玉米赤霉烯酮及其類似物殘留檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

王博文 王博

摘 要：玉米赤霉烯酮及其類似物是一種有害物質(zhì)，它們會(huì)對(duì)動(dòng)物的生殖功能和免疫機(jī)能產(chǎn)生抑制作用，從而直接或間接地影響動(dòng)物的健康，對(duì)畜牧業(yè)造成極大的危害。因此，開展玉米赤霉烯酮及其類似物的檢測(cè)研究非常必要。本文對(duì)目前玉米赤霉烯酮及其類似物的檢測(cè)方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，為未來(lái)研究玉米赤霉烯酮及其類似物多殘留檢測(cè)方法提供了重要的參考。

關(guān)鍵詞：玉米赤霉烯酮；毒性作用；檢測(cè)方法

Abstract： Zearalenone and its analogues are harmful substances that can inhibit the reproductive function and immune system of animals， directly or indirectly affecting their health and causing great damage to the livestock industry. Therefore， it is essential to conduct research on the detection of zearalenone and its analogues. This chapter provides a detailed introduction to the current detection methods for zearalenone and its analogues， providing important references for future research on multi-residue detection methods of zearalenone and its analogues.

Keywords： zearalenone; toxic effects; test methods

玉米赤霉烯酮是一種由鐮刀菌產(chǎn)生的生物毒素，目前已知的類似物至少有15種，其中常見的有5種，包括α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalenol，α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-Zearalenol，β-ZOL）、α-玉米赤霉醇（α-Zeranol，α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-Zearalenol，β-ZAL）和玉米赤霉酮（Zearalanone，ZAN），這些

毒素主要污染農(nóng)產(chǎn)品及其副產(chǎn)品，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品的可用性下降。食用了高劑量的玉米赤霉烯酮谷物和飼料會(huì)使懷孕母畜出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、胎兒吸收等現(xiàn)象，甚至可能導(dǎo)致癌癥[1]。因此，需要加大對(duì)玉米赤霉烯酮及其類似物檢測(cè)方法的研究進(jìn)度，以便能夠準(zhǔn)確檢測(cè)食品中是否存在這種毒素，并進(jìn)行精確測(cè)量，為飼料的安全提供保障，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。

1 理化檢測(cè)方法

玉米赤霉烯酮是一種天然白色結(jié)晶體，其分子式為C18H22O5，其中的烯酮基團(tuán)決定了其雌激素活性，根據(jù)其理化性質(zhì)，確定該類物質(zhì)的傳統(tǒng)理化檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜層析法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層層析法等[2]。

1.1 高效液相色譜層析法

高效液相色譜層析法是目前檢測(cè)食品中毒素殘留量常用的方法，玉米赤霉烯酮及其類似物具有熒光特性，因此高效液相色譜層析法能夠用于測(cè)定樣品中的玉米赤霉烯酮及其類似物的殘留量。高效液相色譜層析法通常包括提取樣品、凈化和濃縮樣品、熒光檢測(cè)以及外標(biāo)法定量等步驟，該檢測(cè)方法的樣品加標(biāo)回收率不低于88%，樣品變異系數(shù)不超過(guò)4.0%；玉米赤霉烯酮及其類似物檢測(cè)限在10～310 ng·kg-1[3]。盡管高效液相色譜層析法在檢測(cè)食品中毒素殘留量方面具有高靈敏度和高精度的優(yōu)點(diǎn)，但其使用受到了設(shè)備和技術(shù)的限制，導(dǎo)致了成本較高、周期長(zhǎng)和易產(chǎn)生交叉反應(yīng)和假陽(yáng)性等問題。由于對(duì)樣品中待測(cè)成分的純度要求較高，高效液相色譜層析法并不能滿足大批量樣品快速篩選的需要。

1.2 氣相色譜法

氣相色譜法是一種用于分離和分析混合物中化合物的分析技術(shù)。該技術(shù)將混合物中的化合物分離為單獨(dú)的成分，然后使用檢測(cè)器檢測(cè)這些成分。氣相色譜法檢測(cè)玉米赤霉烯酮的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、精確度高、專屬性強(qiáng)，但需要較長(zhǎng)的分析時(shí)間，同時(shí)在操作過(guò)程中需要注意避免樣品揮發(fā)和污染等問題。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法依據(jù)歐盟委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)2002/657/EC進(jìn)行驗(yàn)證，已經(jīng)用于動(dòng)物體內(nèi)激素類藥物殘留的檢測(cè)，而且可以同時(shí)對(duì)多種激素和毒素進(jìn)行檢測(cè)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可以測(cè)定牛肌肉組織中玉米赤霉烯酮?dú)埩?，該方法基于?液萃取和固相萃取技術(shù)具有高靈敏度。然而，該方法需要高端設(shè)備和專業(yè)人員操作，操作過(guò)程煩瑣且昂貴，對(duì)操作環(huán)境條件有嚴(yán)格要求，因此不適用于廣泛使用。

1.4 薄層層析法

薄層層析法是在玻璃板上均勻地涂抹適宜的固定相（即吸附劑、支持劑和固化劑），制備出優(yōu)質(zhì)的薄層板，再將待測(cè)試樣溶液點(diǎn)加在薄層板的一端，然后選用適合的溶劑將試樣均勻展開，從而使試樣成分分離，達(dá)到檢測(cè)目的。國(guó)內(nèi)外發(fā)布的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求均采用薄層色譜法。SCHAAFSMA等[4]采用薄層層析法對(duì)谷物中玉米赤霉烯酮的殘留量進(jìn)行了檢測(cè)，該方法的檢出限為200 ng·kg-1，回收率為84%，且排除了其他類似物的干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。然而，由于薄層層析法需要使用多種輔助試劑和儀器，操作復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，特異性和靈敏度不高，誤差較大，已無(wú)法滿足現(xiàn)代飼料安全檢測(cè)的要求，因此只在特殊情況下作為仲裁檢驗(yàn)使用。

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、膠體金免疫層析法、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析法等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法適用于批量檢測(cè)和普查，是一種準(zhǔn)確度和靈敏度并重，快捷簡(jiǎn)便且檢測(cè)成本低的檢測(cè)方法，對(duì)檢測(cè)人員的要求較低，被廣泛用于檢測(cè)各種物質(zhì)。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法包括直接ELISA、間接ELISA、阻斷ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA等。近年來(lái)，研究人員們開發(fā)了多種檢測(cè)糧食中玉米赤霉烯酮?dú)埩舻脑噭┖?。萬(wàn)宇平等[5]研發(fā)的ELISA試劑盒檢測(cè)限為93.5 μg·kg-1，線性范圍為50～405 μg·L-1，具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。王東等[6]研發(fā)的試劑盒的最低檢出濃度為0.5 ng·mL-1，樣品加標(biāo)回收率不低于70.0%，并且可以用于檢測(cè)玉米、小麥和高粱中的玉米赤霉烯酮?dú)埩袅?。這些試劑盒具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、加標(biāo)回收率高等優(yōu)點(diǎn)，可為飼料安全檢測(cè)提供有力支持。

2.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法是一種利用抗原和抗體結(jié)合反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的方法。它的工作原理是先將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體固定在金標(biāo)墊上，然后將待測(cè)樣品加入，通過(guò)毛細(xì)效應(yīng)使樣品中的抗原與抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，最后通過(guò)膠體金標(biāo)記顯色來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。王瑩等[7]采用膠體金免疫層析技術(shù)研發(fā)出一種免疫膠體金試紙條，可以快速測(cè)定糧食和糧食產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮?dú)埩袅浚撛嚰垪l的檢測(cè)限為4.7 μg·kg-1，定量限為13.9 μg·kg-1，線性范圍在14.5～500.0 μg·kg-1，相關(guān)系數(shù)為0.996 4。劉媛等[8]研發(fā)出一種用于快速檢測(cè)動(dòng)物尿液或水樣本中玉米赤霉烯酮?dú)埩袅康拿庖吣z體金試劑板，其檢測(cè)閾值為2.5 μg·mL-1，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需10 min。這些試紙條和試劑板都是用于玉米赤霉烯酮?dú)埩艨焖贆z測(cè)的有效工具，相對(duì)于其他檢測(cè)方法，膠體金免疫層析法具有特異性和靈敏性高、操作簡(jiǎn)便、成本低、結(jié)果能夠長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)，其唯一的缺點(diǎn)是不能直接定量目標(biāo)物質(zhì)。因此，膠體金免疫層析法適用于現(xiàn)場(chǎng)操作和樣本普查等應(yīng)用場(chǎng)景。

2.3 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)的主要原理是通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合，使熒光素標(biāo)記的抗原與細(xì)胞中的抗體特異性結(jié)合，以達(dá)到檢測(cè)目的。該方法廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)，還可以使用單克隆抗體來(lái)鑒定淋巴細(xì)胞的亞類。此檢測(cè)方法快速且靈敏度極高，交叉反應(yīng)率較低，回收率平均值高于90%。

2.3.1 直接熒光法

該方法是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，結(jié)合切片染色法，然后通過(guò)熒光顯微鏡觀察樣品，有熒光出現(xiàn)則代表該樣品內(nèi)存在抗原。這種方法可以用于免疫細(xì)胞的檢測(cè)。但是，該方法的缺點(diǎn)是不夠靈便、快捷，步驟復(fù)雜煩瑣。

2.3.2 間接熒光法

間接熒光法與直接熒光法相比，操作簡(jiǎn)單且具有更高的靈敏性。在間接熒光法中，第一抗體是不帶熒光標(biāo)記的，而第二抗體是帶熒光標(biāo)記的免疫球蛋白。第一抗體與待檢測(cè)細(xì)胞上的抗原結(jié)合，再加入帶熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體使之與第一抗體發(fā)生反應(yīng)，最終觀察熒光信號(hào)來(lái)確定抗原的存在，該方法對(duì)淋巴細(xì)胞亞類的檢測(cè)十分有效。

2.4 酶聯(lián)免疫分析法

該法吸附法和ELISA檢測(cè)方法的原理非常相似。它們都利用固相表面標(biāo)記抗原、抗原與抗體反應(yīng)等原理，根據(jù)顯色劑的深淺來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)通常使用酶標(biāo)記二抗辣根過(guò)氧化物，這因?yàn)槠渚哂锌梢暂^長(zhǎng)時(shí)間保存，不易受到干擾的特性。

3 其他方法

3.1 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是一種通過(guò)將合成的包被抗原與噬菌體抗體庫(kù)相結(jié)合，再經(jīng)過(guò)連續(xù)的負(fù)篩選、ELISA鑒定（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）、克隆和SDS-PAGE（電泳鑒定）分析等步驟，從而篩選出特異性玉米赤霉烯酮單鏈抗體的方法。這一技術(shù)的成功應(yīng)用為后續(xù)制備特異性抗體提供了重要基礎(chǔ)，為玉米赤霉烯酮的檢測(cè)和研究提供了新思路和方法。其中，噬菌體展示技術(shù)的核心是將待篩選的抗原表面展示在噬菌體的表面，從而能夠準(zhǔn)確篩選出與抗原特異性結(jié)合的噬菌體。

3.2 時(shí)間分辨熒光免疫法

COOPER等[9]采用時(shí)間分辨熒光免疫法分析樣品中的玉米赤霉烯酮?dú)埩袅?，與玉米赤霉烯酮試劑盒相比，時(shí)間分辨熒光免疫法可區(qū)分被鐮刀腐霉菌污染的牛尿樣品中的玉米赤霉烯酮的濫用，其檢測(cè)閾值為0.16 μg·kg-1，此法準(zhǔn)確性很高，可準(zhǔn)確定量玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度在2～5 ng·mL-1，甚至在很多的鐮刀腐霉菌屬毒素共存時(shí)，也不受干擾，能夠避免假陽(yáng)性。

3.3 受體結(jié)合分析法

體內(nèi)的受體蛋白可與樣本中殘留的同化激素產(chǎn)生特異性結(jié)合。STAN等[10]運(yùn)用牛子宮細(xì)胞液中的雌激素受體與組織中殘留的同化激素之間可產(chǎn)生特異性結(jié)合這一特性，對(duì)動(dòng)物組織中包括玉米赤霉烯酮在內(nèi)的7種不同雌激素類藥物進(jìn)行定性和定量測(cè)定，之后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)一步確證，得出檢測(cè)限為1～5 μg·L-1，這種檢測(cè)方法靈敏性高、特異性強(qiáng)并且結(jié)果可靠。

4 結(jié)語(yǔ)

玉米赤霉烯酮及其類似物是一種對(duì)動(dòng)物健康有潛在危害的毒素，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)發(fā)展，發(fā)展玉米赤霉烯酮及其類似物多殘留快檢技術(shù)成為當(dāng)下食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要工作。當(dāng)前，世界各國(guó)已經(jīng)發(fā)展出了多種理化和免疫學(xué)檢測(cè)方法，其中包括高效液相色譜層析法、薄層層析法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫親和柱-高效液相色譜法以及液譜和質(zhì)譜聯(lián)用法等。這些方法具有檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確度高、可靠性高等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地用于玉米赤霉烯酮的檢測(cè)和定量分析。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，玉米赤霉烯酮檢測(cè)技術(shù)也會(huì)得到更多的突破和進(jìn)展，從而更好地保障飼料安全和家畜家禽健康。

參考文獻(xiàn)

[1]張新，陸晶晶，王丹，等.玉米赤霉烯酮全抗原的合成及鑒定[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014，5（3）：791-795.

[2]GROMADZKA K，WASKIEWICZ A，CHELKOWSKI J.Zearalenone and its metabolites：occurrence， detection， toxicity and guidelines[J].World Mycotoxin J，2008，1（2）：209-220.

[3]張羽.糧食中玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法的研究進(jìn)展和展望[J].中國(guó)食品安全，2015，31（18）：69.

[4]SCHAAFSMA A W，NICOL R W，SAVARD M E，et al.Analysis of fusarium toxins in maize and wheat using thin layer chromatography[J].Mycopathologia，1998，14（22）：107-113.

[5]萬(wàn)宇平，韓黎，吳鵬，等.玉米赤霉烯酮?dú)埩魴z測(cè)ELISA試劑盒的研制[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（3）：659-663.

[6]王東，王剛，饒力群.農(nóng)產(chǎn)品中玉米赤霉醇ELISA檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，2（20）：6764-6766.

[7]王瑩，孫緒生，柳家鵬，等.玉米赤霉烯酮膠體金檢測(cè)試紙的研制及定量檢測(cè)的應(yīng)用[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2014，39（5）：28-31.

[8]劉媛，文孟棠，張霄，等.玉米赤霉醇特異性單克隆抗體及其膠體金檢測(cè)試紙的研制[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（6）：1101-1107.

[9]COOPER K M，RIBELRO L，ALVES P.Interlaboratory ring test of time-resolved fluoroimmunoassays for zeranol and alpha-zearalenol and comparison with zeranol test kits[J].Food Additives and Contaminants，2003，（20）：804-812.

[10]STAN H J，ABRAHAM B.Determination of residues of anabolicdrugs in meat by gas chro matography-mass spectroscopy[J].J Chromatogr，1980，195（2）：231-241.