煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染對(duì)煙草植株內(nèi)H2O2的誘導(dǎo)響應(yīng)

茹寧辰 姜珊 糾敏 汪倫記 任利娜

摘要 本研究采用DAB染色法定位檢測(cè)經(jīng)煙粉虱取食及其與中國番茄黃化曲葉病毒（TYLCCNV）共侵染后煙草葉片中H2O2的積累，并定量分析煙草葉片中H2O2的含量。DAB染色結(jié)果表明，2種處理的煙草葉片中均未檢測(cè)到H2O2積累；H2O2的定量分析結(jié)果表明，2種處理均可誘導(dǎo)煙草葉片中H2O2含量較對(duì)照顯著升高。在煙粉虱取食處理后0.5、1、3、6、12 h及1、3、5、7、9 d，煙草葉片中H2O2含量分別為對(duì)照的1.62、1.71、1.77、1.77、1.95、1.46、1.82、1.63、1.53和1.08倍；共侵染處理后煙草葉片中H2O2含量分別為對(duì)照的1.64、1.84、1.95、2.19、2.29、1.43、2.17、2.08、2.60和1.79倍。煙粉虱與TYLCCNV共侵染較煙粉虱取食可誘導(dǎo)煙草植株內(nèi)H2O2含量顯著升高。

關(guān)鍵詞 中國番茄黃化曲葉病毒；煙粉虱；煙草；活性氧；H2O2；誘導(dǎo)響應(yīng)

中圖分類號(hào) S572? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）06-0119-06

Abstract The accumulation of H2O2 in tobacco leaves was detected firstly by histochemical method after feeding of B. tabaci and its co-infection with TYLCCNV， and then the content of H2O2 in tobacco leaves was quantitatively analyzed. The results of DAB staining showed that no accumulation of H2O2 was detected in tobacco leaves after these two treatments. The quantitative analysis of H2O2 showed that the content of H2O2 in tobacco leaves increased significantly after these two treatments when compared with the control. At 0.5， 1， 3， 6， 12 h， and 1， 3， 5， 7， 9 d after feeding of B. tabaci， the contents of H2O2 in tobacco leaves were 1.62， 1.71， 1.77， 1.77， 1.95， 1.46， 1.82， 1.63， 1.53 and 1.08 times of that in the control leaves， respectively; while the contents of H2O2 in the tobacco leaves after co-infection with B. tabaci and TYLCCNV were 1.64， 1.84， 1.95， 2.19， 2.29， 1.43， 2.17， 2.08， 2.60 and 1.79 times of that in the control leaves， respectively. The co-infection of B. tabaci and TYLCCNV could induce a significant increase in the content of H2O2 in tobacco plants compared with the feeding of B. tabaci.

Keywords tomato yellow leaf curl China virus; Bemisia tabaci; tobacco; reactive oxygen species; H2O2; induction response

植物成功識(shí)別病原體侵染后會(huì)伴隨著細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生[1-2]。ROS在應(yīng)激反應(yīng)刺激下產(chǎn)生，通常被認(rèn)為是氧化應(yīng)激指示標(biāo)志物，可以在植物不同的細(xì)胞器中產(chǎn)生，如線粒體、葉綠體和過氧化物酶體，它們是植物光合作用和呼吸作用等不同代謝和生理過程的副產(chǎn)物[3]。生物脅迫在加速植物系統(tǒng)中ROS的產(chǎn)生方面起著關(guān)鍵作用[4]。能夠誘導(dǎo)氧化損傷的ROS包括單線態(tài)氧（1O2）、超氧化物（[O-2]），過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH·）、烷氧基（RO·）、過氧基（ROO·）、有機(jī)過氧化氫（ROOH）等[5]。起初，ROS被認(rèn)為是應(yīng)激代謝的有毒副產(chǎn)物，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，是細(xì)胞死亡的“殺手”[6]。最近的研究表明，ROS作為細(xì)胞響應(yīng)不同生物和非生物脅迫、發(fā)育過程和程序性細(xì)胞死亡的一類信號(hào)分子，在植物防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7]。

H2O2是最穩(wěn)定的活性氧，能以分子的形式穿透細(xì)胞膜，并能從其產(chǎn)生位置擴(kuò)散一定距離[8]。研究表明，H2O2在植物防御細(xì)菌和真菌侵染過程中起著重要作用[9]。目前，植物受到食草動(dòng)物攻擊后，蟲害組織中ROS的來源尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在鈴夜蛾屬（Helicoverpa）昆蟲侵染大豆期間，大豆內(nèi)的O2?和OH·含量增加[10]。也有研究認(rèn)為，來自Helicoverpa唾液腺的葡萄糖氧化酶等酶會(huì)產(chǎn)生H2O2，這可能有助于提高攻擊部位的ROS濃度[11]。

煙粉虱（Bemisia tabaci）屬半翅目（Hemiptera）、粉虱科（Aleyrodidae），作為重要的農(nóng)業(yè)害蟲及菜豆金黃花葉病毒屬病毒的傳播媒介，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12-13]。近年來，有關(guān)煙粉虱—雙生病毒—宿主植物三者互作的研究已有不少報(bào)道[14]，但目前為止，有關(guān)ROS在三者互作過程中的誘導(dǎo)響應(yīng)情況還未被報(bào)道，有關(guān)宿主植物如何通過調(diào)控自身體內(nèi)ROS來防御煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染也未見報(bào)道。因此，本研究以健康煙草為材料，利用DAB染色法檢測(cè)煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染不同時(shí)間后煙草葉片中H2O2的積累情況，然后采用H2O2定量分析試劑盒測(cè)定2種處理不同時(shí)間的煙草葉片內(nèi)H2O2的含量變化，分析2種處理對(duì)煙草葉片內(nèi)H2O2產(chǎn)生量的影響差異，探索煙草植株如何通過調(diào)控H2O2含量來防御煙粉虱取食及其與TYLCCNV的共侵染，進(jìn)而為研究煙粉虱—TYLCCNV—宿主植物三者之間的互作機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物。健康煙草（Nicotiana tabacum NC89）種子由河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院董鈞鋒老師提供。將種子播于育種盤中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待植株生長(zhǎng)至2～3片真葉移栽至小盆（直徑10 cm左右），每盆1株，定期澆植物營養(yǎng)液，待植株生長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)用于試驗(yàn)。

1.1.2 供試?yán)ハx。MED隱種煙粉虱（GenBank 登錄號(hào)：KY100013）是2015年9月采自河南省洛陽市的芝麻寄主并一直維持在健康煙草植株上的蟲群。飼養(yǎng)溫度為（26±1） ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，光照周期為L(zhǎng)∶D=16 h∶8 h。用RAPD-PCR方法不定期檢測(cè)煙粉虱種群純度，一般2～3代檢測(cè)1次。選取羽化后2 d內(nèi)的煙粉虱成蟲用于后續(xù)試驗(yàn)。攜帶TYLCCNV的煙粉虱獲取方法參考Jiu等[15]，即將收集的羽化后2 d內(nèi)的煙粉虱成蟲轉(zhuǎn)接于養(yǎng)蟲籠內(nèi)被TYLCCNV侵染的煙草毒株上，在毒株葉片上取食獲毒48 h即為攜帶TYLCCNV的煙粉虱。收集獲毒48 h后的成蟲個(gè)體用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.3 試劑及儀器。H2O2定量試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色液購于南京建成生物工程研究所；光照培養(yǎng)箱（PGX-330A-12H）購于寧波萊?？萍加邢薰?；JXFSTPRP-24全自動(dòng)樣品快速研磨器由上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn)；SMART生物顯微鏡、CDD TP510專業(yè)彩色相機(jī)及OPTPro顯微圖像分析軟件，均為重慶奧特光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 煙草植株的處理方法。選取3～4片真葉期長(zhǎng)勢(shì)較為一致的健康煙草植株，置于養(yǎng)蟲籠（120目網(wǎng)紗，規(guī)格大小為60 cm×60 cm，塔形，帳篷式）內(nèi)，分別用微蟲籠將攜帶和未攜帶TYLCCNV的煙粉虱成蟲轉(zhuǎn)接于煙草植株葉片上，每籠100頭，每株2籠，同時(shí)以夾有微蟲籠但未接蟲的煙草植株作對(duì)照。在試驗(yàn)處理0.5、1、3、6、12 h和1、3、5、7、9 d時(shí)，將用于取食處理的煙粉虱成蟲個(gè)體除去并收集植株，用于DAB染色和H2O2含量測(cè)定。

1.2.2 DAB染色法檢測(cè)煙草葉片內(nèi)的H2O2積累。采用組織化學(xué)方法檢測(cè)H2O2。該方法基于3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的氧化反應(yīng)，在H2O2存在下，二氨基聯(lián)苯胺被氧化為紅棕色[16-17]。DAB染色方法參考Kempema等[18]的方法并稍做修改。收集處理不同時(shí)間的煙草植株，用蒸餾水清洗2～3次，再用吸水紙輕輕吸干植株葉片及根部水分。用2.8 mmol/L DAB（pH 3.68）染色液浸沒整個(gè)煙草植株，避光真空滲透20 min，然后在37 ℃條件下避光培養(yǎng)5 h。去除DAB溶液，加入95%乙醇，沸水浴10～15 min除去色素，顯微鏡下觀察DAB染色結(jié)果并成像。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 定量分析不同處理后煙草葉片內(nèi)H2O2含量。煙草葉片內(nèi)H2O2的定量分析按照H2O2定量分析試劑盒說明書進(jìn)行。植株處理方法同1.2.2，迅速剪取處理的植株葉片，準(zhǔn)確稱取0.1 g，在低溫條件下快速勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液置于冰上，待測(cè)。定量分析方法參考任利娜[19]。H2O2濃度計(jì)算公式：樣品中H2O2濃度（?mol/L）=該樣品稀釋液的過氧化氫濃度×樣品稀釋倍數(shù)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件，組間分析采用One-Way ANOVA進(jìn)行兩兩比較得到相應(yīng)P值，檢驗(yàn)組間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理不同時(shí)間點(diǎn)煙草葉片內(nèi)H2O2的組織化學(xué)定位

不同處理的煙草葉片內(nèi)H2O2的組織化學(xué)定位結(jié)果如圖1和圖2所示。由圖1、2可知，在不同處理的0.5、1、3、6、12 h和1、3、5、7、9 d時(shí)，無處理對(duì)照葉片（圖1A和圖2E）、煙粉虱取食處理葉片（圖1B和圖2F）、煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理葉片（圖1C和圖2G）內(nèi)均未檢測(cè)到H2O2積累。

2.2 各處理不同時(shí)間點(diǎn)煙草植株中H2O2的定量分析

由表1可知，在處理的0.5、1、3、6和12 h時(shí)，煙粉虱取食均可誘發(fā)煙草植株內(nèi)H2O2含量較對(duì)照顯著升高，其H2O2含量分別是對(duì)照的1.62、1.71、1.77、1.77和1.95倍；煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理的煙草植株內(nèi)H2O2含量也均較對(duì)照顯著升高，其H2O2含量分別是對(duì)照的1.64、1.84、1.95、2.19和2.29倍。與煙粉虱取食處理相比較，煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理0.5和1 h時(shí)，H2O2含量在2種處理植株間差異不顯著，而在處理3、6和12 h時(shí)，H2O2含量在2種處理植株間的差異均達(dá)顯著水平（P<0.05），煙粉虱與TYLCCNV共侵染植株中H2O2含量分別是煙粉虱取食植株的1.10、1.23和1.18倍。

從表2可以看出，除處理后第9 d以外，煙粉虱取食均可誘發(fā)煙草植株內(nèi)H2O2含量較對(duì)照顯著升高，煙粉虱取食處理第1、3、5和7 d，植株內(nèi)H2O2的含量分別是對(duì)照的1.46、1.82、1.63和1.53倍；煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理均可誘發(fā)煙草植株內(nèi)H2O2含量較對(duì)照顯著升高，共侵染處理的第1、3、5、7和9 d，植株內(nèi)H2O2的含量分別是對(duì)照的1.43、2.17、2.08、2.60和1.79倍。與煙粉虱取食處理相比較，共侵染處理的第1 d，H2O2含量在2種處理植株間差異不顯著，而處理的第3、5、7和9 d，H2O2含量在2種處理植株間的差異均達(dá)顯著水平（P<0.05），共侵染處理植株內(nèi)H2O2含量分別是煙粉虱取食植株的1.19、1.28、1.69和1.66倍。

3 討論與結(jié)論

已有研究表明，H2O2在植物防御生物脅迫過程中起著重要作用，可通過DAB染色法觀察植物組織中H2O2的積累[18， 20-23]。在本研究中，煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染處理的煙草葉片內(nèi)均未檢測(cè)到局部H2O2積累（圖1、圖2），甚至在整個(gè)植株中也未檢測(cè)到H2O2積累。與本研究結(jié)果相似的是，Kempema等[18]在對(duì)擬南芥經(jīng)銀葉粉虱（B. tabaci type B）取食過程中的防御反應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，雖然經(jīng)銀葉粉虱若蟲取食危害21 d，在取食過程中也未檢測(cè)到擬南芥植株內(nèi)局部細(xì)胞死亡和H2O2積累，但作者認(rèn)為不能忽視在銀葉粉虱若蟲與擬南芥相互作用過程中，H2O2會(huì)在短暫或更早的時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生的可能性。Giovamini等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)黑穗蠅（Mayetiola destructor）幼蟲取食0、2、6、12、18、24、48、72或96 h的小麥（Triticum aestivum）組織中也均未檢測(cè)到黑穗蠅取食誘導(dǎo)的H2O2積累。有趣的是，在馬鈴薯蚜蟲（Macrosiphum euphorbiae）取食3、6和12 h的番茄葉片內(nèi)未觀察到H2O2積累，而在取食24 h的番茄小葉主脈和次脈處則檢測(cè)到H2O2積累[25]。由此可見，不同的植物被不同昆蟲取食后所誘導(dǎo)的H2O2積累情況有所差異。

DAB染色分析的敏感性可能有限[25]?；钚匝鯔z測(cè)困難與其壽命短以及活細(xì)胞清除活性氧的能力有關(guān)[4]。本研究雖然在所檢測(cè)的樣品中未成功檢測(cè)到H2O2的積累，但不能排除在不同處理過程中存在微氧化爆發(fā)的可能性，以及通過植物過氧化氫酶或存在于煙粉虱唾液中的過氧化物酶有效清除H2O2的情況。因此，進(jìn)一步對(duì)煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染處理后煙草葉片內(nèi)H2O2的含量進(jìn)行了定量分析。在H2O2的定量分析中發(fā)現(xiàn)，2種處理均誘發(fā)植株內(nèi)H2O2含量較對(duì)照顯著升高（表1，表2），植株內(nèi)H2O2含量的升高可能是煙草植株應(yīng)對(duì)煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染的一種防御反應(yīng)。該研究結(jié)果也解釋了先前報(bào)道中煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染的煙草植株內(nèi)一些氧化酶酶活性較對(duì)照顯著升高的一個(gè)重要原因[26]，通過氧化酶活性升高清除被侵染植株內(nèi)產(chǎn)生的過量H2O2，進(jìn)而降低ROS對(duì)植株自身造成傷害。

有關(guān)植物在病毒侵染后發(fā)生氧化爆發(fā)的現(xiàn)象已有詳細(xì)報(bào)道[27]。研究發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）侵染煙草后可導(dǎo)致煙草葉片壞死并伴隨O2-產(chǎn)生[28]。西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）侵染西葫蘆后誘導(dǎo)植株內(nèi)H2O2含量升高[29]。大豆黃化花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）侵染及水楊酸處理誘導(dǎo)大豆植株內(nèi)H2O2含量及多種氧化酶活性升高[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱與TYLCCNV共侵染處理較煙粉虱取食處理可誘導(dǎo)煙草葉片中產(chǎn)生更多的H2O2，這可能是共侵染處理可誘導(dǎo)煙草植株較煙粉虱取食植株產(chǎn)生更強(qiáng)防御反應(yīng)的結(jié)果。由此可見，植物在遭受病毒及其傳播媒介共侵染的過程中可誘發(fā)更多量的ROS以防御昆蟲的取食及病毒的侵染。宿主植物煙草可通過調(diào)控自身體內(nèi)H2O2的含量來防御煙粉虱取食及其與TYLCCNV共侵染。本研究為進(jìn)一步研究煙粉虱—雙生病毒—宿主植物3者互作過程中ROS的作用及調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：何 艷）

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金（31672036）。

作者簡(jiǎn)介 茹寧辰（1998—），男，河南濟(jì)源人，在讀碩士。研究方向：煙粉虱—雙生病毒—宿主植物三者互作機(jī)制。