烏頭湯對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細胞焦亡相關(guān)基因表達的影響

金靈璐 付長龍 涂海水 李瑩瑩 鄭志煌 仲衛(wèi)紅 李宇濤

【摘 要】目的：探討烏頭湯通過調(diào)控軟骨細胞炎性焦亡途徑延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的作用與機制。方法：將36只SD大鼠（雄性，8周齡）隨機分為空白對照組、模型對照組和烏頭湯組，每組12只。空白對照組不造模，模型對照組和烏頭湯組采用改良Hulth法造模。空白對照組與模型對照組采用生理鹽水（3 mg·kg-1·d-1）灌胃，烏頭湯組采用烏頭湯（生藥濃度4.2 g·mL-1）灌胃。干預(yù)8周后，麻醉狀態(tài)下摘取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨。采用Western blot檢測不同組別關(guān)節(jié)軟骨中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、白細胞介素（IL）-1β、IL-18的蛋白含量表達；采用Real-time PCR檢測不同組別關(guān)節(jié)軟骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的基因相對表達變化。結(jié)果：模型對照組和烏頭湯組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量與基因相對表達量均上調(diào)，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；烏頭湯組能夠下調(diào)NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量與基因相對表達量，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：烏頭湯可改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表達，抑制軟骨細胞焦亡，延緩軟骨退變。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎；烏頭湯；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；半胱氨酸蛋白酶-1；炎癥因子；關(guān)節(jié)軟骨；細胞焦亡；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect and mechanism of Wutou Tang（烏頭湯）on delaying?the cartilage degeneration of knee osteoarthritis by regulating the inflammatory pyrosis of chondrocytes.Methods：Thirty-six SD rats（male，eight weeks old）were randomly divided into a blank control group，a model control group and a Wutou Tang group，12 rats in each group.Except the blank control group，the other groups were established models by modified Hulth method.The blank control group and the model control group were gavaged with normal saline（3 mg·kg-1·d-1），while the Wutou Tang was gavaged with Wutou Tang（crude drug concentration 4.2 g·mL-1）.After 8 weeks of intervention，the rat knee joint cartilage was removed under anesthesia.Detection of protein content expressions of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 of articular cartilage was made in different groups by Western blot.Real-time PCR was used to detect the relative expressions of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 of articular cartilage in different groups.Results：The protein content and the relative expression of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 in the model control group and the Wutou Tang group were up-regulated，and the difference was statistically significant compared with the blank control group（P < 0.01）.In the Wutou Tang group，the protein content and the relative expression of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 can be down-regulated，and the difference was statistically significant compared with the model control group（P < 0.05）.Conclusion：Wutou Tang can improve the expressions of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 in cartilage of knee osteoarthritis rats，inhibit chondrocyte pyrosis and delay cartilage degeneration.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Wutou Tang（烏頭湯）;NLRP3;Caspase-1;inflammatory factors;articular cartilage;cell pyrosis;rats

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是常見的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)內(nèi)部炎癥與軟骨磨損導(dǎo)致的疼痛、僵硬、活動受限為主要特征。關(guān)節(jié)軟骨細胞正常生理狀態(tài)改變是導(dǎo)致軟骨退變或損傷、發(fā)生炎性反應(yīng)的重要原因［1］。目前，KOA的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，且致殘率較高，給患者家庭和社會造成極大的負擔(dān)，亟需尋找有效的治療方法。烏頭湯源于《金匱要略》，是治療痹證的經(jīng)方，由制川烏、麻黃、白芍、黃芪、炙甘草組成，功擅溫陽通絡(luò)、宣痹止痛，可用于治療寒濕痹阻所致的肢體關(guān)節(jié)疼痛、屈伸功能障礙等，臨床治療KOA效果顯著，但作用機制尚不明確［2］。近年研究證實，細胞焦亡作為一種新型細胞程序性死亡方式，與KOA的轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。細胞焦亡發(fā)生后，可導(dǎo)致軟骨周圍炎癥因子的釋放增加，并加劇軟骨的降解與退變［3］。半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）介導(dǎo)細胞炎性焦亡經(jīng)典通路， 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）在KOA疾病發(fā)生過程中被激活，參與軟骨病理代謝過程［4］。白細胞介素-1β（IL-1β）與IL-18是NLRP3經(jīng)典下游炎癥因子。因此，本研究從炎性焦亡途徑，探究烏頭湯對KOA大鼠軟骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表達的影響，探討其參與軟骨細胞炎性焦亡的作用機制，以期為臨床烏頭湯治療KOA提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠36只，2月齡，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK（閩）2019-0001。自由進食，適宜溫度，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2 實驗藥物 烏頭湯藥材由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院藥劑科提供，藥物組成：制川烏6 g，麻黃、芍藥、炙甘草、黃芪各9 g。注射用青霉素鈉160萬單位（江西科達動物藥業(yè)有限公司）。

1.3 實驗試劑及器材 SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號16J27C38，博士德生物工程有限公司）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號082020201116，碧云天生物技術(shù)有限公司）；GAPDH 兔源多克隆抗體（批號00098110，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；山羊抗兔IgG（H + L）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；HRP conjugate（批號20000258，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；RNA isolater? Total RNA Extraction Reagent試劑盒（批號7E490L0，諾唯贊生物技術(shù)有限公司）；ChamQ? SYBR? qPCR Master Mix試劑盒（批號7E412L0，諾唯贊生物技術(shù)有限公司）；HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+ g DNA wiper）試劑盒（批號7E572G1，Vazyme）；NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18引物（尚亞生物技術(shù)有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（型號GELDOC2000，美國Bio-Rad公司）；PCR儀（型號C1000 Touch，美國Bio-Rad公司）；熒光定量PCR儀（型號CFX96，美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 烏頭湯制備 純水浸泡制川烏30 min，先煎1 h，降低毒性；后加入其余藥材共同煎煮1 h，所得煎劑過濾制備濃縮劑（含生藥量為4.2 g·mL-1），室溫冷卻后，4 ℃保存。

2.2 分組及造模方法 8周齡雄性SD大鼠36只，按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組12只和造模組24只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用改良Hulth法造模，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。采用質(zhì)量分數(shù)為2%的戊巴比妥鈉（默克醫(yī)療）腹腔注射麻醉，離斷內(nèi)側(cè)副韌帶與前交叉韌帶，小心摘除內(nèi)側(cè)半月板，注意避免損傷軟骨面。術(shù)后160萬單位青霉素肌內(nèi)注射給藥預(yù)防感染，注意觀察大鼠失血及傷口愈合狀況。驅(qū)趕活動0.5 h·d-1，加重軟骨磨損。觀察大鼠活動步態(tài)異常及關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重程度，關(guān)節(jié)直徑增長，模型鼠狀態(tài)符合實驗要求，將造模組大鼠隨機分為烏頭湯組和模型對照組，每組12只。

2.3 給藥及取材 動物在統(tǒng)一飼養(yǎng)條件中進行干預(yù)?？瞻讓φ战M與模型對照組給予生理鹽水（3 mg·kg-1·d-1）灌胃，烏頭湯組予烏頭湯（生藥濃度4.2 g·mL-1）灌胃，劑量變化參照大鼠平均體質(zhì)量10 mg·kg-1·d-1計算。每周6次，共計8周。干預(yù)后摘取各組SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨，于液氮中保存。

2.4 Western Blot檢測 分組干預(yù)后的軟骨研磨后從勻漿中提取蛋白。定量后用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃環(huán)境中搖床震蕩過夜。PVDF膜使用TBS-T清洗并稀釋二抗孵育，室溫下孵育1 h；化學(xué)發(fā)光液1∶1避光配制，PVDF膜置于成像儀中，均勻滴加顯影液反應(yīng)1 min，避光操作顯影并分析。

2.5 Real-time PCR檢測 RNA提取操作嚴(yán)格按照RNA isolater? Total RNA Extraction Reagent試劑盒說明書進行，于通風(fēng)柜中冰上操作。所用試劑對人體有害，注意安全防護。4 ℃環(huán)境下離心機以12000 r·min-1離心20 min，離心半徑15 cm，離心后于管底部可見白色透明羽毛樣片狀RNA，乙醇洗滌后10 μL DEPC水溶解，分光光度計下檢測RNA濃度，并將其調(diào)整到適宜濃度。逆轉(zhuǎn)錄操作嚴(yán)格按照HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+ g DNA wiper）試劑盒說明書進行。各項引物合成序列見表1。反應(yīng)體系：ChamQ? SYBR? qPCR Master Mix 8.2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL。使用實時定量PCR檢測各組軟骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表達水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用正態(tài)性及方差齊性檢驗；組間比較采用t檢驗與非參數(shù)檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 Real-time PCR檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組軟骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA水平顯著升高（P < 0.01）；與模型對照組比較，烏頭湯組軟骨組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA水平顯著降低（P < 0.01）。見表2。

3.2 Western blot檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組軟骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平升高（P < 0.01）；與模型對照組比較，烏頭湯組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平下降（P < 0.01或P < 0.05）。見表3、圖1。

4 討 論

KOA是常見慢性退行性疾病，目前臨床中缺少有效的治療方法。軟骨細胞死亡、軟骨與軟骨下骨磨損是KOA發(fā)生的病理基礎(chǔ)［5］。KOA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇［6］。烏頭湯方以制川烏為君藥，溫經(jīng)散寒；白芍配伍甘草，緩急止痛；制川烏配伍黃芪、甘草，調(diào)和烏頭之毒；麻黃散寒宣痹。全方溫陽通絡(luò)除痹，標(biāo)本共治［7］。烏頭湯具有良好的抗炎作用，可減輕KOA疼痛［8］。

細胞焦亡是一種非溶解性、通常免疫沉默的程序性細胞死亡，主要通過Caspase-1介導(dǎo)的典型途徑和Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11介導(dǎo)的非典型途徑發(fā)揮作用。Caspase-1被多種炎癥小體（多蛋白信號復(fù)合物）激活后，炎癥小體聚集形成細胞內(nèi)大分子蛋白復(fù)合物，并將pro-Caspase-1轉(zhuǎn)化為活性形式，打破鈉和鉀的濃度梯度破壞質(zhì)膜的常規(guī)滲透屏障，導(dǎo)致滲透壓變化，超過細胞的代償能力，細胞膨脹、破裂，最終死亡［9］。研究表明，KOA中的軟骨降解、炎癥反應(yīng)等一系列病理改變均與細胞焦亡相關(guān)［10］。NLRP3炎癥小體的激活觸發(fā)促炎細胞因子釋放，引發(fā)焦亡，參與各種疾病的發(fā)生、發(fā)展，通過促發(fā)宿主細胞的炎性反應(yīng)達到消滅入侵細菌的目的［11］。在其他外源性入侵或環(huán)境脅迫等免疫激活因子存在時，NLRP3開放并與NLRP3和凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）的pyrin結(jié)構(gòu)域相互作用，隨著ASC的Caspase招募域（CARD）與pro-Caspase-1上的CARD域結(jié)合，最終導(dǎo)致局部或全身炎癥反應(yīng)［12］。研究表明，高水平的IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞的原礦化活性和骨骼的分解代謝作用，進而促進軟骨鈣化（骨化）和退化，參與軟骨下骨重塑的進展［13］；而IL-18由關(guān)節(jié)軟骨細胞產(chǎn)生，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，提高軟骨細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶含量，并生產(chǎn)多種促炎癥因子［14］。IL-1β和IL-18的釋放促進了多種炎性介質(zhì)和分解代謝因子的產(chǎn)生和釋放，這些炎性介質(zhì)和分解代謝因子可導(dǎo)致軟骨細胞功能障礙和細胞外基質(zhì)降解。研究表明，Caspase-1蛋白酶是IL-1β分泌、焦亡和介導(dǎo)免疫所必需的關(guān)鍵酶［15］。

為了闡明烏頭湯抑制軟骨細胞焦亡的作用機制，本研究通過烏頭湯干預(yù)治療后，檢測軟骨中炎癥指標(biāo)變化，結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，KOA大鼠軟骨組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白和基因表達升高，經(jīng)過烏頭湯干預(yù)后，KOA大鼠軟骨中的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白與mRNA表達水平顯著下降，提示烏頭湯可能是通過調(diào)節(jié)NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表達，參與調(diào)節(jié)軟骨細胞焦亡，抑制軟骨細胞炎性反應(yīng)，從而降低對軟骨細胞的損傷，保護關(guān)節(jié)軟骨，發(fā)揮對KOA的治療作用。本實驗將為進一步研究烏頭湯對KOA的治療機制及推廣應(yīng)用提供新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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收稿日期：2022-12-10；修回日期：2023-01-28

基金項目：福建省自然科學(xué)基金項目（2020J01736，2022J01374）；福建省衛(wèi)生健康中青年骨干人才培養(yǎng)項目（2021GGA062）

作者單位：1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建省康復(fù)技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350003；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003；5.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122

通信作者：李宇濤