基于PPARγ信號通路探討安腦平?jīng)_方極化M2型小膠質(zhì)細(xì)胞減輕腦出血后神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制

張瑛 高曉峰 郭純 張宇星 周德生

〔摘要〕 目的 探討安腦平?jīng)_方極化M2型小膠質(zhì)細(xì)胞減輕腦出血（intracerebral hemorrhage， ICH）后神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制。方法 采用氯化血紅素干預(yù)BV2細(xì)胞模擬體外ICH模型。第一部分實驗分3組[對照組、模型組、安腦平?jīng)_方含藥血清組（A-HYXQ組）]，對照組為正常生長的BV2細(xì)胞，模型組及A-HYXQ組采用氯化血紅素干預(yù)BV2細(xì)胞，24 h后模型組給予10%空白血清干預(yù)，A-HYXQ組給予10% A-HYXQ干預(yù)。采用免疫熒光和Western blot法檢測Ym-1、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10， IL-10）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iductible nitric oxide synthase， iNOS）、白細(xì)胞介素-6（interleukin- 6， IL-6）表達(dá)量。第二部分實驗分為對照組、模型組、A-HYXQ組、A-HYXQ+GW9662組，對照組、模型組、A-HYXQ組處理同第一部分實驗，A-HYXQ+GW9662組在給予10% A-HYXQ前1 h給予10 μmol/L的GW9662，采用免疫熒光、Western blot和qRT-PCR法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ， PPARγ）、精氨酸酶-1（arginase-1， Arg-1）和白細(xì)胞介素-4（interleukin-4， IL-4）的表達(dá)量；采用Western blot、qRT-PCR和ELISA法檢測白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）。結(jié)果 第一部分：與對照組比較，模型組Ym-1和IL-10平均熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），而iNOS和IL-6平均熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)量明顯上升（P＜0.05）；與模型組相比，A-HYXQ組Ym-1和IL-10平均熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)量明顯上升（P＜0.05），而iNOS和IL-6平均熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）。第二部分：與對照組比較，模型組PPARγ、Arg-1和IL-4平均熒光強(qiáng)度、蛋白及mRNA表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），而TNF-α和IL-1β蛋白和上清液表達(dá)量明顯上升（P＜0.05）；與模型組相比，A-HYXQ組PPARγ、Arg-1和IL-4平均熒光強(qiáng)度、蛋白及mRNA表達(dá)量明顯上升（P＜0.05），而TNF-α和IL-1β蛋白和上清液表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）；與A-HYXQ組相比，A-HYXQ+GW9662組PPARγ、Arg-1和IL-4平均熒光強(qiáng)度、蛋白及mRNA表達(dá)量下降（P＜0.05），而TNF-α、IL-1β蛋白和上清液表達(dá)量上升（P＜0.05）。結(jié)論 安腦平?jīng)_方可能通過激活PPARγ信號通路極化M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，減輕氯化血紅素干預(yù)BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

〔關(guān)鍵詞〕 腦出血；神經(jīng)炎癥；小膠質(zhì)細(xì)胞；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；安腦平?jīng)_方

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.007

Mechanism of Annao Pingchong Formula on polarization of M2 microglia in alleviating neuroinflammation after intracerebral hemorrhage based on PPARγ signaling pathway

ZHANG Ying1， GAO Xiaofeng2， GUO Chun3， ZHANG Yuxing1， ZHOU Desheng2*

1. Graduate School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Department of Encephalopath （I）， The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Center for Medical Innovation， The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of Annao Pingchong Formula on polarization of M2 microglia in alleviating neuroinflammation after intracerebral hemorrhage （ICH）. Methods The ICH model in vitro was simulated by the intervention of hemin on BV2 cells. The first part of the experiment （Part Ⅰ） was divided into three groups： control group， model group， and serum containing Annao Pingchong Formula group （A-HYXQ group）. The control group was made up of BV2 cells with normal growth. The model group and A-HYXQ group were treated with hemin. Then after 24 h， the model group was treated with 10% blank serum， while the A-HYXQ group was treated with 10% A-HYXQ. Immunofluorescence and Western blot were used to detect the expression of Ym-1， interleukin-10 （IL-10）， inducible nitric oxide synthase （iNOS） and interleukin-6 （IL-6）. The second part （Part Ⅱ） of the experiment was divided into control group， model group， A-HYXQ group and A-HYXQ+GW9662 group. The treatment of the control， model and A-HYXQ groups was the same as that of Part Ⅰ. The A-HYXQ+GW9662 group was given GW9662 （10 μmol/L） 1 h before administration of 10% A-HYXQ. The expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ （PPAR γ）， arginase-1 （Arg-1） and interleukin-4 （IL-4） was detected by immunofluorescence， Western blot and qRT-PCR， while tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） were detected by Western blot， qRT-PCR and ELISA. Results Part Ⅰ： Compared with the control group， the average fluorescence intensity and protein expression of Ym-1 and IL-10 in the model group were reduced significantly （P<0.05）， while those of iNOS and IL-6 were significantly higher （P<0.05）; compared with the model group， the average fluorescence intensity and protein expression of Ym-1 and IL-10 in the A-HYXQ group were significantly higher （P<0.05）， while those of iNOS and IL-6 were reduced significantly （P<0.05）. Part Ⅱ： Compared with the control group， the average fluorescence intensity， protein and mRNA expression of PPARγ， Arg-1 and IL-4 in the model group were significantly lower （P<0.05）， however， the protein expression of TNF-α and IL-1β and the supernatant expression were significantly higher （P<0.05）; compared with the model group， the average fluorescence intensity， protein and mRNA expression of PPARγ， Arg-1 and IL-4 in the A-HYXQ group were significantly higher （P<0.05）， while the protein expression of TNF-α and IL-1β and the supernatant expression were reduced significantly （P<0.05）; compared with the A-HYXQ group， the average fluorescence intensity， protein and mRNA expression of PPARγ， Arg-1 and IL-4 in the A-HYXQ+GW9662 group were reduced significantly （P<0.05）， while the protein expression of TNF-α， IL-1β and the supernatant expression were significantly higher （P<0.05）. Conclusion Annao Pingchong Formula may activate PPARγ signaling pathway to polarize M2-microglia， thus reducing the inflammatory reaction of BV2 cells after hemin intervention.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 intracerebral hemorrhage; neuroinflammation; microglia; peroxisome proliferators-activated receptors-γ; Annao Pingchong Formula

腦出血（intracerebral hemorrhage， ICH）指非創(chuàng)傷性腦內(nèi)血管破裂，導(dǎo)致血液在腦實質(zhì)內(nèi)聚集，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點，給社會和家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)[1-4]。ICH后的腦損傷是通過血腫對周圍組織的直接壓迫效應(yīng)產(chǎn)生的原發(fā)性損傷和血腫及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的繼發(fā)性損傷，包括腦水腫、炎癥和血液裂解產(chǎn)物產(chǎn)生的生化毒性[5]。近年來，隨著微創(chuàng)技術(shù)及術(shù)后并發(fā)癥管理技術(shù)的不斷提高，ICH后的病死率有所下降，但是并未改善ICH患者的長期神經(jīng)功能預(yù)后[6]。因此，需重視干預(yù)ICH后的繼發(fā)性損傷。

神經(jīng)炎癥是ICH后繼發(fā)性損傷的主要驅(qū)動環(huán)節(jié)[7]，其在ICH后數(shù)小時內(nèi)即可發(fā)生，并可持續(xù)數(shù)周[8]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞是細(xì)胞因子、趨化因子、前列腺素和其他免疫調(diào)節(jié)分子的主要來源，所以，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可加重ICH后繼發(fā)性損傷，并參與隨后的腦修復(fù)過程[9]。根據(jù)小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)炎癥的作用效應(yīng)，可分為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞（促炎/細(xì)胞毒性機(jī)制）和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞（抗炎/神經(jīng)保護(hù)機(jī)制）[10]。調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型能促進(jìn)ICH后血腫和水腫的吸收，減輕繼發(fā)性腦損傷，促進(jìn)腦組織修復(fù)[11-12]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ， PPARγ）屬于核受體超家族，在抑制神經(jīng)炎癥、抗氧化、延緩神經(jīng)退行性變過程中均發(fā)揮著重要作用[13-14]。近年來，有研究表明，在ICH后通過激活PPARγ可極化M2型小膠質(zhì)細(xì)胞、加速血腫吸收和改善神經(jīng)功能預(yù)后[15]。

ICH屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇。肝腎虧虛為本，沖氣不斂，沖氣隨肝氣上逆是其主要病因病機(jī)之一，鎮(zhèn)肝息風(fēng)、平?jīng)_降逆是臨床治療ICH的基本思路[16]?！靶睘槿梭w津液化生、輸布、代謝提供終極通道和至微結(jié)構(gòu)[17]，在腦內(nèi)分布豐富，與血腦屏障有著密切的相關(guān)性[18]。因此，調(diào)節(jié)玄府功能為中醫(yī)治療ICH的新思路。安腦平?jīng)_方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病一科周德生教授團(tuán)隊依據(jù)ICH病因病機(jī)及玄府理論創(chuàng)制的治療中風(fēng)的科室協(xié)議方，已在臨床安全使用十余年。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，安腦平?jīng)_方可減輕腦出血患者的腦水腫，有利于患者的神經(jīng)功能康復(fù)[19]；實驗研究也證實，安腦平?jīng)_方可減少ICH大鼠血清白細(xì)胞介素-1β（interleukin， IL-1β）表達(dá)量[20]，改善ICH大鼠神經(jīng)功能缺損，抑制ICH后炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)功能[21]。但是安腦平?jīng)_方在ICH后通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型減輕神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制尚未被研究。因此，本研究將腦玄府理論與神經(jīng)炎癥相結(jié)合，旨在探討安腦平?jīng)_方含藥血清（A-HYXQ）調(diào)節(jié)炎癥的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料

1.1 ?動物

健康清潔級雄性大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。本次動物試驗獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：ZYFY20210427）。大鼠放置于清潔級實驗動物房飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，濕度45%～55%。

1.2 ?BV2細(xì)胞

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合實驗室細(xì)胞中心提供。

1.3 ?藥物

安腦平?jīng)_方組成：生龍骨（先煎）30 g，生牡蠣（先煎）30 g，川牛膝15 g，白蒺藜12 g，鉤藤（后下）12 g，澤瀉12 g，牡丹皮12 g，梔子12 g，黃芩12 g，白芍12 g，生大黃（后下）9 g，甘草6 g。購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房。經(jīng)兩次提取過濾及水浴濃縮后熬制成含生藥4.5 g/mL的溶液，無菌玻璃瓶分裝，貯存于4 ℃冰箱備用。PPARγ抑制劑GW9662購買于美國MedChemExpress公司（批號：HY-16578）。

1.4 ?主要試劑

一抗Ym-1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase， iNOS）、白細(xì)胞介素-6（interleukin， IL-6）（英國abcam公司，批號：ab192029、ab178945、ab233706）；β-actin、PPARγ、精氨酸酶-1（arginase-1， Arg-1）、白細(xì)胞介素-4（interleukin， IL-4）、白細(xì)胞介素-10（interleukin， IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin， IL-1β）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：20536-1-AP、16643-1-AP、16001-1-AP、17590-1-AP、60269-1-Ig、17590-1-AP、16806-1-AP）；超純總RNA提取試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司，批號：5003050）；IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號：J2923-B、J3056-B）；CCK-8試劑盒（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：BS350A）；氯化血紅素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：16009-13-5）；BV2專用細(xì)胞培養(yǎng)基（武漢普諾賽生物有限公司，批號：CM-0493）。

1.5 ?主要儀器

超靈敏多色熒光分析儀（美國ProteinSimple公司，型號：FluorChem R）；熒光定量PCR儀器（德國艾本德儀器有限公司，型號：Realplex2）；多功能酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號：Enspire）；激光掃描共聚焦顯微鏡（美國蔡司公司，型號：LSM800）。

2 方法

2.1 ?含藥血清制備

健康清潔雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后連續(xù)3 d予以安腦平?jīng)_方灌胃，每日2次。末次給藥后1 h腹主動脈采血，收集血清，空白血清采用相同動物，不給藥同法收集血清，0.22 μm濾膜過濾，56 ℃水浴滅活30 min，分裝于-20 ℃冰箱保存。

2.2 ?細(xì)胞培養(yǎng)

經(jīng)復(fù)蘇后，BV2細(xì)胞添加BV2細(xì)胞專用培養(yǎng)基，將其放置在37 ℃、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中。

2.3 ?細(xì)胞增殖測定

根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，將細(xì)胞按照5000個/孔鋪板至96孔板，處理完畢后，每孔加入10 μL CCK-8，放置在37 ℃、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中2 h后，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光值。

2.4 ?模型建立及分組

利用氯化血紅素干預(yù)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞模擬ICH體外模型[22]。實驗第一部分分為3組，分別為對照組、模型組、安腦平?jīng)_方含藥血清組（A-HYXQ組）；第二部分分為4組，分別為對照組、模型組、A-HYXQ組、A-HYXQ+GW9662組。細(xì)胞鋪板至6孔板或24孔板，造模方法為60 μmol/L的氯化血紅素干預(yù)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h。對照組為正常生長的BV2細(xì)胞，模型組造模24 h后給予10%空白血清，A-HYXQ組造模24 h后給予10% A-HYXQ，A-HYXQ+GW9662組造模24 h后，在給10% A-HYXQ前1 h給予10 μmol/L的GW9662。

2.5 ?免疫熒光

細(xì)胞鋪板至6孔板，經(jīng)干預(yù)后，予以4%多聚甲醛固定，5% Triton X-100通透，經(jīng)山羊血清封閉后，放置濕盒中4 ℃孵育一抗Ym-1（1∶200）、IL-10（1∶300）、iNOS（1∶250）、IL-6（1∶100）、PPARγ（1∶300）、Arg-1（1∶200）、IL-4（1∶300）過夜。第2天避光孵育對應(yīng)二抗Alexa Fluor■ 647（1∶500）、山羊抗小鼠IgG FITC（1∶400）50 min，滴加DAPI復(fù)染細(xì)胞核后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。每張圖片選取3個視野，每個視野選取5個細(xì)胞測量相應(yīng)抗體的平均熒光強(qiáng)度。

2.6 ?Western blot法

將細(xì)胞鋪至6孔板，干預(yù)后，提取總蛋白，測定蛋白濃度，配制10%分離膠，上樣后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST清洗3次，分別加入一抗Ym-1（1∶5000）、IL-10（1∶10 000）、iNOS（1∶1000）、IL-6（1∶1000）、PPARγ（1∶3000）、Arg-1（1∶1000）、IL-4（1∶2000）、TNF-α（1∶1500）、IL-1β（1∶1000）、β-actin（1∶8000），經(jīng)4 ℃冰箱孵育過夜，第2天加入相應(yīng)二抗山羊抗小鼠IgG HRP（1∶10 000）、山羊抗兔IgG HRP（1∶10 000），室溫?fù)u床孵育1 h，最后進(jìn)行顯色曝光，用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.7 ?qRT-PCR法

根據(jù)試劑盒說明書從6孔板中分離純化總RNA，合成cDNA后，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計算各組相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，詳見表1。

2.8 ?ELISA法

細(xì)胞鋪板至6孔板，經(jīng)干預(yù)后，收集上清液1 mL，經(jīng)高速冷凍離心機(jī)4 ℃，3000 r/min離心10 min（離心半徑15 cm），留取上清液至-80 ℃保存，按照ELISA試劑盒說明書操作。

2.9 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphyPad Prism 8對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性時，采用One-Way

ANOVA檢驗比較各組間差異，不符合則采用秩和檢驗，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?造模及給藥條件

3.1.1 ?氯化血紅素對BV2細(xì)胞存活率的影響 ?選取30、60、90 μmol/L氯化血紅素干預(yù)BV2細(xì)胞，結(jié)果顯示，與0 μmol/L比較，30、60、90 μmol/L氯化血紅素BV2細(xì)胞存活率均降低（P＜0.05）。考慮90 μmol/L氯化血紅素細(xì)胞存活率過低，因此，選擇60 μmol/L作為后續(xù)處理細(xì)胞的氯化血紅素濃度。詳見圖1A。

3.1.2 ?A-HYXQ對細(xì)胞存活率的影響 ?與對照組相比，模型組、A-HYXQ組（5%、10%、15%）細(xì)胞存活率下降（P＜0.05）；與模型組相比，A-HYXQ組（10%、15%）細(xì)胞存活率明顯上升（P＜0.05）；10%與15% A-HYXQ組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。因此，選擇10%濃度作為細(xì)胞后續(xù)處理的A-HYXQ濃度。詳見圖1B。

3.1.3 ?GW9662對BV2細(xì)胞存活率的影響 ?選取5、10、15 μmol/L的GW9662，在加入10% A-HYXQ前1 h干預(yù)BV2細(xì)胞。結(jié)果顯示，與0 μmol/L相比，10、15 μmol/L的GW9662可明顯減少BV2細(xì)胞存活率（P＜0.05）；10 μmol/L與15 μmol/L GW9662細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此，選擇10 μmol/L作為細(xì)胞后續(xù)處理的GW9662濃度。詳見圖1C。

3.2 ?各組Ym-1和IL-10平均熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)量比較

與對照組相比，模型組Ym-1和IL-10的平均熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05）；與模型組相比，A-HYXQ組的Ym-1和IL-10的平均熒光強(qiáng)度及蛋白量均顯著上升（P＜0.05）。詳見圖2—3。

3.3 ?各組IL-6和iNOS平均熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)量比較

與對照組相比，模型組的IL-6和iNOS平均熒光強(qiáng)度及蛋白量均明顯上升（P＜0.05）；與模型組相比，A-HYXQ組的IL-6和iNOS的平均熒光強(qiáng)度及蛋白量均顯著下降（P＜0.05）。詳見圖4—5。

3.4 ?各組PPARγ、Arg-1和IL-4平均熒光強(qiáng)度、蛋白及mRNA表達(dá)量比較

與對照組相比，模型組PPARγ、Arg-1和IL-4的平均熒光強(qiáng)度、蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05）；與模型組相比，A-HYXQ組PPARγ、Arg-1和IL-4的平均熒光強(qiáng)度、蛋白及mRNA表達(dá)量均顯著上升（P＜0.05）；與A-HYXQ組相比，A-HYXQ+GW9662組PPARγ、Arg-1和IL-4平均熒光強(qiáng)度、蛋白及mRNA表達(dá)量下降（P＜0.05）。詳見圖6—8。

3.5 ?各組TNF-α和IL-1β蛋白、mRNA、上清液含量比較

與對照組相比，模型組TNF-α和IL-1β蛋白、mRNA、上清液含量均明顯上升（P＜0.05）；與模型組相比，A-HYXQ組的TNF-α和IL-1β蛋白、mRNA、上清液含量均明顯下降（P＜0.05）；與A-HYXQ組相比，A-HYXQ+GW9662組TNF-α和IL-1β蛋白、mRNA、上清液含量上升（P＜0.05）。詳見圖9—11。

4 討論

ICH后血腫周圍繼發(fā)性神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致ICH神經(jīng)功能預(yù)后欠佳的主要原因之一，減輕ICH后神經(jīng)炎癥反應(yīng)可以改善ICH患者的功能預(yù)后[7]。ICH歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，根據(jù)沖脈及玄府理論創(chuàng)制的安腦平?jīng)_方具有潛攝沖脈、通調(diào)氣血的功效。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦損傷后最先被激活的膠質(zhì)細(xì)胞，其有M1和M2兩種表型[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，A-HYXQ可增加經(jīng)氯化血紅素?fù)p傷BV2細(xì)胞的Ym-1和IL-10表達(dá)、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型、減少炎癥因子iNOS和IL-6表達(dá)。PPARγ屬于核受體超家族，在ICH后可通過激活PPARγ信號通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型、加速血腫清除、減少神經(jīng)炎癥[23]。為證實A-HYXQ可從多途徑、多靶點極化M2小膠質(zhì)細(xì)胞，本研究選用其他M1及M2型小膠質(zhì)標(biāo)志物。研究結(jié)果證實，A-HYXQ可增加PPARγ、Arg-1和IL-10表達(dá)，同時減少IL-6和iNOS表達(dá)，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型，使其向M2型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，而且PPARγ抑制劑GW9662可部分消除A-HYXQ的保護(hù)效應(yīng)。因此，安腦平?jīng)_方可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型的變化，調(diào)節(jié)玄府開闔，保持血腦屏障的完整性，減少ICH后炎癥物質(zhì)的產(chǎn)生及滲入，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實安腦平?jīng)_方可從多靶點極化M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型、減輕神經(jīng)炎癥；并發(fā)現(xiàn)其保護(hù)效應(yīng)可能是通過激活PPARγ信號通路，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化而實現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

[1] PINHO J， COSTA A S， ARA■JO J M， et al. Intracerebral hemorrhage outcome： A comprehensive update[J]. Journal of the Neurological Sciences， 2019， 398： 54-66.

[2] WU S， WU B， LIU M， et al. Stroke in China： Advances and challenges in epidemiology， prevention， and management[J]. The Lancet Neurology， 2019， 18（4）： 394-405.

[3] VAN ASCH C J， LUITSE M J， RINKEL G J， et al. Incidence， case fatality， and functional outcome of intracerebral haemorrhage over time， according to age， sex， and ethnic origin： A systematic review and meta-analysis[J]. The Lancet Neurology， 2010， 9（2）： 167-176.

[4] GBD 2019 Stroke Collaborators. Global， regional， and national burden of stroke and its risk factors， 1990-2019： a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019[J]. Lancet Neurol， 2021， 20（10）： 795-820.

[5] WILKINSON D A， PANDEY A S， THOMPSON B G， et al. Injury mechanisms in acute intracerebral hemorrhage[J]. Neuropharmacology， 2018， 134（Pt B）： 240-248.

[6] CAMPBELL B， KHATRI P. Stroke[J]. The Lancet， 2020， 396（10244）： 129-142.

[7] XUE M， YONG V W. Neuroinflammation in intracerebral haemorrhage： Immunotherapies with potential for translation[J]. The Lancet Neurology， 2020， 19（12）： 1023-1032.

[8] BAI Q， XUE M Z， YONG V W. Microglia and macrophage phenotypes in intracerebral haemorrhage injury： Therapeutic opportunities[J]. Brain， 2020， 143（5）： 1297-1314.

[9] WANG J， DOR？魪 S. Inflammation after intracerebral hemorrhage[J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism， 2007， 27（5）： 894-908.

[10] TSCHOE C， BUSHNELL C D， DUNCAN P W， et al. Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage and potential therapeutic targets[J]. Journal of Stroke， 2020， 22（1）： 29-46.

[11] WANG J. Preclinical and clinical research on inflammation after intracerebral hemorrhage[J]. Progress in Neurobiology， 2010， 92（4）： 463-477.

[12] ZHANG Z， ZHANG Z， LU H， et al. Microglial polarization and inflammatory mediators after intracerebral hemorrhage[J]. Molecular Neurobiology， 2017， 54（3）： 1874-1886.

[13] SCHNEGG C I， ROBBINS M E. Neuroprotective mechanisms of PPARδ： Modulation of oxidative stress and inflammatory processes[J]. PPAR Research， 2011， 2011： 373560.

[14] SKERRETT R， MALM T， LANDRETH G. Nuclear receptors in neurodegenerative diseases[J]. Neurobiology of Disease， 2014， 72： 104-116.

[15] ZHUANG J F， PENG Y C， GU C， et al. Wogonin accelerates hematoma clearance and improves neurological outcome via the PPAR-γ pathway after intracerebral hemorrhage[J]. Translational Stroke Research， 2021， 12（4）： 660-675.

[16] 周德生，胡 ?華，楊 ?洋，等.沖脈理論與腦出血沖氣上逆病機(jī)特征之探討[J].遼寧中醫(yī)雜志，2013，40（11）：2184-2186.

[17] 須 ?冰，黃 ?芳，褚湘農(nóng).玄府理論及其臨床應(yīng)用探討[J].上海中醫(yī)藥雜志，2015，49（9）：7-9.

[18] 董 ?麗，李 ?波，白 ?雪，等.腦之玄府與血腦屏障的相關(guān)性[J].中醫(yī)雜志，2013，54（22）：1969-1971.

[19] 龍運(yùn)軍，吳兵兵，周德生，等.安腦平?jīng)_片治療基底核區(qū)腦出血36例臨床療效觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2018，16（6）： 798-800.

[20] XU J， CHEN Z Q， YU F， et al. IL-4/STAT6 signaling facilitates innate hematoma resolution and neurological recovery after hemorrhagic stroke in mice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2020， 117（51）： 32679-32690.

[21] 左玲敏.從P2X7R/NLRP3通路探討安腦平?jīng)_方對腦出血后炎癥反應(yīng)的影響[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2020.

[22] 周德生，李煦昀，陳 ?瑤，等.安腦平?jīng)_片聯(lián)合甘露醇注射液對大鼠腦出血后血腫周圍MMP-9及TIMP-1表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2013，22（7）：1113-1116.

[23] XU C R， CHEN H J， ZHOU S J， et al. Pharmacological activation of RXR-α promotes hematoma absorption via a PPAR-γ-dependent pathway after intracerebral hemorrhage[J]. Neuroscience Bulletin， 2021， 37（10）： 1412-1426.

〔收稿日期〕2022-07-07

〔基金項目〕國家自然科學(xué)基金項目（81874463）；中醫(yī)內(nèi)科重大疾病防治研究與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室開放基金（ZYNK201609）；湖南省科技廳科技創(chuàng)新平臺與人才計劃（2017SK4005）；湖南省重點研發(fā)計劃（2020SK2092）。

〔第一作者〕張 ?瑛，女，博士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治腦血管病。

〔通信作者〕*周德生，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：2478020529@qq.com。