10 rats in each group. Blank group， sham-operated group and model group were given 10 mL/kg saline by gavage daily; BSHXD group received 28.98 g/kg BSHXD daily by gavage; Yaobitong group was administered with 0.34 g/kg Yaobitong capsule daily by gavage， all groups were intervened for 4 weeks. At the end of the intervention， safranine fast green and Masson staining were used to observe the pathological changes of the lumbar disc tissues， the integral optical density （IOD） values were calculated by immunohistochemistry， Fas and FasL protein expression levels were detected by Western blot and Fas and FasL mRNA expression levels were identified by RT-PCR. Results The cell morphology of specimens in blank and sham-operated groups was normal， and the nuclei were clearly visible; the fibrous rings of model group were obviously fragmented， with interruptions between fibrous rings and nuclei， the structures were not clear， and the staining was quite dark; BSHXD group showed mild rupture of the fibrous rings， a slight decrease in the number of nucleus cells and vacuoles， and mild condensation of the matrix in the nuclei. Compared with blank group， Fas and FasL IOD values were significantly higher （P<0.01） and Fas， FasL protein and mRNA were significantly lower （P<0.01） in model group. The differences in Fas， FasL IOD values， protein and mRNA expression levels between sham-operated group and blank group were not statistically significant （P>0.05）. Compared with model group， Fas and FasL IOD values were significantly lower （P<0.01）， Fas， Fasl protein and mRNA expression levels were significantly higher （P<0.05）. Compared with Yaobitong group， Fas and FasL IOD values were significantly lower （P<0.01）， and the expression levels of Fas， FasL proteins and mRNA were significantly higher （P<0.01） in BSHXD group. Conclusion BSHXD can ?treat the damage to the nucleus pulposus and the fibrous ring caused by degenerative lesions of the lumbar spine， and promote the expression of related proteins. It ?may be related to the regulation of the Fas/FasL signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Bushen Huoxue Decoction; lumbar degenerative lesion; Fas/FasL signaling pathway; rat; intervertebral disc; lumbago

腰痛是脊柱疾患中常見的一類癥狀，嚴(yán)重影響患者生活，也是全球致殘的主要慢性疾病之一[1]。腰椎間盤退行性變是臨床中導(dǎo)致下腰痛的主要原因之一[2]。隨著疾病的進(jìn)展，將會導(dǎo)致椎間盤老化、骨化、椎管狹窄等問題，最后會引起腰椎不同程度失穩(wěn)和功能下降[3]。

研究表明，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase， Fas）與脂肪酸合成酶配體（fatty acid synthase ligand， FasL）的交聯(lián)通過復(fù)雜的信號通路，可引起細(xì)胞凋亡[4]。椎間盤有免疫特權(quán)，其中，最重要的是髓核細(xì)胞[5]。作為有免疫特權(quán)的重要死亡受體，F(xiàn)asL在諸多細(xì)胞或器官中均有表達(dá)，比如髓核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、免疫器官、眼睛中[5-7]。因此，假設(shè)Fas-FasL死亡復(fù)合物可能在維持椎間盤的免疫特權(quán)方面起作用。

本課題組根據(jù)十余年的臨床與試驗(yàn)研究，證實(shí)了補(bǔ)腎活血湯可有效改善椎間盤細(xì)胞狀態(tài)[8-9]，但其具體機(jī)制尚不清楚，探索并找到一種既經(jīng)濟(jì)又有效的治療方法就顯得重要及必要，且如何運(yùn)用中醫(yī)藥預(yù)防和減輕椎間盤退行性變是一個研究方向。故應(yīng)用以上機(jī)制證明腰痛癥狀，由此深入了解調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制，對防治此類疾病有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動物

52只SPF級12個月齡健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量（300±40） g，由湖南省中西結(jié)合醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行隨機(jī)分組。本研究經(jīng)湖南省中西結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，動物倫理批號：2021-0067。

1.2 ?主要試劑

兔Fas抗體、小鼠β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG均購自美國Proteintech公司（批號分別為13098-1-AP、66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2）；兔FasL抗體（英國Abcam公司，批號：ab231011）；PAGE膠促凝劑、PBS磷酸鹽粉劑、檸檬酸鈉粉劑均購自長沙艾碧維生物科技有限公司（貨號分別為AWB0068a、AWI0134b、AWI0207b）；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、微RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture、Trizol均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號分別為CW2569、CW2141、CW2601、15596026）；Masson染色試劑盒、番紅固綠染色試劑盒均購自上海未峰生物技術(shù)有限公司（貨號分別為AWI0253b、AWI0240a）；兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號分別為2127A0705、216180923）。

1.3 ?主要儀器

切片刀（德國萊卡公司，型號：M199）；切片機(jī)（浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號：YD-315）；包埋機(jī)（常州中威電子儀器有限公司，型號：BMJ-A）；生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號：BA210T）；臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）；轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司（型號分別為DYCZ-40D、DYY-2C）；生物樣品均質(zhì)儀（中國杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）；光學(xué)顯微鏡（北京普瑞賽司儀器有限公司，型號：BA410T）。

1.4 ?實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎活血湯出自《傷科大成·應(yīng)用諸方》，在研究團(tuán)隊(duì)臨床運(yùn)用過程中，根據(jù)患者情況、中藥質(zhì)量改變等，調(diào)整用藥及用量如下：熟地黃15 g，杜仲10 g，枸杞子10 g，補(bǔ)骨脂15 g，菟絲子10 g，當(dāng)歸10 g，沒藥10 g，酒萸肉10 g，肉蓯蓉10 g，獨(dú)活10 g，紅花6 g[8]。上述藥物均由湖南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供。將中藥材以清水浸泡30 min后，水煎煮2次，每次煎得藥液200 mL，合并藥液，冷卻后置于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏備用。在前期研究中已發(fā)現(xiàn)，高濃度補(bǔ)腎活血湯對大鼠椎間盤退行性變的治療效果更好，確定本研究生藥含量為1.66 g/mL[8]。根據(jù)人與動物體表面積折算[10]，人用劑量332 g/d，計(jì)算出大鼠等效劑量為28.98 g/（kg·d），200 g大鼠每日服用3.5 mL。

腰痹通膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號：18081309885，規(guī)格：0.42 g/粒），碾磨成粉，用純水配制成0.1 g/mL。根據(jù)人與動物體表面積折算[10]，人用劑量3.78 g/d，計(jì)算出大鼠等效劑量為0.34 g/（kg·d），200 g大鼠每日服用0.7 mL。

1.5 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 ?實(shí)驗(yàn)分組及造模 ?52只大鼠，按照體質(zhì)量進(jìn)行編號，按隨機(jī)數(shù)字表分為3組：空白組（10只）、假手術(shù)組（10只）、手術(shù)組（32只）。其中，手術(shù)組造模成功后隨機(jī)抽取2只檢驗(yàn)造模是否成功，之后隨機(jī)分成補(bǔ)腎活血湯組、腰痹通組、模型組，每組10只。

造模方法采用纖維環(huán)穿刺法[11-12]：實(shí)驗(yàn)大鼠在同樣環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，除空白組外，其余組以2%戊巴比妥鈉2 mL/kg腹腔注射麻醉。待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定，術(shù)區(qū)剃毛。在無菌條件下從右側(cè)后腹膜入路，切口從12肋下致髂嵴上緣4～5 cm，依次切開組織，顯露第2～6腰椎間盤節(jié)段。假手術(shù)組分離出椎間盤后，無須任何處理；其余手術(shù)組選擇16G穿刺針沿椎體右前側(cè)纖維環(huán)向椎間盤中心穿刺，深度限制在3～5 mm，留置5 s，術(shù)后逐層縫合創(chuàng)口。術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射青霉素以防感染，每只大鼠4萬U/d。

造模后隨機(jī)選取2只大鼠，取椎間盤組織，行HE染色，髓核脊索細(xì)胞變少，纖維軟骨被組織替代，纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙排列不整齊，表示造模成功[13]。

1.5.2 ?動物給藥 ?造模成功1周后，開始予以不同治療，根據(jù)人與動物體表面積換算公式計(jì)算出大鼠用藥劑量[10]?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型組每日生理鹽水10 mL/kg灌胃，補(bǔ)腎活血湯組每日28.98 g/kg補(bǔ)腎活血湯灌胃，腰痹通組每日0.34 g/kg腰痹通灌胃。

所有大鼠5 d測量1次體質(zhì)量，并按體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量，整個灌胃過程持續(xù)4周。

1.5.3 ?動物處理及指標(biāo)檢測 ?飼養(yǎng)4周后行脊椎脫臼法處死所有大鼠，解剖出第3～6腰椎間盤，清除所有多余組織，將干凈的椎間盤組織置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（1）Masson染色。將椎間盤組織烘干、脫水、固定、切片，滴加適量核染液以覆蓋整個組織，染色10～60 s，徹底沖洗后用PBS（pH 7.2～7.6）溶劑浸泡5～10 min，使細(xì)胞核返藍(lán)；甩干后滴加適量漿染液以覆蓋整個組織，染色2～5 min，沖洗；分色液分色30 s左右，棄去分色液；滴加適量復(fù)染液以覆蓋整個組織，染色3～8 min，用無水乙醇沖洗干凈；吹干后將玻片置于二甲苯10 min，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

（2）番紅固綠染色。將椎間盤組織烘干、脫水后，先將切片置于二甲苯中10 min，然后依次在100%、95%、85%、75%乙醇浸洗，每級放置5 min，蒸餾水沖洗；固綠染液染色約5 min，蒸餾水沖洗，1%醋酸清洗；番紅染約30 s，蒸餾水沖洗；吹干后將玻片置于二甲苯10 min，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

（3）免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry， IHC）分析。將椎間盤組織烘干、脫水后，先將切片置于二甲苯中10 min，然后依次在100%、95%、85%、75%乙醇浸洗，每級放置5 min，蒸餾水沖洗；將切片浸入0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）加熱，冷卻后用0.01 mol PBS（pH 7.2～7.6）洗滌3 min，共3次；加入1%高碘酸，PBS沖洗；滴加適當(dāng)稀釋的一抗（Fas、FasL）及50～100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG，孵化后沖洗；經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染后乙醇脫水；吹干后將玻片置于二甲苯10 min，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。陽性染色為黃色或棕黃色，深的可至褐色染色。顯微鏡下拍照后使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算積分光密度（integral optical density， IOD）值。

（4）Western blot檢測椎間盤組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平。取椎間盤組織，PBS洗滌后用RIPA裂解液進(jìn)行勻漿，BCA法測定蛋白濃度；提取上樣量，按照要求配制分離膠與濃縮膠后完成電泳。接著將蛋白條帶與NC膜及濾紙一同放入轉(zhuǎn)膜緩沖液完成轉(zhuǎn)膜，隨機(jī)在PBST中清洗；用1倍PBST配制5%脫脂奶粉，室溫封閉90 min；加入Fas抗體（1∶2000）、FasL抗體（1 μg/mL）、β-actin抗體（1∶5000），4 ℃孵育過夜。PBST清洗3次后，加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG抗體（1∶5000）和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶6000），室溫孵育90 min，PBST清洗，ECL顯色曝光并拍照記錄。

（5）RT-PCR檢測鼠椎間盤組織Fas、FasL mRNA表達(dá)水平。取椎間盤組織，利用Trizol提取組織總RNA，取約0.25 mg組織，加入液氮充分研磨，加1 mL Trizol混勻，混勻后室裂解5 min；加入200 μL三氯甲烷，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min；離心后取上層液相，轉(zhuǎn)移到新的離心管中；加入等體積的異丙醇，混勻靜置10 min；離心去上清，加入1 mL 75%乙醇（無菌DEPC處理水配制）洗滌沉淀；離心去上清，干燥后加入20～30 μL無菌無酶水溶解沉淀；紫外分光光度計(jì)測定濃度，測其吸光度值，并計(jì)算其濃度跟純度。以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA。利用SYBR法完成PCR檢測。引物序列詳見表1。

1.6 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件處理。計(jì)量資料用“ｘ±s”表示，所有數(shù)據(jù)都進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。多組間比較用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊時采用方差分析，方差不齊時用秩和檢驗(yàn)；兩變量間的關(guān)系用直線相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?各組大鼠椎間盤組織病理學(xué)變化

番紅固綠染色結(jié)果顯示，空白組、假手術(shù)組標(biāo)本細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞凋亡較少，其中，細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)完整、基質(zhì)充盈，膠原蛋白排列規(guī)整。模型組纖維環(huán)明顯碎裂或扭曲，纖維環(huán)與髓核間中斷，髓核中細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞核固縮，部分標(biāo)本呈現(xiàn)骨化、鈣化趨勢。經(jīng)過治療，補(bǔ)腎活血湯組和腰痹通組椎間盤細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)較模型組好轉(zhuǎn)，椎間盤纖維環(huán)輕度破裂，膠原蛋白排列欠規(guī)整，髓核與纖維環(huán)之間未見明顯斷裂，髓核細(xì)胞及空泡數(shù)量略有減少，髓核中基質(zhì)輕度凝結(jié)，且補(bǔ)腎活血湯組優(yōu)于腰痹通組。詳見圖1。

Masson染色結(jié)果顯示，正常椎間盤結(jié)構(gòu)完整，膠原蛋白排列有序。纖維環(huán)呈現(xiàn)為藍(lán)色，髓核細(xì)胞呈現(xiàn)為紅色或紅褐色，細(xì)胞質(zhì)亦為紅色，纖維環(huán)與髓核界限清晰。模型組髓核嚴(yán)重纖維化，細(xì)胞核碎裂明顯，纖維環(huán)與髓核之間斷層明顯，纖維環(huán)嚴(yán)重破裂，染色較深。經(jīng)過治療，補(bǔ)腎活血湯組和腰痹通組中膠原蛋白含量顯著增加，纖維環(huán)與髓核之間裂隙縮小，髓核中細(xì)胞形態(tài)較前改善，且補(bǔ)腎活血湯組優(yōu)于腰痹通組。詳見圖2。

2.2 ?各組大鼠椎間盤組織IHC分析

IHC染色結(jié)果顯示，空白組、假手術(shù)組未見明顯退行性變，在其髓核細(xì)胞胞漿未見黃色/棕黃色顆粒；手術(shù)組Fas、FasL表達(dá)陽性，其中，模型組髓核細(xì)胞胞漿內(nèi)聚集大量棕黃色顆粒，F(xiàn)as、FasL強(qiáng)陽性表達(dá)；補(bǔ)腎活血湯組在細(xì)胞胞漿中見有少量黃色顆粒，F(xiàn)as、FasL弱陽性表達(dá)；腰痹通組在細(xì)胞胞漿中可見棕黃色顆粒，F(xiàn)as、FasL陽性表達(dá)。詳見圖3—4。

與空白組比較，模型組Fas、FasL IOD值均明顯升高（P<0.01）。假手術(shù)組與空白組間Fas、FasL IOD值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎活血湯組、腰痹通組Fas、FasL IOD值均明顯降低（P<0.01）。與腰痹通組比較，補(bǔ)腎活血湯組Fas、FasL IOD值均明顯降低（P<0.01）。詳見表2。

2.3 ?各組大鼠椎間盤組織Fas、FasL蛋白表達(dá)情況

與空白組比較，模型組Fas、FasL蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P<0.01）。假手術(shù)組與空白組間Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎活血湯組、腰痹通組Fas、FasL蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P<0.01）。與腰痹通組比較，補(bǔ)腎活血湯組Fas、FasL蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P<0.01）。詳見表3、圖5。

2.4 ?各組大鼠椎間盤組織Fas、FasL mRNA表達(dá)情況

與空白組比較，模型組Fas、FasL mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P<0.01）。假手術(shù)組與空白組間Fas、FasL mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎活血湯組、腰痹通組Fas、FasL mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P<0.01）。與腰痹通組比較，補(bǔ)腎活血湯組Fas、FasL mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P<0.01）。詳見表4。

3 討論

腰椎間盤退行性變可引起患者出現(xiàn)多種臨床癥狀，其中，以腰痛為最主要癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生活水平[14]。因其癥狀重、難根治、易復(fù)發(fā)的特性，又易引起情緒焦慮情況。當(dāng)前對于腰椎間盤退行性變的治療方案相對局限，若采取手術(shù)治療容易引起相鄰椎體退行性變等其他并發(fā)癥，且我國此病發(fā)生率不斷攀升，采取合理、有效、經(jīng)濟(jì)的治療方式勢在必行。中醫(yī)藥治療腰椎間盤退行性變有著獨(dú)到的見解。諸多研究從臨床研究、基礎(chǔ)研究等各方面著手了解中醫(yī)藥治療腰椎間盤退行性變的作用機(jī)制，如減輕椎間盤炎癥因子的釋放[15]、調(diào)節(jié)自身免疫[16]、抑制細(xì)胞凋亡[17]等。

中醫(yī)學(xué)里并無腰椎間盤退行性變相關(guān)記載，椎間盤在中醫(yī)里屬“筋”的范疇。補(bǔ)腎活血湯兼具祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎、通絡(luò)止痛、補(bǔ)益氣血的功效，作為治療腰椎間盤退行性變的基礎(chǔ)方之一，臨證加減。方中獨(dú)活通絡(luò)止痛、祛風(fēng)除濕，熟地黃益腎填精，山茱萸、菟絲子補(bǔ)腎收澀，杜仲、補(bǔ)骨脂、枸杞子補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋骨，肉蓯蓉補(bǔ)腎陽、益精血，當(dāng)歸補(bǔ)益氣血，沒藥、紅花活血止痛。諸藥合用，唯先補(bǔ)腎，標(biāo)本兼顧。

補(bǔ)腎活血湯以補(bǔ)腎為主，輔以活血。研究發(fā)現(xiàn)，杜仲提取物杜仲多糖不僅能夠有效調(diào)控腰椎間盤炎癥因子和細(xì)胞因子的釋放，還能延緩其退行性變[18]。紅花則能有效促進(jìn)局部血液循環(huán)，減輕氧化應(yīng)激帶來的細(xì)胞損傷[19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯能有效改善局部微循環(huán)，促進(jìn)骨質(zhì)代謝，抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展，起到消除神經(jīng)根炎癥的作用，有效防治腰椎退行性變[8，20]。

研究指出，F(xiàn)asL可通過抑制凋亡信號的傳遞以調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞炎癥和衰老[21]，隨著椎間盤退行性變，F(xiàn)asL表達(dá)下降，從而降低FasL對椎間盤的保護(hù)作用[22]。同時有研究指出，F(xiàn)asL的表達(dá)水平也因個體基因決定，其凋亡誘導(dǎo)配體在不同人體髓核中表達(dá)水平也會有所不同[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，退行性變的椎間盤細(xì)胞中Fas、FasL蛋白表達(dá)水平明顯降低，番紅固綠染色及Masson染色觀察椎間盤病理學(xué)變化，可見椎間盤與纖維環(huán)界限模糊、纖維環(huán)排列紊亂且存在縫隙，髓核細(xì)胞聚集、皺縮、減少。IHC結(jié)果顯示退行性變的椎間盤細(xì)胞內(nèi)含有大量棕色顆粒。經(jīng)過中藥復(fù)方治療，大鼠髓核與纖維環(huán)之間未見明顯斷裂，髓核細(xì)胞及空泡數(shù)量減少，基質(zhì)趨于穩(wěn)定，染色淺且均勻，顯著提升椎間盤細(xì)胞中Fas、FasL蛋白表達(dá)水平，修復(fù)受損椎間盤組織，增加了椎間盤細(xì)胞活力水平，從而延緩細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明Fas/FasL信號通路與腰椎間盤退行性變中椎間盤細(xì)胞衰老有關(guān)，而補(bǔ)腎活血湯的應(yīng)用能有效保護(hù)椎間盤細(xì)胞，延緩椎間盤退行性變炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的衰老與凋亡。

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〔收稿日期〕2022-09-20

〔基金項(xiàng)目〕湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022JJ30025）；長沙市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（kq2202475）；湖南省引導(dǎo)基金課題（2021SK51008）。

〔第一作者〕王鎮(zhèn)遠(yuǎn)，男，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治脊柱與骨關(guān)節(jié)疾病。

〔通信作者〕*吳官保，男，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：yhywgb@126.com。