豬肉中硝基呋喃代謝物液質(zhì)檢測(cè)法的優(yōu)化及衍生條件探究

黃立

摘 要：目的：對(duì)國(guó)標(biāo)法（GB/T 21311—2007）豬肉中硝基呋喃代謝物殘留量檢測(cè)方法進(jìn)行提取凈化步驟優(yōu)化并對(duì)其衍生劑體積和衍生時(shí)間進(jìn)行探究。方法：樣品經(jīng)衍生提取后，對(duì)比通過(guò)HyperSep Retain PEP小柱進(jìn)行凈化和國(guó)標(biāo)法凈化后圖譜的基線噪音及峰面積響應(yīng)情況；采用標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后峰面積的響應(yīng)值對(duì)衍生劑用量、衍生時(shí)間進(jìn)行探究。結(jié)果：衍生劑體積的量?jī)H對(duì)呋喃妥因代謝物和呋喃西林代謝物影響大，隨著衍生劑體積的增加，衍生效率增強(qiáng)；衍生時(shí)間4 h及以上即可滿足檢測(cè)要求；采用HyperSep Retain PEP小柱凈化基線相對(duì)較低平、噪音較低，方法檢出限為0.5 ?g·kg-1，加標(biāo)回收率為89.8%～109.6%，RSD為0.7%～2.0%。結(jié)論：該方法處理過(guò)程簡(jiǎn)潔、省時(shí)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)可靠，可實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肉中硝基呋喃代謝物的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：硝基呋喃代謝物；液質(zhì)聯(lián)用儀；衍生劑；凈化

Abstract： Objective： To optimize the extraction and purification procedure of the national standard method?（GB/T 21311—2007） for detecting residual nitrofuran metabolites in pork， and to explore the volume and derivation time of its derivatives. Method： After the samples were derived and extracted， the baseline noise and peak area responses of the atlas after purification by HyperSep Retain PEP column and national standard method were compared. The response value of peak area after derivative of standard solution was used to explore the amount of derivative and derivative time. Result： The derivatives volume only had a significant effect on furantoin metabolites and furacillin metabolites， and the derivatives efficiency increased with the increase of derivatives volume. The derivative time of 4 h and above can meet the detection requirements; HyperSep Retain PEP column was adopted with a relatively low purification baseline and low noise. The detection limit of the method was 0.5 ?g ·kg-1， the standard recoveries were 89.8%～109.6%， and RSDS were 0.7%～2.0%. Conclusion： The method is simple， time-saving， accurate and reliable， and can be used for the rapid detection of nitrofuran metabolites in pork.

Keywords： nitrofuran metabolites; liquid-mass spectrometer; derivatives; purification

硝基呋喃類抗生素包含呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮等，是一類對(duì)革蘭陽(yáng)性及陰性菌有一定抗菌作用的廣譜抗菌素，呈黃色粉末狀，無(wú)味或味微苦[1]。它們的作用機(jī)理為抑制微生物酶系統(tǒng)中乙酰輔酶A，干擾其糖類的代謝，從而起到抑菌作用。硝基呋喃類藥物不穩(wěn)定，容易生成代謝物，一般采取測(cè)定其代謝產(chǎn)物來(lái)測(cè)其殘留量[2]。本文主要采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中的4種硝基呋喃代謝物，用2-硝基苯甲醛與代謝產(chǎn)物發(fā)生衍生反應(yīng)，形成衍生物，再對(duì)衍生物的量進(jìn)行測(cè)定，從而間接測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

豬肉，超市購(gòu)買。

乙腈；乙酸乙酯；乙酸銨；鄰硝基苯甲醛；氫氧化鈉；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：乙腈中呋喃唑酮代謝物、甲醇中呋喃它酮代謝、甲醇中呋喃妥因代謝物、甲醇中呋喃西林代謝物，濃度均為100 ?g·mL-1，廠家均為壇墨質(zhì)檢有限公司。

AB SCIEX QTRAP4500型高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（ESI離子源、串聯(lián)四級(jí)桿/線性離子阱）；AL104電子天平，梅特勒上海滬粵科學(xué)儀器有限公司；Vortx-Genie 2T SI-0246振蕩器，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)海道夫公司；賽默飛離心機(jī)；HyperSep Retain PEP固相萃取小柱（60 mg，3 mL），賽默飛。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）4種硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取4種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.1 mL于10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為1 ?g·mL-1的4種硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存，有效期半年[3]。

（2）4種硝基呋喃代謝物混合中間標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確移取2.5 mL 4種硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為100 ng·mL-1的4種硝基呋喃代謝物混合中間標(biāo)準(zhǔn)液，-18 ℃避光保存，有效期3個(gè)月。

1.2.2 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m），或性能相當(dāng)者；流動(dòng)相：A為含0.2%甲酸水溶液，B為乙腈；洗脫程序見表1；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣簾氣：35 psi；電噴霧電壓：5 000 V；霧化氣壓力GAS1：50 psi；輔助氣GAS2：50 psi；碰撞器CAD：9 psi；離子源溫度：500 ℃；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓等信息見表2。

1.2.3 樣品處理

（1）制備及保存。在超市購(gòu)買1 kg豬里脊肉，取具有代表性的樣品500 g，用絞肉機(jī)充分絞碎并混合均勻，裝于樣品自封袋內(nèi)，冷凍避光保存，備用。

（2）樣品稱取及預(yù)洗。稱取2 g豬肉試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL 50%甲醇水溶液，渦旋振蕩10 min后，以6 000 r·min-1離心10 min，棄去清洗液[4]。

（3）水解及衍生。沉淀物中加入10 mL 0.2 mol·L-1鹽酸溶液，以1 000 r·min-1均質(zhì)1 min，然后按最終定容濃度加入適量混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入100 ?L 0.1 mol·L-1的2-硝基苯甲醛溶液，渦動(dòng)混合1 min，再振蕩30 min，置于37 ℃恒溫水浴鍋中避光衍生16 h。

（4）提取及凈化。冷卻衍生后樣品至室溫，加入2 mL 0.3 mol·L-1的磷酸鉀溶液，用2.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至（7.4±0.2）。

①國(guó)標(biāo)法：調(diào)好pH值后，加入10 mL乙酸乙酯，振蕩提取10 min，以10 000 r·min-1離心10 min，收集乙酸乙酯層。殘留物用0.1%甲酸水溶液溶解，再用3 mL乙腈飽和正己烷分兩次液液分配，去除脂肪。下層水相過(guò)0.2 ?m微孔濾膜后，裝于進(jìn)樣小瓶上機(jī)檢測(cè)（同時(shí)做空白樣品和空白）。②凈化柱凈化法：10 000 r·min-1、4 ℃冷凍離心5 min。依次用2×2.5 mL甲醇、2×2.5 mL超純水活化HyperSep Retain PEP小柱，將上清以1 mL·min-1的流速通過(guò)HyperSep Retain PEP小柱，10 mL超純水淋洗小柱，負(fù)壓抽干15 min，2.5 mL×2乙酸乙酯1 mL·min-1洗脫，收集，40 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL 0.1%甲酸水復(fù)溶，過(guò)0.22 ?m親水PTEE微孔濾膜，裝于進(jìn)樣小瓶上機(jī)檢測(cè)（同時(shí)做空白樣品和空白）。

2 結(jié)果與分析

2.1 國(guó)標(biāo)法+SPE法優(yōu)化提取凈化結(jié)果

本法將提取凈化步驟進(jìn)行優(yōu)化，樣品按1.2.3方法處理后上機(jī)分析。國(guó)標(biāo)法提取凈化與優(yōu)化后的SPE法提取凈化結(jié)果比較見圖1。

由圖1可知，經(jīng)HyperSep Retain PEP固相萃取柱提取凈化處理的樣品，基線相對(duì)較低平，噪音較弱，凈化效果比國(guó)標(biāo)法稍好，同時(shí)提取凈化過(guò)程簡(jiǎn)便，凈化時(shí)間有所縮短。

2.2 衍生劑體積的探究

分別以5 ng·mL-1、10 ng·mL-1兩個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為衍生對(duì)象，分別加入50 ?L、100 ?L、200 ?L、400 ?L、600 ?L、800 ?L、1 000 ?L不同體積的0.1 mol·L-1 2-硝基苯甲醛衍生劑，在37 ℃下避光水浴衍生16 h，然后按照方法進(jìn)行測(cè)定，峰面積的變化觀測(cè)結(jié)果見表3。

由表3可知，當(dāng)衍生劑濃度為0.1 mol·L-1，分別加5 ng·mL-1、10 ng·mL-1兩個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，不同體積衍生劑衍生下的呋喃唑酮代謝物和呋喃它酮代謝物峰面積無(wú)明顯變化規(guī)律，而呋喃妥因代謝物和呋喃西林代謝物的峰面積隨著衍生劑體積的增大而增大。由此可知，衍生劑體積的量對(duì)呋喃唑酮代謝物和呋喃它酮代謝物的衍生效率影響不大；對(duì)于呋喃妥因代謝物和呋喃西林代謝物來(lái)說(shuō)，隨著衍生劑體積的增加，峰面積逐漸增大，衍生效率增強(qiáng)。因此，若想提升呋喃妥因代謝物和呋喃西林代謝物檢測(cè)的靈敏度，可通過(guò)提高衍生劑2-硝基苯甲醛的量來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.3 不同衍生時(shí)間的探究

以10 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為衍生對(duì)象，加入100 ?L 0.1 mol·L-1的2-硝基苯甲醛溶液，在37 ℃下避光水浴衍生4 h、8 h和16 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做兩次平行，然后按方法進(jìn)行測(cè)定，峰面積的變化來(lái)觀測(cè)結(jié)果見表4。

由表4可知，當(dāng)衍生劑濃度為0.1 mol·L-1時(shí)，加入100 ?L衍生劑，衍生時(shí)間由4 h增到8 h，再到16 h時(shí)，隨時(shí)間的增加，4種硝基呋喃代謝物的峰面積未有顯著變化。表明無(wú)論4 h還是16 h都能達(dá)到檢測(cè)靈敏度要求，為節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)中可選擇4 h作為衍生時(shí)間[5]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍與方法檢出限

分別準(zhǔn)確移取混合中間標(biāo)準(zhǔn)液10 ?L、50 ?L、100 ?L、200 ?L、400 ?L、600 ?L、800 ?L、1 000 ?L于預(yù)洗好的空白樣品中，分別按照兩種凈化方法處理，配制成濃度分別為1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、60 ng·mL-1、80 ng·mL-1、100 ng·mL-1的基質(zhì)工作液，進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。國(guó)標(biāo)GB/T 21311—2007中4種硝基呋喃代謝物檢出限均為0.5 μg·kg-1，本實(shí)驗(yàn)的檢出限及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見表5。

由表5可知，4種硝基呋喃代謝物的儀器檢出限均為0.5 ?g·kg-1。當(dāng)濃度在1～100 ng·mL-1，4種硝基呋喃代謝物響應(yīng)相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996。

2.5 方法回收率及精密度

向已稱取并預(yù)洗好的空白樣品中添加0.5 ?g·kg-1、2.5 ?g·kg-1、5.0 ?g·kg-1 3個(gè)濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度做6個(gè)平行，與試樣相同處理過(guò)程[6]，得加標(biāo)樣液，吸取5 μL進(jìn)樣，測(cè)得其加標(biāo)樣液中待測(cè)組分的含量，回收率及精密度結(jié)果見表6。由表6可知，樣品的平均回收率在89.8%～109.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤2.0%。

3 結(jié)論

國(guó)標(biāo)法檢測(cè)動(dòng)物源食品中硝基呋喃代謝物在37 ℃下衍生16 h，乙酸乙酯、乙腈飽和正己烷反復(fù)提取凈化，檢測(cè)時(shí)間約為2 d，該法檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)；檢測(cè)過(guò)程較為繁雜。所以在標(biāo)準(zhǔn)方法上把提取凈化一步進(jìn)行了優(yōu)化，采用了HyperSep Retain PEP固相萃取柱提取凈化處理，基線相對(duì)較低平，噪聲較弱，且比國(guó)標(biāo)法GB/T 21311—2007的提取凈化過(guò)程簡(jiǎn)便，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。對(duì)衍生劑體積和衍生時(shí)間的探究表明衍生劑的用量對(duì)呋喃唑酮代謝物和呋喃它酮代謝物的衍生效率影響不大，對(duì)于呋喃妥因代謝物和呋喃西林代謝物來(lái)說(shuō)，隨著衍生劑體積的增加，峰面積增大，衍生效率增強(qiáng)。若要提升呋喃妥因代謝物和呋喃西林代謝物檢測(cè)的靈敏度，可通過(guò)提高2-硝基苯甲醛的量來(lái)實(shí)現(xiàn)；衍生時(shí)間無(wú)論4 h還是16 h都能達(dá)到檢測(cè)靈敏度要求，實(shí)驗(yàn)可選擇4 h作為衍生時(shí)間。經(jīng)優(yōu)化后的方法檢出限與國(guó)標(biāo)法一致為0.5 μg·kg-1，加標(biāo)回收率在89.8%～109.6%，RSD為0.7%～2.0%，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可應(yīng)用于豬肉中硝基呋喃代謝物的快速檢測(cè)，同時(shí)本方法也為硝基呋喃代謝物檢測(cè)中衍生時(shí)間及添加衍生劑的量提供了有效的指導(dǎo)。

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